Summary
यह प्रोटोकॉल एक पार्थेनोजेनेटिक कीट सरसों एफिड (लिपाफिस एरिसिमी (काल्ट)) के खिलाफ एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक अनुकूलित अलग-पत्ती बायोसेसे प्रणाली प्रस्तुत करता है। यह विधि पेट्री डिश प्रयोगों के दौरान डेटा संग्रह प्रक्रिया को रेखांकित करती है, जिससे शोधकर्ताओं को सरसों एफिड्स और अन्य पार्थेनोजेनेटिक कीड़ों के खिलाफ ईपीएफ की उग्रता को लगातार मापने में सक्षम बनाता है।
Abstract
मस्टर्ड एफिड (एल एरिसिमी) एक कीट है जो विभिन्न क्रूसिफेरस फसलों को संक्रमित करता है और पौधों के वायरस को प्रसारित करता है। पर्यावरण के अनुकूल कीट प्रबंधन प्राप्त करने के लिए, एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) इस कीट को नियंत्रित करने के लिए संभावित माइक्रोबियल नियंत्रण एजेंट हैं। इसलिए, क्षेत्र आवेदन से पहले पेट्री डिश स्थितियों के तहत ईपीएफ आइसोलेट्स की विषाणु स्क्रीनिंग आवश्यक है। हालांकि, मस्टर्ड एफिड एक पार्थेनोजेनेटिक कीट है, जिससे पेट्री डिश प्रयोगों के दौरान डेटा रिकॉर्ड करना मुश्किल हो जाता है। इस मुद्दे को हल करने के लिए अलग-पत्ती बायोएसेस के लिए एक संशोधित प्रणाली विकसित की गई थी, जिसमें एफिड्स पर कोनिडिया को टीका लगाने और बीजाणु निलंबन के बाद हवा में सुखाने की सुविधा प्रदान करके डूबने से रोकने के लिए माइक्रो-स्प्रेयर का उपयोग किया गया था। प्रणाली ने अवलोकन अवधि के दौरान उच्च सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखी, और पत्ती डिस्क दस दिनों से अधिक समय तक ताजा रही, जिससे एफिड्स के पार्थेनोजेनेटिक प्रजनन की अनुमति मिली। संतान निर्माण को रोकने के लिए, पेंटिंग ब्रश का उपयोग करके दैनिक हटाने की एक प्रक्रिया लागू की गई थी। यह प्रोटोकॉल सरसों एफिड्स या अन्य एफिड्स के खिलाफ ईपीएफ आइसोलेट्स की उग्रता का मूल्यांकन करने के लिए एक स्थिर प्रणाली प्रदर्शित करता है, जिससे एफिड नियंत्रण के लिए संभावित आइसोलेट्स का चयन संभव हो जाता है।
Introduction
सरसों एफिड (एल एरिसिमी) एक कुख्यात कीट है जो विभिन्न प्रकार की क्रूसिफेरस फसलों को प्रभावित करता है, जिससे महत्वपूर्णआर्थिक नुकसान होता है। जबकि एफिड संक्रमण से निपटने के लिए कई व्यवस्थित कीटनाशकों की सिफारिश की गई है, इन कीटनाशकों का लगातार उपयोग कीटनाशक प्रतिरोध 2,3 के बारे में चिंताओं को बढ़ाता है। इसलिए, पर्यावरण के अनुकूल कीट प्रबंधन के संदर्भ में, एंटोमोपैथोजेनिक कवक (ईपीएफ) एक उपयुक्त वैकल्पिक नियंत्रण रणनीति के रूप में काम कर सकता है। ईपीएफ एक कीट रोगज़नक़ है जिसमें उनके क्यूटिकल्स को भेदकर मेजबानों को संक्रमित करने की क्षमता होती है, जिससे यह एफिड्स और अन्य पौधे-चूसने वाले कीड़ों को नियंत्रित करने के लिए एक शक्तिशाली एजेंट बन जाताहै। इसके अलावा, ईपीएफ एक व्यवहार्य और टिकाऊ कीट प्रबंधन तकनीक साबित हुई है, जो पौधे रोगज़नक़ प्रतिरोध और पौधे केविकास को बढ़ावा देने जैसे लाभ प्रदान करती है।
ईपीएफ कीट-मिट्टी चारा के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता हैया क्षेत्र में कीट शवों से अलग किया जा सकता है। हालांकि, फंगल आइसोलेट्स के आगे उपयोग से पहले, रोगजनकता स्क्रीनिंग आवश्यक है। एफिड्स के खिलाफ ईपीएफ की प्रभावशीलता पर कई अध्ययन किए गए हैं, जो महत्वपूर्ण फसल कीट हैं जो गंभीर नुकसान पहुंचा सकते हैं 8,9. एफिड्स की विभिन्न प्रजातियों के बीच सरसों एफिड्स का परीक्षण ब्यूवेरिया एसपीपी, मेटारिज़ियम एसपीपी, लेकेनिसिलियम एसपीपी, पेसिलोमाइसेस एसपीपी, और यहां तक कि अल्टरनेरिया के कई उपभेदों के लिए संवेदनशीलता के लिए किया गया है, जिसे मुख्य रूप से सैप्रोफाइटिक और प्लांट रोगजनक कवक के रूप में जाना जाता है, लेकिन सरसों एफिड्स10,11,12 के खिलाफ कुछ घातक प्रभाव दिखाए हैं।
प्रयोगशाला स्थितियों के तहत एफिड्स के खिलाफ ईपीएफ की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, बायोएसेस को दो मुख्य भागों में विभाजित किया जा सकता है: टीकाकरण कक्ष और फंगल टीकाकरण। वर्तमान प्रोटोकॉल एक टीकाकरण कक्ष के निर्माण का वर्णन करता है, जहां एफिड्स को विभिन्न तरीकों का उपयोग करके बनाए रखा जा सकता है जैसे कि नम कपास में लिपटे पेटीओल के साथ एक उत्पादीकृत पत्ती, नम फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध पेट्री डिश के साथ एक एक्साइज्ड लीफ डिस्क, पॉट पौधों पर सीधा रखरखाव, या पेट्री डिश या कंटेनर10 के भीतर पानी के आगर में एम्बेडेड एक एक्साइज्ड लीफ डिस्क। 11,13. फंगल टीकाकरण के सामान्य तरीकों में कोनिडिया छिड़काव, एफिड को कोनिडिया निलंबन में विसर्जित करना, पत्ती को कोनिडिया निलंबन में डुबोना, और प्लांट एंडोफाइट टीकाकरण 11,14,15,16 शामिल हैं। जबकि विभिन्न टीकाकरण विधियां मौजूद हैं, बायोएसेस को क्षेत्र अनुप्रयोग स्थितियों का अनुकरण करना चाहिए। उदाहरण के लिए, पत्ती की डूबी हुई विधि12,17 के मामले में, ईपीएफ की दक्षता का मूल्यांकन किया जा सकता है, लेकिन चूंकि एफिड्स कवक से भरी पत्तियों को संक्रमित करते हैं, इसलिए एफिड का पृष्ठीय पक्ष, जो एक अधिमान्य प्रवेश स्थल है, आमतौर पर कवक के संपर्क में नहीं आता है।
