Summary
为小鼠肝脏创建了常温 离体 肝灌注（NEVLP）系统。该系统需要显微外科手术经验，但允许可重复的灌注结果。利用小鼠肝脏的能力有助于研究分子途径以鉴定新型灌注添加剂，并能够执行专注于器官修复的实验。
Abstract
该协议提出了使用小鼠肝脏的优化的无红细胞NEVLP系统。小鼠肝脏的 离 体保存是通过采用改良的插管和改编自传统商业 离体 灌注设备的技术来实现的。该系统用于评估灌注12 h后的保存结果。C57BL / 6J小鼠作为肝脏供体，通过插管门静脉（PV）和胆管（BD）排出肝脏，随后用温（37°C）肝素化盐水冲洗器官。然后，将移出的肝脏转移到灌注室并进行常温氧合机灌注（NEVLP）。每隔3小时收集入口和出口灌注液样品进行灌注分析。灌注完成后，获得肝脏样本进行组织学分析，并通过苏木精 - 伊红（HE）染色使用改良的铃木评分评估形态完整性。优化实验得出以下结果：（1）体重超过30g的小鼠由于其胆管（BD）的尺寸较大，被认为更适合实验。（2） 与聚丙烯插管相比，2 Fr（外径 = 0.66 mm）聚氨酯插管更适合插管门静脉 （PV）。这归因于聚氨酯材料增强了抓地力，从而减少了从身体转移到器官室过程中导管打滑。（3）对于胆管（BD）的插管，发现1Fr（外径= 0.33mm）聚氨酯套管比聚丙烯UT-03（外径= 0.30mm）套管更有效。通过这种优化的方案，小鼠肝脏成功保存了12小时，对组织学结构没有显着影响。苏木精-伊红 （HE） 染色显示肝脏形态结构保存完好，其特征是主要存活的肝细胞，具有清晰可见的细胞核和肝窦的轻度扩张。
Introduction
肝移植是终末期肝病患者的金标准治疗。令人遗憾的是，对捐献器官的需求超过了现有供应，导致严重短缺。2021 年，约有 24,936 名患者在等待肝移植的名单上，而只有 9,234 例移植成功进行1。肝移植物供需之间的巨大差异凸显了研究替代策略以扩大供体库和提高肝移植物可及性的迫切需要。扩大捐助者库的一种方法是使用边际捐助者2.边缘捐赠者包括高龄、中度或重度脂肪变性的人。尽管边缘器官移植可能会产生有利的结果，但总体结果仍然不理想。因此，目前正在制定旨在增强边际捐赠者功能的治疗策略3,4。
其中一种策略是利用机器灌注，特别是常温氧合机灌注，来改善这些边缘器官的功能5。然而，对常温氧合机灌注（NEVLP）有益作用的分子机制仍然了解有限。小鼠具有丰富的转基因菌株，是研究分子途径的宝贵模型。例如，自噬途径在减轻肝缺血再灌注损伤中的重要性已得到越来越多的认可6,7。肝缺血再灌注损伤中一条重要的分子途径是 miR-20b-5p/ATG7 途径8。目前，有许多ATG敲除和条件敲除小鼠品系可用，但没有相应的大鼠品系9。
基于这一背景，目的是为小鼠肝脏移植物生成小型化的NEVLP平台。该平台将有助于探索和评估旨在改善供体肝脏功能的潜在转基因策略。此外，该系统必须适合长期灌注，使肝脏能够 离体 治疗，通常称为“器官修复”。
考虑到小鼠肝脏灌注的相关 体外 数据有限，文献综述侧重于在大鼠中进行的研究。使用“正常体温肝灌注”、“体外 或 体外”和“大鼠”等关键词对 2010 年至 2022 年的文献进行了系统检索。该搜索旨在确定啮齿动物的最佳条件，使我们能够确定最合适的方法。
灌注系统由密封的水套玻璃缓冲储液罐、蠕动辊泵、氧合器、气泡阱、热交换器、风琴室和封闭循环管系统组成（图 1）。该系统确保使用专用的恒温机器精确保持 37 °C 的恒定灌注温度。蠕动辊泵驱动灌注液在整个回路中的流动。灌注回路在绝缘水套储液罐处启动。随后，灌注液被引导通过氧合器，氧合器从专用气瓶中接收95%氧气和5%二氧化碳的气体混合物。充氧后，灌注液通过气泡阱，其中任何被困住的气泡都通过蠕动泵重定向回储液器。剩余的灌注液流经热交换器并进入器官室，从那里返回储液器。
