Summary

Avaliação do Efeito Afidicida de Fungos Entomopatogênicos Contra Insetos Partenogenéticos, Pulgão Mostarda, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Este protocolo apresenta um sistema otimizado de bioensaio foliar destacado para avaliar a eficácia de fungos entomopatogênicos (FPE) contra o pulgão mostarda (Lipaphis erysimi (Kalt.)), um inseto partenogenético. O método descreve o processo de coleta de dados durante os experimentos com placas de Petri, permitindo que os pesquisadores meçam consistentemente a virulência do PFE contra pulgões da mostarda e outros insetos partenogenéticos.

Abstract

O pulgão da mostarda (L. erysimi) é uma praga que infesta várias culturas crucíferas e transmite vírus de plantas. Para alcançar o manejo ecológico de pragas, fungos entomopatogênicos (FPE) são potenciais agentes de controle microbiano para o controle dessa praga. Portanto, a triagem de virulência de isolados de PFE em condições de placa de Petri é necessária antes da aplicação em campo. No entanto, o pulgão da mostarda é um inseto partenogenético, dificultando o registro de dados durante experimentos com placas de Petri. Um sistema modificado para bioensaios de folhas destacadas foi desenvolvido para resolver essa questão, usando um micropulverizador para inocular conídios em pulgões e prevenir o afogamento, facilitando a secagem ao ar após a suspensão dos esporos. O sistema manteve alta umidade relativa durante todo o período de observação, e o disco foliar permaneceu fresco por mais de dez dias, permitindo a reprodução partenogenética dos pulgões. Para evitar o acúmulo de filhotes, foi implementado um processo de remoção diária com pincel de pintura. Este protocolo demonstra um sistema estável para avaliar a virulência de isolados de PFE contra pulgões mostarda ou outros afídeos, possibilitando a seleção de potenciais isolados para o controle de afídeos.

Introduction

O pulgão-mostarda (L. erysimi) é uma notória praga que infesta uma variedade de culturas crucíferas, causando perdas econômicas significativas1. Embora vários inseticidas sistemáticos tenham sido recomendados para combater infestações por afídeos, o uso frequente desses inseticidas levanta preocupações sobre a resistência a pesticidas 2,3. Portanto, em termos de manejo ecológico de pragas, os fungos entomopatogênicos (PFE) podem servir como uma estratégia alternativa de controle adequada. O PFE é um inseto patógeno com capacidade de infectar hospedeiros penetrando em suas cutículas, tornando-se um potente agente no controle de pulgões e outros insetos sugadores deplantas4. Além disso, o PFE tem se mostrado uma técnica viável e sustentável de manejo de pragas, oferecendo benefícios como antagonismo de fitopatógenos e promoção do crescimento vegetal5.

O PFE pode ser obtido através de iscas de inseto-solo ou isolado de cadáveres de insetos no campo 6,7. No entanto, antes do uso adicional de isolados fúngicos, a triagem de patogenicidade é necessária. Vários estudos têm sido realizados sobre a eficácia do PFE contra pulgões, que são importantes pragas das culturas e podem causar danos severos 8,9. Os pulgões da mostarda, dentre várias espécies de afídeos, têm sido testados quanto à suscetibilidade a várias cepas de Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., e até mesmo Alternaria, que é primariamente conhecida como fungo saprofítico e fitopatogênico, mas tem mostrado alguns efeitos letais contra pulgões mostarda10,11,12.

Para avaliar a eficácia do PFE contra pulgões em condições de laboratório, os bioensaios podem ser divididos em duas partes principais: a câmara de inoculação e a inoculação fúngica. O protocolo actual descreve a construção de uma câmara de inoculação, onde os pulgões podem ser mantidos utilizando vários métodos, tais como uma folha excisada com um pecíolo envolto em algodão húmido, um disco de folha excisado com uma placa de Petri forrada com papel de filtro humedecido, manutenção directa em plantas de vaso ou um disco de folha excisado embutido em ágar água dentro de uma placa de Petri ou recipiente10, 11,13. Métodos comuns para inoculação fúngica incluem pulverização de conídios, imersão de afídeos em suspensão de conídios, imersão foliar em suspensão de conídios e inoculação de endófitos vegetais11,14,15,16. Embora existam vários métodos de inoculação, os bioensaios devem simular as condições de aplicação em campo. Por exemplo, no caso do método de imersão foliar12,17, a eficiência do PFE pode ser avaliada, mas como os pulgões infestam as folhas carregadas de fungo, a face dorsal do pulgão, que é um local preferencial de penetração, geralmente não fica exposta ao fungo.