प्रयोगशाला स्थितियों के तहत ईपीएफ के एफिसाइडल प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, यह प्रोटोकॉल कुछ संशोधनों के साथ योकोमी और गॉटवाल्ड18 द्वारा वर्णित अलग-पत्ती विधि का उपयोग करने का सुझाव देता है, इसके बाद माइक्रो-स्प्रेयर का उपयोग करके कोनिडिया टीकाकरण किया जाता है। यह विधि पानी की अतिरिक्त पुनःपूर्ति की आवश्यकता के बिना कम से कम सात दिनों के लिए बायोसेचैंबर में लगभग100% आर्द्रता बनाए रखती है। इसके अतिरिक्त, एफिड्स को एक सतह तक सीमित करने से कोनिडिया छिड़काव के लिए उनका जोखिम सुनिश्चित होता है और अवलोकनकी सुविधा मिलती है। हालांकि, टीकाकरण कक्ष के भीतर चलते समय एफिड्स उजागर आगर की सतह में फंस सकते हैं। इसके अलावा, सरसों एफिड्स के साथ पेट्री डिश प्रयोग में डेटा रिकॉर्ड करना, जो पार्थेनोजेनेटिक कीड़े हैं, उनके तेजी से विकास और प्रजनन के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। हटाए बिना टीका लगाए गए वयस्कों और उनकी संतान के बीच अंतर करना मुश्किल है। इस कदम के साथ आगे बढ़ने के विवरण का शायद ही कभी उल्लेख किया जाता है, और कुछ असंगत कारकों, जैसे कि पत्ती की खपत क्षेत्र, को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है।
यह प्रोटोकॉल मस्टर्ड एफिड्स के खिलाफ ईपीएफ आइसोलेट्स की उग्रता की जांच के लिए एक स्थिर प्रणाली को प्रदर्शित करता है, जिससे व्यापक ईपीएफ लाइब्रेरी से विभिन्न एफिड प्रजातियों के खिलाफ संभावित आइसोलेट्स का चयन किया जा सकता है। क्षेत्र-एकत्रित एफिड्स की पहचान की जा सकती है, और लगातार परिणामों के साथ एक आसान और व्यवहार्य पद्धति का उपयोग करके विभिन्न फंगल आइसोलेट्स के एफिसाइडल प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए सरसों एफिड्स की पर्याप्त प्रयोगशाला आबादी स्थापित की जा सकती है। एफिड्स ने कृषि पारिस्थितिकी प्रणालियों में तीव्र और बार-बार मानवजनित दबावों के जवाब में कई विकासवादी तंत्र विकसित किए हैं, जोखाद्य सुरक्षा के लिए चुनौतियां पेश करते हैं। इसलिए, इस वर्णित विधि को विभिन्न एफिड प्रजातियों के खिलाफ संभावित ईपीएफ आइसोलेट्स का मूल्यांकन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
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Protocol
नोट: पूर्ण फ़्लोचार्ट चित्र 1 में दिखाया गया है।
1. सरसों एफिड संग्रह और रखरखाव
- सरसों एफिड्स का संग्रह
- पत्तियों को पलटें और खेत में क्रूसिफेरस फसलों पर सरसों एफिड्स के संक्रमण की जांच करें।
- नमूना साइट की जानकारी (यानी, जीपीएस) और मेजबान संयंत्र (ओं) को रिकॉर्ड करें, और किसानों के साथ कीटनाशक अनुप्रयोगों के इतिहास की पुष्टि करें।
- खेत में क्रूसिफेरस फसलों से 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लगभग 50 सरसों एफिड्स इकट्ठा करने के लिए एक कीट एस्पिरेटर या एक बढ़िया पेंटिंग ब्रश (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें और नमूना 3 घंटे के भीतर प्रयोगशाला में लाएं।
- एक अस्थायी रखरखाव पेट्री डिश तैयार करें, जिसमें नीचे की ओर एक्साइज्ड क्रूसिफेरस पत्तियां और पानी की घुसपैठ वाले फिल्टर पेपर हों।
- अस्थायी रखरखाव पेट्री डिश पर पांच एफिड्स को कमरे के तापमान (25 ± 2 डिग्री सेल्सियस) के तहत 70% की सापेक्ष आर्द्रता और 12:12 घंटे (प्रकाश: अंधेरे) फोटोपीरियड के साथ 14 दिनों के लिए रखें ताकि यह पुष्टि हो सके कि एफिड आगे बढ़ने से पहले प्राकृतिक दुश्मन मुक्त है।
नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि क्षेत्र-एकत्रित एफिड्स प्राकृतिक दुश्मनों जैसे पैरासिटॉइड ततैया या एंटोमोपैथोजेनिक कवक से मुक्त हैं, आगे के पालन के साथ आगे बढ़ने से पहले इन जीवों की अनुपस्थिति की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है।
- सरसों एफिड्स का रखरखाव
नोट: सरसों एफिड्स को बनाए रखने के लिए, कीटनाशक मुक्त (बायोपेस्टिसाइड सहित) क्रूसिफेरस पत्तियों का उपयोग करें।- क्रूसिफेरस पत्तियों (लगभग 25 सेमी2) की एक स्थिर और पर्याप्त आपूर्ति प्रदान करें।
नोट: क्रूसिफेरस पत्तियों को या तो बाजार से प्राप्त करें या पौधों को विकसित करें। मस्टर्ड एफिड्स के दीर्घकालिक, बड़े पैमाने पर पालन से पहले, एक उपयुक्त क्रूसिफर खोजने के लिए कई अलग-अलग प्रकार के क्रूसिफर का परीक्षण किया जा सकता है। एक बार क्रूसिफेरस पत्ती की प्रजाति तय हो जाने के बाद, इसे न बदलें। इस अध्ययन में, 6-7-पत्ती चरण में कोमात्सुना (ब्रासिका रापा वर पर्विरिडिस) का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। इसके अतिरिक्त, 2-3 सबसे पुरानी पत्तियों का निपटान करें। - नीचे फिल्टर पेपर पूरी तरह से सूखने से पहले पानी डालें।
- प्रतिदिन सरसों एफिड्स के जनसंख्या घनत्व का निरीक्षण करें। 7 दिनों के बाद जनसंख्या 2-3 गुना तक बढ़ जानी चाहिए।
- जब एफिड्स की संख्या बढ़ जाती है, तो सरसों एफिड्स के साथ मूल रूप से उत्पादित पत्तियों को 4-6 छोटे टुकड़ों में काट लें और सरसों एफिड्स के साथ प्रत्येक छोटे पत्ते के टुकड़े को ताजा एक्साइज्ड पत्ती और पानी से घुसपैठ वाले फिल्टर पेपर के साथ एक पेट्री डिश में डाल दें।
- पेट्री डिश को 12:12 घंटे (प्रकाश: अंधेरे) फोटोपीरियड के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें और रोजाना सरसों एफिड्स के जनसंख्या घनत्व का निरीक्षण करें।
- मूल पत्तियों के सड़ने से पहले अधिकांश एफिड्स के ताजा उत्पादित पत्तियों में स्थानांतरित होने के बाद मूल उत्पादित पत्तियों को हटा दें।
- क्रूसिफेरस पत्तियों (लगभग 25 सेमी2) की एक स्थिर और पर्याप्त आपूर्ति प्रदान करें।