在这里，我们报告了我们为小鼠肝脏建立NEVLP的经验，并分享了使用不含氧载体的含氧培养基进行的试点实验的有希望的结果。
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Protocol
动物实验是根据现行的德国动物福利法规和指南以及ARRIVE动物研究报告指南进行的。动物实验方案由德国图林根州Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz批准（批准号：UKJ - 17 - 106）。
注意：将体重34±4g（平均值[SEM]的平均±标准误差）的雄性C57BL / 6J小鼠用作肝脏供体。它们在受控的环境条件下（50%湿度和18 - 23°C）下保持，并自由获取标准小鼠食物和水。在整个手术过程中，呼吸频率保持在60次/分钟以上，体温保持在34°C以上。
1. 准备
- 设置操作表
- 高压灭菌所有手术器械和耗材以进行灭菌。
- 打开所有设备，包括加热板和电凝。
- 将一个装有25mL肝素化（2,500U / L）盐水的50mL注射器置于温暖的培养箱（37°C）中。
- 将手术器械、6 - 0 丝缝线、无菌小棉涂抹器、兽医盐水（500 mL）和无纺布海绵（10 cm x 10 cm）适当地放在手术台上。
- 将 26 G 针头放在手术台上，在 0.5 mL 微量离心管的盖子上开一个小孔，以接收胆管以进行胆汁收集。
- 将套管（1 Fr 聚氨酯插管或 UT - 03 聚乙烯插管）和无菌的 0.5 mL 微量离心管放在手术台上，用于收集胆汁。
- 自制门静脉插管
- 用镊子握住2 Fr套管，并在距离套管末端1厘米处用30 G针刺穿壁。将针头推入套管，直到针尖可见。
- 修剪套管的尖端，形成一个尖锐的三角形。
- 肝素化盐水的制备
- 制备 25 mL 肝素化盐水，终浓度为 2,500 IU/mL。
- 去除所有气泡并将注射器置于40°C培养箱中。
- 灌注系统演示
- 机器灌注系统的主要部件见 图1 。
- 器官室的设置
- 有关管风琴室的布局，请参见 图2 。
- 设置灌注系统
- 打开实验室图表程序进行压力监测。
- 在器官室级别连接压力校准器和压力传感器。
- 将压力校准器调整为读数为 0 mmHg，并在压力控制软件上检查相应的值。
- 将压力校准器调整为读数为 20 mmHg，然后再次检查压力控制软件上的相应值。
- 打开水浴，并将风琴室预热至40°C。
- 用蒸馏去离子水冲洗整个管道系统两次，每次30分钟，确保完全去除消毒液。
- 启动消毒溶液在整个系统中的循环，持续20分钟，以确保彻底消毒。
- 打开气体混合物（95% 氧气 （O 2） 和 5% 二氧化碳 （CO2）。
- 灌注液灌装
- 用 50 mL 胎牛血清、3 mL 青霉素/链霉素 （1 mg/mL）、0.17 mL 胰岛素 （100 IE/mL）、0.34 mL 肝素 （5000 U/mL） 和 0.07 mL 氢化可的松（100 mg/2 mL）补充 250 mL 威廉姆斯 E 培养基，以制备完整的威廉姆斯 E 培养基。
- 向储液槽和器官室中加入等体积 （150 mL） 的灌注液以启动系统。
注意：在灌装过程中必须特别注意保持无菌。灌注液不断泵送通过封闭式再循环机灌注的这两个关键部件。 - 以中速 （15 mL/min） 打开蠕动泵，用含氧培养基灌注灌注系统。