Para avaliar o efeito afidicida do PFE em condições de laboratório, este protocolo sugere a utilização do método de folhas destacadas descrito por Yokomi e Gottwald18 com algumas modificações, seguido da inoculação de conídios com micropulverizador. Esse método mantém aproximadamente 100% de umidade na câmara de bioensaio por pelo menos sete dias, sem a necessidade de reposição adicional de água18,19. Além disso, o confinamento dos pulgões em uma superfície garante sua exposição à pulverização de conídios e facilita as observações20. No entanto, os pulgões podem ficar presos na superfície exposta do ágar enquanto se movem dentro da câmara de inoculação. Além disso, o registro de dados no experimento da placa de Petri com pulgões da mostarda, que são insetos partenogenéticos, pode ser um desafio devido ao seu rápido desenvolvimento e reprodução. É difícil distinguir entre adultos inoculados e sua progênie sem remoção. Os detalhes de como proceder nessa etapa raramente são mencionados, e alguns fatores inconsistentes, como a área de consumo de folhas, precisam ser otimizados.

Este protocolo demonstra um sistema estável para triagem da virulência de isolados de PFE contra pulgões mostarda, possibilitando a seleção de potenciais isolados contra várias espécies de afídeos a partir de uma extensa biblioteca de PFE. Pulgões coletados em campo podem ser identificados, e uma população laboratorial suficiente de pulgões mostarda pode ser estabelecida para avaliar o efeito afidicida de vários isolados fúngicos usando uma metodologia fácil e viável com resultados consistentes. Os pulgões têm desenvolvido múltiplos mecanismos evolutivos em resposta a intensas e repetidas pressões antrópicas em agroecossistemas, colocando desafios à segurança alimentar9. Portanto, este método descrito pode ser estendido para avaliar potenciais isolados de PFE contra várias espécies de afídeos.

Protocol

NOTA: O fluxograma completo é mostrado na Figura 1. 1. Coleta e manutenção de pulgões de mostarda Coleção de pulgões de mostardaVire as folhas e verifique visualmente se há infestação de pulgões de mostarda em culturas crucíferas no campo. Registre as informações do local de amostragem (ou seja, GPS) e a(s) planta(s) hospedeira(s) e confirme o histórico de aplicações de inseticidas com os agri…

Representative Results

O fluxograma apresentado ilustra a condição estável dos pulgões da mostarda desde a coleta de campo até a triagem de virulência. A manutenção dos pulgões a partir da coleta no campo garantiu um aumento estável de colônias de afídeos com um suprimento alimentar adequado. Os pulgões coletados em campo foram confirmados como pulgões mostarda através do uso de marcadores moleculares, incluindo tamanho do amplicon por PCR e sequenciamento de LeCO1. A triagem de virulência, realizada pelo método das folhas des…

Discussion

As crucíferas, um grupo de vegetais, são frequentemente infestadas por várias espécies de afídeos, incluindo o pulgão da mostarda (L. erysimi) e o pulgão do repolho (Brevicoryne brassicae)26. Ambas as espécies foram relatadas em Taiwan27, e é possível que coexistam no local de coleta. Para distinguir espécies de afídeos estreitamente relacionadas, este estudo empregou uma técnica de identificação molecular usando um conjunto de primers multi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiada pelo 109-2313-B-005 -048 -MY3 do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST).

Materials

10 μL Inoculating Loop NEST Scientific 718201
100 bp DNA Ladder III Geneaid DL007
2x SuperRed PCR Master Mix Biotools TE-SR01
50 mL centrifuge tube Bioman Scientific ET5050-12
6 cm Petri dish Alpha Plus Scientific 16021
6 mm insect aspirator MegaView Science BA6001
70 mm filter paper NO.1 Toyo Roshi Kaisha
70% ethanol
9 cm Petri dish Alpha Plus Scientific 16001
Agar Bioman Scientific AGR001.1 Microbiology grade
Agarose Bioman Scientific PB1200
BioGreen Safe DNA Gel Buffer Bioman Scientific SDB001T
Chromas Technelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR Kit Geneaid DFH300 https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit Protech Technology PT-GD112-V3 http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
Hemocytometer Paul Marienfeld 640030
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) Tai Cheng Farm 1-010-300410
Microsprayer
MiniAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific A37834
Mustard aphid (Lipaphis erysimi)
Painting brush Tian Cheng brush company 4716608400352
Parafilm M Bemis PM-996
Pellet pestle Bioman Scientific GT100R
Sabouraud Dextrose Broth HiMedia MH033-500G
SPSS Statistics IBM
TAE buffer 50x Bioman Scientific TAE501000
Tween 80 PanReac AppliChem 142050.1661

References

  1. Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
  2. Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
  3. Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
  4. Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
  5. Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
  6. Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
  7. Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
  8. Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
  9. Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
  10. Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
  11. Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
  12. Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
  13. Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
  14. Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
  15. Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
  16. Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
  17. Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
  18. Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
  19. Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
  20. Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
  21. Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
  22. Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
  23. Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
  24. Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
  25. Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
  26. Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
  27. Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
  28. Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
  29. Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
  30. Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
  31. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
  32. Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
  33. Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
  34. Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).

Play Video

Cite This Article
Yang, C., Nai, Y. Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.). J. Vis. Exp. (197), e65312, doi:10.3791/65312 (2023).

View Video