2. सरसों एफिड की आणविक पहचान
नोट: क्षेत्र-एकत्रित सरसों एफिड की प्रजातियों की पुष्टि करने के लिए, आणविक पहचान दो आणविक मार्करों का उपयोग करके की गई थी: लू एट अल.21 द्वारा डिजाइन किए गए अनुक्रम विशेषता प्रवर्धित क्षेत्र (एससीएआर) आधारित ए05एल, और सरसों एफिड के सरसों एफिड साइटोक्रोम ऑक्सीडेज सबयूनिट 1 (सीओआई) क्षेत्र।
- मस्टर्ड एफिड जीनोमिक डीएनए का निष्कर्षण।
- 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लगभग 50 एफिड्स इकट्ठा करें।
नोट: आणविक पहचान के लिए उपयोग किए जाने वाले एफिड्स एक एकल एफिड के वंशज होने चाहिए, और डीएनए निष्कर्षण के लिए विभिन्न चरणों को एक ही ट्यूब में भी पूल किया जा सकता है। - एफिड्स को पेलेट पेस्टल के साथ होमोजिनाइज़ करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए जीन-स्पिन जीनोमिक डीएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके डीएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- जीनोमिक डीएनए को 50 μL प्रीहीट न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ मिलाएं।
- 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लगभग 50 एफिड्स इकट्ठा करें।
- पीसीआर प्रवर्धन और डीएनए अनुक्रमण
- पीसीआर मास्टर मिक्स (2x) का उपयोग करके एफिड जीनोमिक डीएनए से लक्ष्य डीएनए अनुक्रमों को विभिन्नपीसीआर कार्यक्रमों के साथ प्राइमर जोड़े A05LEF/A05LER और LeCO1F/LeCO1R (तालिका 1) के साथ बढ़ाएं।
नोट: 20 μL की कुल मात्रा के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया 2 μL एफिड जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट, 1 μL आगे और 1 μL उलट प्राइमर, 10 μL पीसीआर मास्टर मिक्स ( सामग्री की तालिका देखें), और 6 μL ddH2O से बना है। - निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ थर्मल साइकलर ( सामग्री की तालिका देखें) में पीसीआर का प्रदर्शन करें: 5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 61 डिग्री सेल्सियस (ए05एलईएफ / ए05एलईआर के लिए) और 45 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस (लेसीओ 1 एफ / एलसीओ 1 आर के लिए), 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस का अंतिम विस्तार।
- मस्टर्ड एफिड की पहचान की पुष्टि करने के लिए 1% एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पाद का विश्लेषण करें (चित्रा 2)।
नोट: यदि प्राइमर जोड़ी A05LeF / A05LER सफलतापूर्वक डीएनए टुकड़े के सही आकार को बढ़ाती है, तो इसने मस्टर्ड एफिड21 के रूप में क्षेत्र-एकत्र एफिड की पहचान की है। प्राइमर जोड़े तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं। - निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जेल/पीसीआर किट का उपयोग करके सरसों एफिड सीओआई एम्पलीकॉन के पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें ( सामग्री की तालिका देखें), और वाणिज्यिक अनुक्रमण सेवा का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को अनुक्रमित करें।
- पीसीआर मास्टर मिक्स (2x) का उपयोग करके एफिड जीनोमिक डीएनए से लक्ष्य डीएनए अनुक्रमों को विभिन्नपीसीआर कार्यक्रमों के साथ प्राइमर जोड़े A05LEF/A05LER और LeCO1F/LeCO1R (तालिका 1) के साथ बढ़ाएं।
- अनुक्रम विश्लेषण
नोट: लू एट अल .21 के अनुसार, ए05एलई का डीएनए झुकना एक सरसों एफिड-विशिष्ट डीएनए टुकड़ा है; इसलिए, A05Le PCR उत्पाद को आगे अनुक्रमित करने की आवश्यकता नहीं है।- LeCO1 अनुक्रम प्राप्त करने के बाद क्रोमास सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) द्वारा पढ़ने की गुणवत्ता की जांच करें।
- फास्टा (या टीएक्सटी) फ़ाइल खोलकर और सीधे निम्न-गुणवत्ता वाले रीड को हटाकर अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम कम-गुणवत्ता वाले रीड को ट्रिम करें।
- डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का उपयोग करके छंटनी अनुक्रम को एनसीबीआई वेब ब्लास्ट (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) में सबमिट करें।
नोट: यदि A05Le और LeCO1 प्राइमर सेट के एम्प्लिकॉन आकार सही हैं, तो सैद्धांतिक रूप से, एनसीबीआई मानक डेटाबेस के खिलाफ अनुक्रम विस्फोट खोज को मस्टर्ड एफिड से मेल खाना चाहिए।
3. एंटोमोपैथोजेनिक कवक की तैयारी
नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त ईपीएफ तालिका 1 में सूचीबद्ध है।
- फंगल लाइब्रेरी से ईपीएफ की रिकवरी
- -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से संरक्षित कवक स्टॉक (30% ग्लिसरीन में निलंबित कोनिडिया) को पिघलाएं।
- कोनिडिया सस्पेंशन की एक छोटी मात्रा (लगभग 10 μL) को 6 सेमी 1/4 सबौरोड डेक्सट्रोज एगर (एसडीए) प्लेट (0.75 ग्राम सबौरेड डेक्सट्रोज शोरबा के साथ 1.5 ग्राम एगर प्रति 100 एमएल डीडीएच2ओ) में स्थानांतरित करें और इसे एक लैमिनर फ्लो हुड में सेल स्प्रेडर का उपयोग करके समान रूप से फैलाएं।
- पेट्री डिश को पैराफिन फिल्म के साथ सील करें, और इसे 10-14 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
- 1/4 एसडीए प्लेट पर फंगल द्रव्यमान को लकीर ें खींचकर और कोनिडिया22 की कटाई से पहले 10-14 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में कवक को इंजेक्ट करके फंगल आइसोलेट्स को फिर से कल्चर करें।