2. 肝脏植
- 术前准备
- 称量动物的体重。准备镇痛药丁丙诺啡（0.3毫克/毫升）（0.05毫克/公斤体重）。
- 将感应室与墙上插座连接。将氧气调至 0.5 升/分钟。将异氟醚转至3%。
- 将动物放入腔室中，直到达到深度麻醉（扶正反射阳性）。
- 使用微型注射器皮下应用体重适应剂量的镇痛药。
- 使用电动剃须刀修剪腹部皮肤上的皮毛。
- 将鼠标转移到手术台上，打开异氟烷蒸发器至2.5%以维持麻醉。通过测试指间脚趾反射来确认麻醉深度。
- 小鼠腹部的准备
- 将鼠标置于仰卧位。
- 测试指间反射以双重确认适当的麻醉深度。用胶带固定所有四肢。
- 使用连续三轮碘酒精将腹部两侧消毒至腋窝中线。使用无纺布消毒纱布覆盖手术区域周围的区域。
- 使用Metzenbaum婴儿剪刀和手术镊子在小鼠腹部剑突下方1厘米处做一个3厘米的横向切口。
- 将皮肤切口双侧延伸至两侧的腋中线。
- 用弹簧剪刀沿着白线小心地做一个2厘米的纵向切口。
- 用电凝和Vannas弹簧剪刀切开腹肌层。
- 小心地放置一块湿纱布，以保护肝脏免受电凝。
- 使用6 - 0丝缝合线和圆针回缩剑突，以更好地暴露冠状动脉韧带。
- 使用两个肋骨牵开器完全暴露小鼠的腹腔。
- 用湿棉签小心地将小肠移出腹腔，以充分暴露肺门。
- 胆总管准备
- 用锋利的剪刀横断镰刀状韧带、膈状韧带和胃肝韧带。
- 使用没有牙齿的细弯曲镊子小心地释放胆总管。
注意：胆总管很容易损坏和断裂。一旦断裂，就无法插管。由于解剖位置的方向，弯曲的镊子最好使用。 - 在胆总管上放置两个 6 - 0 丝线环，为下一步做准备。
- 胆总管插管
- 小心地用30G针刺穿胆管。使用尖弯曲的镊子扩大小孔以适合胆管插管。
- 使用血管插管钳抓住胆管插管并将其推入胆管。
- 用预设的 6 - 0 缝合环双重固定套管。
注意：在插管过程中，会感觉到胆汁的阻力。如果力控制不好，套管会被胆汁流出的压力推出胆道。小心调整套管的深度。如果太深，可能会损坏胆管，如果不够深，可能会滑出。 - 观察插管成功后套管中的胆汁流动。
- 门静脉准备
- 用扁平镊子夹住门静脉，并用弯曲的镊子小心地释放结缔组织。不要用力拉扯，以免引起门静脉撕裂。一旦门静脉受损，就很难重新插管门静脉。
- 解剖刚好优于分叉的PV，并使用6 - 0丝缝线将第一个缝合环放在靠近汇合处的PV上，以备后用。
- 放置第二个缝合环，以便以后将 PV 固定在尽可能靠近肝门的地方。
- 门静脉插管
- 使用动脉夹闭合门静脉远端静脉。
- 非常小心地，用上述门静脉套管之一刺穿门静脉。成功穿刺后，可以清楚地观察到套管内的血流。
- 用预先放置的 6 - 0 缝合环固定 PV 套管。
- 肝脏潮红
- 将异氟醚增加至5%，并用过量的异氟烷吸入对小鼠实施安乐死。
- 从培养箱中取出预热的肝素盐水溶液。去除肝素化盐水内形成的所有气泡。
- 将带有预热肝素化盐水的注射器固定到注射泵中。
- 将注射泵的延长管连接到门静脉的套管，将速度调节到2mL / min，并开始肝脏冲洗。
- 在冲洗程序结束时观察肝脏的颜色。一旦颜色变成均匀的黄色，就切除肝脏。
- 横断横膈膜、上下腔静脉、肝下腔静脉、肝动脉、门静脉远端和任何剩余的结缔组织。
- 将肝脏放入培养皿中。
3. 肝腔连接
- 肝脏转移
- 使用培养皿小心地将肝脏转移到器官室中。
- 在培养皿中保留少量盐水，以防止肝脏干燥。
注意：在此过程中，门静脉和胆管很容易扭曲，这可能会影响肝脏灌注和胆汁收集。
- 门静脉套管连接
- 用注射器缓慢将生理盐水注入门静脉套管，以排出套管中的气泡。
- 将门静脉插管连接到器官室的灌注流出管中。
- 胆管插管连接
- 引导小鼠胆管套管通过连接到器官室的橡胶帽的瓣膜。
- 将胆管插管插入预先准备好的 0.5 mL 微管中，盖子上有一个小孔。
- 将微管放在器官室外的粘土上。
4.根据PV压力调节流量
- 从 1 mL/min 打开蠕动泵。
- 检查门静脉压力读数以调整流速。
- 通过调节流速，将门静脉压力保持在 7 - 10 mmHg 之间的生理范围内。
注意：标称流量可能会略有不同，具体取决于管子的用途和位置。
5. 样品采集
- 每隔 3 小时从门静脉流入管获取入口灌注样品，从器官室获取出口灌注样品。
- 在12小时灌注期结束时从所有肝叶收集样品以进行组织学分析。
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Representative Results
建立外科手术
本实验共使用17只动物：14只小鼠用于优化器官获取过程，包括门静脉（PV）和胆管（BD）的插管，而3只小鼠用于验证该程序（表1）。比较组织学结果（图3）以方便确定最佳灌注条件。
灌注液的选择
本研究选择了以前使用的肝细胞培养基10,11。William's E培养基最初由Williams和Gunn设计为血清还原培养基，用于延长成熟大鼠肝上皮细胞的体外培养12。尽管如此，它也发现了支持啮齿动物肝细胞生长和维持的实用性13。胎牛血清（FBS）是一种广泛使用的细胞培养补充剂，因为它富含促进细胞生长，增殖和活力的必需营养素和生长因子14。使用完整的William's E培养基作为灌注液（表2），补充20%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、5,000 U/L肝素、50 U/L胰岛素和0.010 g/L氢化可的松。
套管的选择
插管程序包括首先插管胆管（BD）以收集胆汁液，然后插管门静脉（PV）。对于BD插管，最初使用外径为0.3毫米，内径为0.18毫米的UT-03聚丙烯管。然而，由于担心潜在的BD损伤以及与修剪和刚性UT-03尖端相关的导管意外移位风险较高，因此优先考虑1 Fr聚氨酯管。聚氨酯管的材料更柔软，滑度更低，被认为更适合BD插管。
最初，使用26 G聚丙烯静脉注射针管插管来插管门静脉（PV）。然而，针头的移除和随后套管与灌注管的连接导致气泡的形成，这有可能阻塞肝内正窦。为了克服这个问题，使用插入2 Fr聚氨酯套管远端1厘米的30 G针头构建了留置套管。然后将这种自制的“针引导套管”插入汇合处上方的远端PV中。当导管位于PV内时，针头缓慢抽出，同时推进管子。自制套管的末端连接到腔室内的灌注管。在这种插管技术中使用软材料通过降低对容器后壁造成伤害的风险提供了优势。
验证研究
对入口和出口灌注液样品进行pH和钾水平测定。然后将获得的结果（图4）与最近出版物15,16,17中报告的发现进行比较。将三只小鼠肝脏灌注含氧并补充威廉的E培养基12小时。在此期间，连续记录了7 - 10 mmHg的稳定灌注压力。在整个12 h灌注过程中，平均pH值相对稳定，范围在7.3至7.7之间。在整个灌注期间，平均钾水平也稳定，范围在5.9至6.8 mmol/L之间（图4）。PV流速保持在0.8 - 1.2 mL / min / g的范围内，具体取决于实验过程中泵管的使用和位置。在小鼠肝脏灌注中观察到的所有结果都与先前报道的大鼠肝脏灌注观察结果相似（表3）。