नोट: एफिड्स को संक्रमित करने से लगभग 10 दिन पहले फंगल कल्चर का उपयोग किया जाना चाहिए। 14 दिन से अधिक पुरानी ईपीएफ संस्कृति को विषाणु परीक्षण में उपयोग के लिए अनुशंसित नहीं किया जाता है।
- कोनिडिया निलंबन की तैयारी
- 1/4 एसडीए प्लेट पर 10-14 दिन पुरानी फंगल कल्चर से कोनिडिया को 2-3 एमएल 0.03% ट्वीन 80 जोड़ने के बाद लूप को इंजेक्ट करके खुरचें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- फंगल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
- उच्चतम गति पर घोल को भंवर करें, प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोनिडिया की संख्या की गणना करें, और कोनिडिया निलंबन की एकाग्रता को 108 कोनिडिया / एमएल तक समायोजित करें।
- कोनिडिया सस्पेंशन को यूवी-स्टरलाइज्ड माइक्रो-स्प्रेयर में स्थानांतरित करें।
नोट: कोनिडिया को स्थानांतरित करने से पहले इसे फिर से भंवर करें, क्योंकि कोनिडिया अवक्षेपित होने का खतरा है। माइक्रो-स्प्रेयर को उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए एक लामिनर प्रवाह हुड में पराबैंगनी विकिरण के संपर्क में लाया जाना चाहिए।
4. मस्टर्ड एफिड के खिलाफ विषाणु की जांच
- नए उभरे वयस्कों की तैयारी
- उसी उम्र की नई संतानों को पुन: उत्पन्न करने के लिए पेट्री डिश को पालने वाले पेट्री डिश से ताजी उत्पादित पत्तियों में एप्टेरस (बिना पंख के) और एलेट (पंखों वाले) वयस्कों को स्थानांतरित करें। भीड़भाड़ से बचने के लिए 24 घंटे के बाद वयस्कों को हटा दें और23,24 एलेटिड संतानों के उत्पादन को कम करें। आगे के प्रयोगों में केवल एप्टेरस वयस्कों का उपयोग किया जाएगा।
- प्रयोग के लिए एफिड्स के बीच आयु भिन्नता को रोकने के लिए 48 घंटे (चित्रा 3) के बाद वयस्क अवस्था में विकसित नहीं होने वाली संतानों को हटा दें। इसके अतिरिक्त, उत्तेजित वयस्कों को हटा दें।
- टीकाकरण कक्ष की तैयारी
नोट: पहले 9 सेमी व्यास के क्रूसिफेरस पत्ते तैयार करने की सिफारिश की जाती है, ताकि जमने से पहले पत्ती डिस्क को पानी के आगर में एम्बेडेड किया जा सके।- नल के पानी से क्रूसिफेरस पत्तियों को साफ करें, गंदगी और अवशेषों को हटा दें, और यदि कोई अन्य आर्थ्रोपोड मौजूद हो।
- पेपर टॉवल के साथ किसी भी अतिरिक्त पानी को पोंछ दें और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके क्रूसिफेरस पत्तियों की सतह पर किसी भी अन्य आर्थ्रोपोड की जांच करें। यदि मौजूद हो तो किसी भी आर्थ्रोपोड को हटा दें।
- 9 सेमी व्यास की पत्ती डिस्क को या तो पत्ती पर नीचे पेट्री डिश को सीधे मोल्ड के रूप में दबाकर या कैंची का उपयोग करके काट लें।
नोट: यदि पत्तियां व्यास में 9 सेमी से छोटी हैं, तो कुछ एक्साइज्ड पत्तियों को मिलाएं। - माइक्रोवेव का उपयोग करके 30 एमएल डीडीएच2ओ में 450 मिलीग्राम आगर (सामग्री की तालिका देखें) को गर्म और भंग करके प्रत्येक पेट्री डिश के लिए 1.5% पानी का आगर तैयार करें।
नोट: प्रयोग पैमाने के आधार पर 1.5% पानी के आगर की मात्रा को समायोजित किया जा सकता है। - लामिनर फ्लो हुड में जमने से पहले 9 सेमी पेट्री डिश में 1.5% पानी का 30 मिलीलीटर डालें, और फिर आगर को ~ 40 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने की प्रतीक्षा करें जब तक कि आगर की सतह अर्ध-ठोस न हो जाए।
नोट: जांचें कि पेट्री डिश को धीरे से क्षैतिज रूप से हिलाकर सतह अर्ध-ठोस है या नहीं। - लीफ डिस्क, अक्षीय सतह को पानी के आगर के ऊपर रखें, एगर में पत्ती डिस्क को एम्बेड करें।
नोट: अगर की सतह के जोखिम को कम से कम करें। - पानी का आगर पूरी तरह से जम जाने के बाद, पेट्री डिश के कवर को बंद कर दें।
नोट: जल वाष्पीकरण के लिए कवर खोलें यदि बहुत सारी बूंदें तुरंत कवर पर संघनित हो रही हैं। - पत्ती डिस्क पर 20 एपेटरस वयस्कों को रखें।
नोट: उनके मुंह के हिस्सों को नुकसान को रोकने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत काम करने की सिफारिश की जाती है।
- ईपीएफ टीकाकरण और अवलोकन।
- टीकाकरण कक्ष के कवर को खोलें और पत्ती डिस्क के लगभग 15 सेमी ऊपर से सीधे एफिड्स और लीफ डिस्क पर 0.3 एमएल कोनिडिया सस्पेंशन (चरण 3.2 से) स्प्रे करें।
नोट: छिड़काव से पहले कोनिडिया निलंबन को फिर से भंवर करें। प्रयोग से पहले छिड़काव क्षेत्रों का परीक्षण किया जाना चाहिए क्योंकि वे विभिन्न स्प्रेयर के बीच भिन्न हो सकते हैं। इस मामले में, 15 सेमी दूरी के साथ 0.3 एमएल की सिफारिश की जाती है। छिड़काव क्षेत्र को पूरे पत्ती डिस्क को कवर करना चाहिए, और कोनिडिया निलंबन की एक पतली परत को पत्ती डिस्क को कवर करना चाहिए। यदि बूंदें पत्ती पर खड़े पानी में मिल जाती हैं, तो टीकाकरण की मात्रा कम हो जानी चाहिए। टीकाकरण से पहले और विभिन्न आइसोलेट्स का उपयोग करने के बीच 70% इथेनॉल के साथ टेबल को साफ करें। - कोनिडिया सस्पेंशन के सूखने की प्रतीक्षा करें, और फिर सरसों एफिड्स को डूबने से रोकने के लिए कवर बंद करें।
नोट: प्रयोग के दौरान एफिड्स शायद ही कभी घूमते हैं; हालांकि, यह सुनिश्चित करना कि एफिड्स बच नहीं जाते हैं, अभी भी आवश्यक है। - उच्च सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ टीकाकरण कक्ष को सील करें और टीकाकरण कक्ष को 12:12 घंटे (प्रकाश: अंधेरे) फोटोअवधि के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
- 5 दिनों के लिए हर 12 घंटे में स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत मृत्यु दर की गणना करने के लिए टीकाकरण कक्ष के कवर को खोलें।