从三个肝脏（N = 3）收集组织样本，并使用优化的HE染色方案进行12小时灌注，然后进行全玻片扫描。使用改良的铃木评分对每个肝叶进行评分（表4）。经典的铃木评分18 通过合并三个附加参数来增强：细胞核的 pyknosis、血管的脱离以及正弦和大血管中存在红细胞。每个参数的等级为不存在 （0）、轻度 （1）、中等 （2） 和严重 （3）。最终得分0 - 7被认为反映了良好的保存，8 - 14表示中等保存，14 - 21表示保存不良。
根据修改后的铃木评分评估小鼠肝脏的保存情况。两位医学专家对三个肝脏的七个叶的形态进行了独立评估（图5，图6，图7）。计算每个肝叶7个叶评分的平均值;分数越低表明肝脏保存得更好。专家们的评价显示出高度的一致性。值得注意的是，虽然在评估核混血时观察到两位专家分配的分数略有差异，但这些差异并未显着影响整体评分结果。
充其量，肝实质相对完整，具有保存完好的典型小叶结构，几乎无法与正常肝脏区分开来。肝细胞似乎具有清晰可见的细胞膜和圆形细胞核。然而，一些细胞核发生了嗜血，一些肝窦略微扩张，导致4分。（图3、 图6）
在最坏的情况下，小叶结构扭曲，血管与实质分离，实质坏死融合。在细胞水平上，细胞空泡化和细胞核混血变得明显，特别是在中央周围区域。此外，观察到轻度至中度的空泡化。高达30%的肝细胞正在经历坏死，导致最高分为14分。（图3、 图7）
表1：小鼠肝脏灌注模型的逐步建立。 由于套管大小、材料和定位的差异，在建立过程中观察到各种并发症。 请按此下载此表格。
表2：体外器官保存方法的比较15,17,19,20,21,22。 在各种储存条件下，优化灌注液选择、氧气载体选择和营养成分比较至关重要。请按此下载此表格。
表3：正常大鼠和大鼠NEVLP的血流动力学和血气分析 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31。 所提供的信息选择性地描述了大鼠肝脏的血流动力学特征和体外正常热灌注的关键参数。具体而言，当PV压力通常在4至10mmHg范围内，并且进入PV的灌注液中的氧分压范围为80至550mmHg时，可以认为大鼠肝脏灌注是最佳的，满足体外大鼠肝脏灌注成功的必要标准。请按此下载此表格。
表4：修改后的铃木评分。 本研究中使用的改良铃木评分通过合并三个附加参数来扩展经典铃木评分：细胞核的 pyknosis、血管脱离以及正窦和大血管中红细胞的存在。每个参数都被分配了一个等级，等级为 0（不存在）、1（轻度）、2（中等）或 3（严重）。总分从0到8不等，表明保存良好;9至16表示中度保存，17至24表示保存不良。 请按此下载此表格。
表5：基于大鼠NEVLP文献检查的灌注介质、灌注液量和灌注压力的选择（2010-2022）3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ，37,38，
39,40,41,42,43,44,45。 大鼠肝脏中的常母机灌注在所用灌注物的特定类型和体积以及灌注持续时间方面可能表现出不同研究的差异性。不同的研究可能采用不同的方法，例如透析或大量灌注，持续很长时间。然而，尽管存在这些差异，但灌注液中的门静脉压力、门静脉流速和氧分压等参数通常显示出各种方法的最小变化。请按此下载此表格。
图1：灌注系统示意图。 关键部件是风琴室、恒温机、滚筒泵、氧合器和储液罐。灌注液通过蠕动泵从储液罐泵入氧合器。氧合器中存在 95% O2 和 5% CO2 的不间断气流。灌注液通过气泡阱，灌注液中存在的任何气泡都被捕获并泵回储液罐。剩余的灌注液流向器官室，管子连接到门静脉。从器官腔室流出的灌注液通过蠕动泵引导回储液器。胆汁引流管连接到器官室以收集胆汁。 请点击此处查看此图的大图。