- एक पेपर टॉवल के साथ कवर का पालन करने वाले हनीड्यू को पोंछ दें और एक बढ़िया पेंटिंग ब्रश के साथ नए उभरे एफिड्स को हटा दें। हर 24 घंटे में नल के पानी से कवर को साफ करें।
नोट: वयस्क दीर्घायु के आधार पर एफिड्स की विभिन्न प्रजातियों के लिए अवलोकन अवधि भिन्न हो सकती है। - सफल टीकाकरण की पुष्टि करने के लिए माइकोसिस के लिए शव को पत्ती डिस्क पर रखें।
- टीकाकरण कक्ष के कवर को खोलें और पत्ती डिस्क के लगभग 15 सेमी ऊपर से सीधे एफिड्स और लीफ डिस्क पर 0.3 एमएल कोनिडिया सस्पेंशन (चरण 3.2 से) स्प्रे करें।
- कोनिडिया अंकुरण दर की पुष्टि
नोट: यह चरण वैकल्पिक है। कोनिडिया की गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए विषाणु स्क्रीनिंग करते समय कोनिडिया अंकुरण दर की पुष्टि करना।- तीन प्रतिकृतियों के लिए 1/4 एसडीए पर 5 μL कोनिडिया निलंबन की एक बूंद गिराएं।
- 18 घंटे के बाद, प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ अंकुरण दर की गणना करें। फंगल अंकुरण दर की पुष्टि करने के लिए एक बूंद में यादृच्छिक रूप से कम से कम 100 बीजाणुओं की गणना करें।
नोट: आम तौर पर, प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले आइसोलेट्स की अंकुरण दर 90% से अधिक होनी चाहिए।
5. चयनित ईपीएफ आइसोलेट्स का बायोसेसे
नोट: ईपीएफ आइसोलेट्स जो उच्च विषाणु दिखाते हैं, जिन्हें चरण 4 से चुना गया था, को कोनिडिया निलंबन की चार सांद्रता (104 से 107 कोनिडिया / एमएल तक) का उपयोग करके सरसों एफिड्स के खिलाफ एक बायोसेसे के अधीन किया गया था।
- कोनिडिया निलंबन की तैयारी
- चयनित ईपीएफ आइसोलेट्स को पुनर्प्राप्त करने के लिए चरण 3.1 दोहराएं।
- कोनिडिया निलंबन की चार सांद्रता तैयार करने के लिए चरण 3.2 दोहराएं, जिसमें 104, 105, 106, और 107 कोनिडिया / एमएल शामिल हैं।
- नए उभरे वयस्कों की तैयारी
- नए उभरे वयस्कों को तैयार करने के लिए चरण 4.1 दोहराएं।
- टीकाकरण कक्ष की तैयारी
- चरण 4.1 दोहराएँ। टीकाकरण कक्ष तैयार करने के लिए।
- ईपीएफ टीकाकरण और अवलोकन।
- चरण 4.3 दोहराएँ। क्रमशः कोनिडिया निलंबन की चार सांद्रता के साथ ईपीएफ टीकाकरण और अवलोकन करने के लिए।
6. सांख्यिकीय विश्लेषण
- सही मृत्यु दर की गणना
- एबॉट के फॉर्मूला25 का उपयोग करके सही मृत्यु दर की गणना करें, जैसा कि नीचे दिखाया गया है:
सही मृत्यु दर (%) = [(एमटी − एम सी) × 100%] / (100− एमसी)।
एमटी उपचार समूह की मृत्यु दर का प्रतिनिधित्व करता है, और एमसी नियंत्रण समूह की मृत्यु दर का प्रतिनिधित्व करता है।
नोट: नियंत्रण समूह की मृत्यु दर 20% से अधिक नहीं होनी चाहिए। - एसपीएसएस सॉफ्टवेयर प्लेटफॉर्म खोलें ( सामग्री की तालिका देखें), "उपचार" और "cor_mor" (सही मृत्यु दर का प्रतिनिधित्व करते हुए) सहित चर बनाएं, और एक ही समय में एक ही समय में विभिन्न आइसोलेट्स के टीकाकरण के लिए गणना किए गए परिणाम दर्ज करें।
- स्वतंत्र टी-टेस्ट विश्लेषण के लिए एसपीएसएस में विश्लेषण, साधनों और अनुपातों की तुलना, स्वतंत्र-नमूने टी परीक्षण का चयन करें।
- एसपीएसएस में, "ग्रुपिंग वैरिएबल" बॉक्स में इनपुट उपचार , और "टेस्ट वैरिएबल (एस)" में cor_mor । विभिन्न फंगल आइसोलेट्स द्वारा समूहों को परिभाषित करें। विश्लेषण करने के लिए OK दबाएँ ।
- एबॉट के फॉर्मूला25 का उपयोग करके सही मृत्यु दर की गणना करें, जैसा कि नीचे दिखाया गया है:
- औसत घातक समय (एलटी 50) और औसत घातक एकाग्रता (एलसी50) की गणना।
- एसपीएसएस खोलें, चर "कुल", "प्रतिक्रिया" और "अवधि"/"एकाग्रता" बनाएं, और रिकॉर्ड किए गए परिणाम को स्प्रेडशीट में इनपुट करें।
- एलटी50 और / या एलसी50 की गणना करने के लिए एसपीएसएस में विश्लेषण, प्रतिगमन, प्रोबिट का चयन करें।
नोट: यदि संचयी मृत्यु दर अंततः 50% से अधिक नहीं होती है, तो एलटी 50 और / या एलसी50 का अनुमान नहीं लगाया जा सकता है। - "कुल अवलोकन" बॉक्स में कुल इनपुट करें, "प्रतिक्रिया आवृत्ति" बॉक्स में प्रतिक्रिया , "कॉवरिएट (एस)" बॉक्स में अवधि / विश्लेषण करने के लिए OK दबाएँ ।
नोट: आम तौर पर, विकल्प दबाएं और "विषमता कारक के उपयोग के लिए महत्व स्तर" 0.05 पर सेट करें।
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Representative Results
प्रस्तुत फ्लोचार्ट क्षेत्र संग्रह से लेकर विषाणु स्क्रीनिंग तक सरसों एफिड्स की स्थिर स्थिति को दर्शाता है। क्षेत्र संग्रह से एफिड्स के रखरखाव ने पर्याप्त खाद्य आपूर्ति के साथ एफिड कॉलोनियों में स्थिर वृद्धि सुनिश्चित की। पीसीआर एम्प्लिकॉन आकार और लेसीओ 1 अनुक्रमण सहित आणविक मार्करों के उपयोग के माध्यम से क्षेत्र-एकत्र किए गए एफिड्स को सरसों एफिड्स के रूप में पुष्टि की गई थी। अलग-पत्ती विधि का उपयोग करके आयोजित विषाणु स्क्रीनिंग ने सरसों एफिड्स के लिए एक सुसंगत जीवित रहने की दर का खुलासा किया, जिसमें नियंत्रण समूह ने 85% जीवित रहने की दर का प्रदर्शन किया (चित्रा 4)।
विषाणु स्क्रीनिंग के दौरान, सीसी-एनसीयू-213 ने सबसे तेज एफिड-मारने की क्षमता का प्रदर्शन किया, जिसके परिणामस्वरूप क्रमशः 3 दिन और 4.5 दिनों में 50% और 90% मृत्यु दर (डीपीआई) हुई(चित्रा 4)। हालांकि, पांच बी बेसियाना आइसोलेट्स के बीच अलग-अलग एफिड-किलिंग क्षमताएं देखी गईं। बीबी-एनसीयू-141, -143, और -153 ने धीमी गति से एफिड-किलिंग क्षमताओं का प्रदर्शन किया, जिसमें 3 डी.पी.आई. पर केवल 5% मृत्यु दर थी, यहां तक कि 0.03% ट्वीन 80 छिड़काव या अन्य घातक कारकों के प्रभावों को छोड़कर (चित्रा 4)। इसलिए, नियंत्रण मृत्यु दर को सामान्य करने के लिए सही मृत्यु दर सूत्र का उपयोग किया गया था। पीएल-एनसीयू-152 (तालिका 3) को छोड़कर, सरसों एफिड्स के खिलाफ अधिकांश ईपीएफ आइसोलेट्स ने 5 दिन के भीतर 70% से अधिक मृत्यु दर प्रदर्शित की। इन ईपीएफ आइसोलेट्स में, बीबी-एनसीयू-286 ने 100% की उच्चतम मृत्यु दर का प्रदर्शन किया (तालिका 3)। इसके अतिरिक्त, ईपीएफ माइकोसिस को इस प्रणाली की प्रभावशीलता को दर्शाते हुए इस प्रणाली की प्रभावशीलता को दर्शाते हुए मेटारिज़ियम एसपीपी, ब्यूवेरिया एसपीपी, पर्प्यूरोसिलियम लिलासिनम और कॉर्डिसेप्स कैटेनियानुलता से संक्रमित सरसों एफिड्स के शवों पर देखा गया था।
विषाणु स्क्रीनिंग के परिणामों के आधार पर, दो ईपीएफ आइसोलेट्स, अर्थात् एमबी-एनसीयू-197 और सीसी-एनसीयू-213, जो तेजी से कीट-मारने की गतिविधि (क्रमशः 3 दिन प्रति वर्ष 40% और 50% मृत्यु दर) का प्रदर्शन करते हैं, को सरसों एफिड्स के खिलाफ बायोसेसे के लिए चुना गया था। परिणामों ने एमबी-एनसीयू-197 और सीसी-एनसीयू-213 के लिए 3 और 4 बजे 107 कोनिडिया/एमएल के टीकाकरण के साथ काफी अलग-अलग सही मृत्यु दर का प्रदर्शन किया (चित्रा 6)। एलटी 50 परख में, सीसी-एनसीयू-213 के 107 कोनिडिया / एमएल के साथ उपचार ने अन्य उपचारों की तुलना में काफी कम अवधि प्रदर्शित की (तालिका 4)। इसके अलावा, सीसी-एनसीयू-213 (9.32 × 104) का एलसी 50 मूल्य एमबी-एनसीयू-213 (2.30 × 10 5) की तुलना में कम था, यह दर्शाता है कि सीसी-एनसीयू-213 में सरसों एफिड्स के खिलाफ अधिक विषाणु है (तालिका 5)।
चित्र 1: सरसों एफिड्स के खिलाफ ईपीएफ विषाणु की जांच के लिए प्रायोगिक फ्लोचार्ट । (क) सरसों एफिड-पालन प्रणाली की स्थापना। (ख) कर्मचारी भविष्य निधि तैयार करना। (सी) फंगल टीकाकरण। (डी) सांख्यिकीय विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: सरसों एफिड जीनोमिक डीएनए का वैद्युतकणसंचलन ए05एलई और ले सीओ 1 प्राइमर सेट के साथ प्रवर्धित होता है। वैद्युतकणसंचलन 1% एगारोस जेल पर किया गया था। एम = 100 बीपी डीएनए सीढ़ी; बीपी = आधार जोड़े। लाल तारांकन पीसीआर प्रवर्धन के लक्ष्य मोड़ को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: एप्टेरस फोर्थ-इनस्टार अप्सरा और वयस्क मस्टर्ड एफिड्स के बीच अंतर। (ए) चौथी-इनस्टार अप्सरा। (बी) वयस्क। चौथी-इनस्टार अप्सरा के पिछले पैरों के टिबिया सफेद (लाल तीर से चिह्नित) होते हैं। नए उभरे एफिड्स को विषाणु परीक्षणों के दौरान ठीक ऊंट ब्रश द्वारा हटा दिया गया था। स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: 13 ईपीएफ का मृत्यु दर गर्मी मानचित्र अलग-पत्ती विधि के माध्यम से सरसों एफिड्स के खिलाफ अलग हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: 13 ईपीएफ आइसोलेट्स के फंगल माइकोसिस का अवलोकन। मेपे-एनसीयू -2 = मेटारिज़ियम पेम्फीगी; एमपी-एनसीयू-11 = मेटारिज़ियम पिंगहेन्स; एमबी = मेटारिज़ियम बाओशानेन्स; सीसी = कॉर्डिसेप्स कैटेनिएन्यूलाटा; बा = ब्यूवेरिया ऑस्ट्रेलिस; बीबी = ब्यूवेरियाबेसियाना; पीएल = पर्प्यूरोसिलियम लिलासिनम। स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: सरसों एफिड के खिलाफ फंगल आइसोलेट्स एमबी-एनसीयू-197 और सीसी-एनसीयू-213 की सही मृत्यु दर। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं। एमबी-एनसीयू-197 और सीसी-एनसीयू-213 की मृत्यु दर की तुलना एक ही समय में एक ही टीकाएकाग्रता के साथ स्वतंत्र टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी, और तारांकन चिह्न के साथ चिह्नित मृत्यु दर काफी भिन्न पाई गई (पी < 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| अलग | प्रजातियां | होस्ट या स्रोत* | स्थान |
| एमपी-एनसीयू-2 | मेटारिज़ियम पेम्फीगी | मिट्टी | यिलान |
| एमएल-एनसीयू-9 | मेटारिज़ियम लेपिडियट | मिट्टी | यिलान |
| एमपी-एनसीयू-11 | मेटारिज़ियम पिंगहेन्स | मिट्टी | यिलान |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | मिट्टी | ताइचुंग |
| बीबी-एनसीयू-141 | Beauveria bassiana | हाइपोथेनेमस हैम्पेई | चियायी |
| BB-NCHU-143 | Beauveria bassiana | हाइपोथेनेमस हैम्पेई | चियायी |
| पीएल-एनसीयू-152 | प्यूरोसिलियम लिलासिनम | टेसाराटोमा पैपिलोसा | चियायी |
| बीबी-एनसीयू-153 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferugineus | चुंगहुआ |
| बीबी-एनसीयू-157 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferugineus | चुंगहुआ |
| एमबी-एनसीयू-196 | मेटारिज़ियम बाओशेनेन्स | मिट्टी | ताइचुंग |
| एमबी-एनसीयू-197 | मेटारिज़ियम बाओशेनेन्स | मिट्टी | ताइचुंग |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | मिट्टी | ताइचुंग |
| बीबी-एनसीयू-286 | Beauveria bassiana | सेरामबिसाइड | ताइचुंग |
तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले ईपीएफ आइसोलेट्स।
| प्राइमर का नाम | अनुक्रम (5' - 3') | उत्पाद का आकार (bp) | संदर्भ | |
| A05Le | F-GGGTCTTGGATGGTGTGTG | 953 | लू एट अल। | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 | F-CTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | यह अध्ययन | |