图2：灌注室的特写。 器官灌注室包括灌注液入口和出口、气泡阱、热交换器和胆汁收集口。使用压力传感器对灌注泵压力进行实时监测。 请点击此处查看此图的大图。
图3：正常和灌注小鼠肝脏的组织学结果。 （A）正常小鼠肝脏形态（对照）。（B）灌注12小时后通过HE染色可视化的最佳保存形态的示例。（C）. 灌注 12 小时后通过 HE 染色可视化保存最差的形态示例。黑色箭头表示空泡化，红色箭头表示正弦扩张，黄色箭头表示细胞核裂开，绿色箭头表示血管脱离。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：灌注液分析。 pH值（A）和钾水平（B）。两个参数在12小时的观察时间内都是稳定的，表明灌注条件恒定 请点击此处查看此图的大图。
图 5：轻微肝损伤导致铃木评分修改 4-7。 NEVLP12小时后，对肝脏形态进行半定量评估。分别对来自每个肝叶的样本进行评估和分级，得出每个肝脏的范围和平均分数，最高得分为4。保存完好的肝脏形态，评分范围为 4-7，具体取决于肝叶（平均值 = 5）（得分 0-7：保存完好的肝脏形态，得分 8-14 中度保存的形态，得分 15-21：保存不良的肝脏形态） 请点击此处查看此图的大图。
图 6：中度肝损伤导致铃木评分修改 7-14。 根据修改后的铃木评分，在正常温氧合机灌注12小时后对肝脏形态进行半定量评估。形态保存适中，评分范围为 7 至 14（平均值 = 11）。（得分 0-7：肝脏形态保存良好，评分 8-14 中度保存形态，得分 15-21：肝脏形态保存不良） 请点击此处查看此图的大图。
图 7：轻度 - 中度肝损伤导致铃木评分修改 5-11。 不均匀灌注导致不同肝叶的形态轻微至中度保存，评分范围为5至11（平均值= 8）。（得分 0-7：肝脏形态保存良好，评分 8-14 中度保存形态，得分 15-21：肝脏形态保存不良） 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
协议中的关键步骤
肝植的两个关键步骤是门静脉插管（PV）和随后的胆管插管（BD）。这些步骤对于确保成功的器官取回和随后的灌注或移植程序至关重要。
挑战和解决方案
PV插管存在三个挑战：血管壁的损伤，导管的移位和插入过程的实用性。PV血管壁的脆弱性质使其在插管过程中不小心处理，容易被刺穿和随后的出血。此外，PV的任何失血都会降低门静脉压力，使插入PV套管更具挑战性。此外，门静脉壁损伤可能会将空气栓子引入肝内血管系统。因此，在PV插管过程中保持精确和谨慎对于最大程度地降低并发症的风险至关重要。
在PV插管期间，导管移位的风险是一个常见的问题，特别是在使用带有光滑材料的插管时。与聚丙烯相比，使用聚氨酯插管更有利于PV插管。聚氨酯的柔软和柔韧性大大降低了导管移位或丢失的风险，这可能是由于其材料特性。此外，使用软套管可最大程度地减少损伤血管内皮层的可能性。在研究中，比较了三种类型的血管通路插管，即24 G聚丙烯，26 G聚丙烯和2 Fr聚氨酯，用于PV插管。在这些选项中，26 G和2 Fr聚氨酯插管都表现出与鼠标PV尺寸更好的兼容性。虽然 26 G 套管表现出更好的解剖兼容性，但外径为 0.66 mm 的 2 Fr 聚氨酯套管因其独特的材料特性而被认为适合预期应用，有效地降低了导管意外从 PV 上移位的风险。