| R-ACGTAGTGGAAATGAGCAAC | ||||
तालिका 2: सरसों एफिड्स की आणविक पहचान के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर जोड़े।
| अलग | प्रजातियां | सही मृत्यु दर (%) |
| एमपी-एनसीयू-2 | मेटारिज़ियम पेम्फीगी | 76.47 |
| एमएल-एनसीयू-9 | मेटारिज़ियम लेपिडियट | 82.35 |
| एमपी-एनसीयू-11 | मेटारिज़ियम पिंगहेन्स | 76.47 |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | 82.35 |
| बीबी-एनसीयू-141 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| BB-NCHU-143 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| पीएल-एनसीयू-152 | प्यूरोसिलियम लिलासिनम | 35.29 |
| बीबी-एनसीयू-153 | Beauveria bassiana | 82.35 |
| बीबी-एनसीयू-157 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| एमबी-एनसीयू-196 | मेटारिज़ियम बाओशेनेन्स | 76.47 |
| एमबी-एनसीयू-197 | मेटारिज़ियम बाओशेनेन्स | 88.24 |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 94.12 |
| बीबी-एनसीयू-286 | Beauveria bassiana | 100.00 |
तालिका 3: टीकाकरण के 5 दिनों के बाद 13 ईपीएफ आइसोलेट्स की सही मृत्यु दर सरसों एफिड्स के खिलाफ (डी.पी.आई.)।
| अलग | प्रजातियां | Conc.(conidia/mL) | N* | एलटी50 (दिन)† | 95% आत्मविश्वास सीमा | ढलान (एसई) | X2 (df) |
| एमबी-एनसीयू-197 | मेटारिज़ियम बाओशेनेन्स | 104 | 60 | 3.816 a | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105 | 60 | 3.112 bd | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.908 b | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.549 c | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 104 | 60 | 3.948 a | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105 | 60 | 3.237 d | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.414 c | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 e | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| * देखे गए कीड़ों की संख्या। | |||||||
| †विभिन्न अक्षरों के साथ चिह्नित एलटी 50 मूल्यों को काफी अलग माना जाता था क्योंकि उनकी 95% आत्मविश्वास सीमाएं ओवरलैप नहीं होती थीं। | |||||||
| पियरसन के भलाई-ऑफ-फिट परीक्षण में एक्स2, ची-स्क्वायर मूल्य; डीएफ, स्वतंत्रता की डिग्री | |||||||
तालिका 4: फंगल के एलटी50 मान विभिन्न कोनिडिया सांद्रता के तहत सरसों एफिड्स के खिलाफ एमबी-एनसीयू-197 और सीसी-एनसीयू-213 को अलग करते हैं। * देखे गए कीड़ों की संख्या। †एलटी50 मूल्यों को विभिन्न अक्षरों के साथ चिह्नित किया गया था क्योंकि उनकी 95% आत्मविश्वास सीमाएं ओवरलैप नहीं थीं। पियरसन के भलाई-ऑफ-फिट परीक्षण में एक्स2, ची-स्क्वायर मूल्य; डीएफ, स्वतंत्रता की डिग्री।
| अलग | प्रजातियां | N* | एलसी50 (कोनिडिया / एमएल)† | 95% आत्मविश्वास सीमा | Slpoe (SE) | X2 (df) |
| एमबी-एनसीयू-197 | मेटारिज़ियम बाओशेनेन्स | 240 | 2.30 × 105 a | 8.63 × 104–5.70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| Cc-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 240 | 9.32 × 104 a | 4.97 × 104–1.62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| * देखे गए कीड़ों की संख्या। | ||||||
| †विभिन्न अक्षरों के साथ चिह्नित एलसी 50 मूल्यों को काफी अलग माना जाता था क्योंकि उनकी 95% आत्मविश्वास सीमाएं ओवरलैप नहीं होती थीं। | ||||||
| पियरसन के भलाई-ऑफ-फिट परीक्षण में एक्स2, ची-स्क्वायर मूल्य; डीएफ, स्वतंत्रता की डिग्री | ||||||
तालिका 5: सरसों एफिड्स के खिलाफ फंगल आइसोलेट्स एमबी-एनसीयू-197 और सीसी-एनसीयू-213 के एलसी50 मान। * देखे गए कीड़ों की संख्या। †एलसी50 मानों को विभिन्न अक्षरों के साथ चिह्नित किया गया था क्योंकि उनकी 95% आत्मविश्वास सीमाएं ओवरलैप नहीं हुई थीं। पियरसन के भलाई-ऑफ-फिट परीक्षण में एक्स2, ची-स्क्वायर मूल्य; डीएफ, स्वतंत्रता की डिग्री।
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Discussion
क्रूसिफर्स, सब्जियों का एक समूह, अक्सर कई एफिड प्रजातियों से संक्रमित होता है, जिसमें मस्टर्ड एफिड (एल एरिसिमी) और गोभी एफिड (ब्रेविकोरिन ब्रासिका) 26 शामिल हैं। ताइवान27 में दोनों प्रजातियों की सूचना दी गई है, और उनके लिए संग्रह स्थल पर सह-अस्तित्व संभव है। निकटता से संबंधित एफिड प्रजातियों को अलग करने के लिए, इस अध्ययन ने मल्टीप्लेक्स प्राइमर सेट21 का उपयोग करके एक आणविक पहचान तकनीक का उपयोग किया। मस्टर्ड एफिड सीओआई जीन टुकड़े से एक आणविक मार्कर डिजाइन करके, हमने सफलतापूर्वक मस्टर्ड एफिड की पहचान की, इस प्रकारइस उद्देश्य के लिए आणविक मार्कर ए05एलई की विश्वसनीयता की पुष्टि की।