关于插入的实用性，测试了不同的技术。一种方法是夹住PV的近端和远端，用细剪刀切一个小孔，然后插入PV插管。由于同时行动的复杂性和要求，这种技术需要额外的人参与。因此，单个显微外科医生独立执行手术是不可行的。因此，需要带有内针和外套管的导管。如前所述，使用市售的坚硬光滑的 26 G 聚丙烯插管存在滑出的风险，并且在将套管连接到冲洗系统时有形成气泡的风险。为了解决这些问题，通过将针导管中的26 G针插入长而柔韧的聚氨酯2 Fr套管中，设计了一种自行构建的“针导管系统”。这种方法具有三个关键优势：（1）导管插入系统，（2）长而灵活的管子，以及（3）良好的材料特性。然而，在此步骤中，必须小心防止针尖在前进时接触PV壁，因为这可能会对容器壁造成不可逆转的损坏。
BD插管带来了相同的三个挑战：血管壁的损伤，导管的位移和插入过程的实用性。最终，由于其有利的材料特性，1 Fr 聚氨酯插管被认为比 UT-03 聚丙烯插管更合适。尽管与 1 Fr 热敏聚氨酯管 （0.33 mm） 相比，UT - 03 套管的外径略小 （0.30 mm），但聚氨酯材料是刚性的，不易弯曲。另一方面，1 Fr 插管柔软而有弹性，更容易插入，因此成为我们的首选。然而，在BD尺寸非常小并且无法容纳较大的2 Fr套管的情况下，UT - 03套管仍然是一个可行的替代方案。在这种情况下，必须特别注意防止套管从BD移位。
如文献综述（表5）所述，大多数实验者19,41,42,46使用1 - 3 mL / min / g肝脏的门流速。但是，应调整流速以将生理门压力保持在4 - 10 mmHg28的范围内。高PV压力可能导致正弦扩张和血管脱离。低 PV 压力和低 PV 流速可能导致低血流量低氧合，随后出现中区至中央周坏死。PV流速的操作具有调节PV压力的功能，PV压力可能根据使用的套管和肝脏的大小而变化，因此需要对PV流速进行微小调整。因此，在本研究中，以1mL / min / g肝脏的流速开始灌注，同时使用血压传感器监测PV压力，以通过调节流速来维持生理PV压力。
在开发NEVLP模型期间，尝试通过在灌注液中添加洗涤的红细胞来进一步改善灌注肝脏的氧气供应。然而，在大腔室和储液库中观察到红细胞的显着沉降，从而减少了灌注期间氧气载体向器官的输送。此外，蠕动灌注泵的机械作用对红细胞的损伤是由蠕动灌注泵引起的，蠕动灌注泵通过压缩硅管来驱动灌注液。这两个原因促使我们决定在这个实验中不使用红细胞。全氟化碳基载氧体或许能够解决这些问题47。
为了评估灌注期间肝脏移植物的活力，每隔3小时收集一次小鼠胆汁液。然而，由于小鼠胆汁的高粘度，很难通过导管收集胆汁。这最初由放置在BD中的细1 Fr聚氨酯导管引起的毛细管力补偿。然而，在实验的第一个小时内只能收集大约 20 μL 的胆汁液。而不是通过套管引流，观察到胆囊逆行充盈。
在12小时灌注期结束时，胆囊充满透明胆汁，表明在机器灌注期间活跃地产生胆汁。这可以通过将一根较大的管子放入胆囊来抵消。
同时，评估肝细胞和小叶结构的组织学损伤以确定保存结果。据观察，即使在同一个肝脏内，保存也是不均匀的。结构变化的不均匀性表明灌注在整个肝脏中是异质的（图5，图6，图7）。此外，组织学发现提供了证据，证明在机器灌注期间保持小鼠肝移植物的结构完整性至少持续 12 小时是可行的。然而，完整肝组织学的存在只能帮助评估，但不能明确确定肝脏的功能和活力。应该注意的是，坏死作为细胞损伤的最终表现，可能要到后期才能容易观察到。因此，仅依靠组织学评估可能无法全面了解肝脏的功能状态和活力。需要其他补充测定和评估来确定肝脏的整体状况，包括功能测定、生化标志物和代谢活动评估。