अवलोकनों से पता चला है कि केवल उनके आकार या आकृति विज्ञान के आधार पर एप्टेरस फोर्थ-इनस्टार अप्सराओं और वयस्क सरसों एफिड्स के बीच अंतर करना अनुभव के बिना चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण विशिष्ट विशेषता पिछले पैरों की टिबिया है, जो चौथे-इनस्टार अप्सराओं में सफेद दिखाई देती है लेकिन वयस्कों में नहीं (चित्रा 3)। कॉटन एफिड्स के खिलाफ एल. एटेन्यूम, बी. बेसियाना और ग्रीन पीच एफिड्स के खिलाफ एम. ब्रूनेम पर पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मोलिंग संक्रमण से बचने के लिए एक रणनीति हो सकती है28,29,30. इसलिए, एफिड चरणों की गलत पहचान से विषाणु मूल्यांकन में त्रुटियां हो सकती हैं, क्योंकि मोलिंग ईपीएफ 28,29,31 की प्रभावशीलता को प्रभावित कर सकती है। इस मुद्दे को हल करने और विषाणु मूल्यांकन में अधिक सटीकता और सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, एफिड्स को उनके पिछले पैर टिबिया पर सफेद भागों के साथ बाहर करें जो वयस्क चरण तक नहीं पहुंचे हैं जब तक कि जानबूझकर एफिड अप्सराओं का उपयोग न किया जाए। ये एफिड्स पूरी तरह से परिपक्व नहीं होते हैं और मोलिंग से गुजर सकते हैं, जो उन्हें ईपीएफ की संक्रमण प्रक्रिया से बचने की अनुमति दे सकता है। इसके अतिरिक्त, हर 12 घंटे में अवलोकन और डेटा रिकॉर्डिंग का एक समय पाठ्यक्रम अनुशंसित है। 12 घंटे का अंतराल समान एफिड-किलिंग क्षमताओं वाले कई आशाजनक आइसोलेट्स के बीच अंतर प्रदर्शित करने के लिए बेहतर है और एलटी 50 की सटीक गणना की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, समय अंतराल को अन्य कीट प्रजातियों के विभिन्न जीवन चक्रों के आधार पर समायोजित किया जा सकता है या छोटे पैमाने पर प्रीटेस्ट के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है।
यद्यपि अलग-पत्ती विधि पत्ती डिस्क पर न्यूनतम शहद छोड़ सकती है, अधिकांश हनीड्यू पेट्री डिश कवर का पालन करता है क्योंकि पत्ती डिस्क निकटता में है। अवलोकन अवधि के दौरान इसे मिटा या धोया जा सकता है। हालांकि, शहद निस्संदेह फसल की खेती के व्यावहारिक वातावरण में मौजूद है जब एफिड्स32 पर आक्रमण करते हैं। टीकाकरण कक्ष में मौजूद हनीड्यू कुछ हद तक उस स्थिति का अनुकरण कर सकता है जब ईपीएफ को खेत में एफिड्स में टीका लगाया जाता है। एफिड क्यूटिकल्स में ज्यादातर हनीड्यू होता है, जो कवक के लिए पोषक तत्वों के स्रोत के रूप में कार्य करता है और ईपीएफ16 के अंकुरण को उत्तेजित कर सकता है। इस प्रकार, एफिड्स द्वारा ईपीएफ आवेदन और हनीड्यू उत्पादन का संयोजन फायदेमंद हो सकता है।
यह पुष्टि करने के लिए कि एफिड की मौत संक्रमण के कारण हुई है, शवों को आमतौर पर ईपीएफ टीकाकरण कक्ष से नम फिल्टर पेपर या फंगल आउटग्रोथ 11,14,33,34 को देखने के लिए एक कल्चर माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है। हालांकि, इस अध्ययन में, उच्च आर्द्रता बनाए रखने के लिए टीकाकरण कक्ष में पानी के आगर का उपयोग किया गया था, जिससे एफिड कैडेवर को फंगल आउटग्रोथ अवलोकन के लिए स्थानांतरित करने की आवश्यकता के बिना पत्तियों पर रहने की अनुमति मिली। यद्यपि अलग-पत्ती विधि ईपीएफ आइसोलेट्स के एफिसाइडल प्रभाव के बारे में जानकारी प्रदान करती है, फिर भी इसकी सीमाएं हैं। लीफ डिस्क की स्थिति को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला पानी का एगर टीकाकरण कक्ष में चलते समय एफिड्स को अटक सकता है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, पानी के आगर का प्रतिशत 3% तक बढ़ा दिया गया था, जिससे रूसी गेहूं एफिड्स (दियूराफिस नोक्सिया) को20 पर चलने के लिए पर्याप्त सतह मिल गई। इस प्रयोग में, सरसों एफिड्स 1.5% से 3% तक की सांद्रता के साथ पानी की आगर सतहों पर आराम से स्थानांतरित करने में सक्षम थे। हालांकि, जैसे-जैसे अवलोकन अवधि आगे बढ़ी, कुछ एफिड्स अपने पैरों को ऊपर की ओर रखकर उल्टा फंस गए और उन्हें वापस पत्ती डिस्क पर बचाया जाना था। यह एफिड आकार या गतिशीलता में अंतर के कारण हो सकता है, यह दर्शाता है कि अकेले आगर एकाग्रता बढ़ाने से समस्या हल नहीं हो सकती है। इसलिए, सुनिश्चित करें कि पत्ती डिस्क एक पत्ती का उपयोग करके आगर की सतह को पूरी तरह से कवर करती है जो पेट्री डिश आकार के लिए अधिक स्नूली फिट बैठता है, जो इस समस्या को कम करने में मदद कर सकता है। योकोमी और गॉटवाल्ड18 द्वारा वर्णित अलग-पत्ती विधि की तुलना में, इस अध्ययन ने पत्ती के आकार का उपयोग करके एक पहलू पर सुधार किया है जो पेट्री डिश के लिए लगभग एक अच्छा फिट है। यह भोजन की खपत के सापेक्ष परिमाणीकरण की अनुमति देता है और उजागर आगर सतह को कम करता है। इसके अतिरिक्त, पत्ती को अर्ध-ठोस पानी के आगर में "एम्बेडेड" करने की आवश्यकता होती है, जबकि मूल संदर्भ में, इसे पानी के आगर18 पर "रखा" के रूप में वर्णित किया गया था। लीफ डिस्क को पानी के आगर में एम्बेड करने से एफिड्स के आगर की सतह पर चिपकने की संभावना कम हो जाती है और अवलोकन की सुविधा मिलती है, क्योंकि एफिड्स एक तरफ तक ही सीमित होते हैं।
यह प्रोटोकॉल अलग-पत्ती विधि और ईपीएफ टीकाकरण के साथ आगे बढ़ने के बारे में विस्तृत निर्देश प्रदान करता है, साथ ही कुछ संशोधनों के साथ जिन्होंने ऑपरेशन, अवलोकन और लगातार परिणामों की सुविधा प्रदान की है। यह प्रयोगशाला स्थितियों के तहत पौधे-चूसने वाले कीटों के खिलाफ ईपीएफ आइसोलेट्स का चयन करने के लिए एक मानकीकृत विधि भी स्थापित करता है। इसके अलावा, ज्ञात प्रभावी या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों के साथ एक मानक जांच आयोजित करना ईपीएफ आइसोलेट्स के भविष्य के व्यावसायीकरण के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक ों ने घोषणा की है कि इस काम में हितों का कोई टकराव शामिल नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MOST) से 109-2313-B-005-048-MY3 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
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