灌注12小时后保存良好。然而，进一步延长器官修复可能需要的灌注时间需要解决一些问题。首先，应该注意的是，要实现超过12小时的长期灌注持续时间，就需要保持无菌条件，而不仅仅是清洁条件。然而，在这些最初的实验中，重点是保持清洁条件而不是无菌条件，因为确保无菌会给程序带来额外的复杂性。其次，如Herman Tolboom22所述，更长的灌注可能需要增加一个透析单元，以去除积聚的有毒代谢废物。他们使用总体积为55-60mL的系统灌注10g的大鼠肝脏4小时。在这项研究中，尽管小鼠肝脏的尺寸很小，重约1g，但使用了总体积为300 mL的相对较大的储液器。这种配置导致额外的稀释因子为50倍。值得注意的是，在使用该装置的12小时灌注期间未观察到有害影响。第三，较长的灌注还需要添加氧气载体，充其量是以人工血红蛋白的形式，以确保足够的氧气供应，如Dondossola等人47 和Jägers等人48所述。
基于NEVLP的“非缺血性”肝移植的发展，无疑为解决甚至预防缺血再灌注损伤问题带来了新的思路和方法。然而，NEVLP是一个非常有前途的概念，用于改善器官保存及其在将器官保存扩展到器官修复方面的潜在应用47。
目前，在实验和临床上使用三种不同的机器灌注技术。主要区别在于工作温度：低温机器灌注、亚热母机灌注和正常温机灌注（表2）。其他差异包括保存溶液、灌注液和添加氧气载体的选择（表5）。
NEVLP的优势主要是因为（1）器官维持在正常温度，（2）它被氧合，（3）它代谢完全供应。该系统为诊断评估、干预治疗和最终器官修复提供了一个极好的平台49。然而，NEVLP对离体器官支持技术提出了巨大的挑战。NEVLP面临的挑战是反映近乎生理的状况。直到最近，由于规模小且缺乏标准评估标准，仅进行了有限数量的啮齿动物NEVLP研究25,26,27,28,29,30,31。
这里已经证明，鼠标模型是一个有效的模型，允许保存时间为 12 小时。相比之下，大多数大鼠研究报告的灌注时间为6小时或更短28,33。此外，与大型动物相比，使用小动物对于分子研究具有优势，因为试剂丰富且实验成本较低。例如，小鼠目前是测试ATG基因家族敲除模型的首选，特别是用于研究肝脏缺血再灌注损伤的信号通路8,50。
关于NEVLP的大鼠肝脏实验表明，与冷保存相比，常温机器灌注保存与减少肝细胞损伤和提高移植后早期生存率有关31,40,51,52,53,54。使用大鼠肝脏的NEVLP也适用于研究药物或细胞添加到灌注液中。一个令人印象深刻的例子是XuanTian 26的研究，他使用血红素加氧酶-1修饰的间充质干细胞结合常温机器灌注，通过Wnt信号通路改善肝移植的质量。王浩杰39在最近的研究中证实，在灌注液中添加骨髓间充质干细胞可以大大提高大鼠短时灌注NEVLP的质量。在他们使用DCD肝脏的研究中，骨髓间充质干细胞与NEVLP相结合抑制肝窦充血和内皮损伤。间充质干细胞的添加阻止了肝内巨噬细胞活化和细胞间粘附。此外，间充质干细胞的添加调节内皮素-1/内皮一氧化氮平衡，以改善肝脏灌注和微循环。
在NEVLP方面，小鼠比大鼠具有明显的优势，特别是在专注于转基因或转基因肝脏的分子研究的背景下。然而，由于动物的体型很小，该程序对显微外科医生37提出了更大但可控的挑战。
用于组织学评估的分级系统
组织学评估对于确定灌注条件对移植物形态完整性的影响具有决定性意义。
虽然铃木评分通常用于评估肝脏病理学的研究，但已经注意到该评分系统可能无法充分捕捉在离体肝脏保存中观察到的具体发现。为了解决这一限制，引入了四个额外的标准来加强对保存的肝组织的综合评估（表4）。首先，纳入了核脓毒症评估，因为它是指示细胞损伤的宝贵参数。其次，血管和肝细胞脱离的评估，这意味着肝小叶的损伤，被纳入作为附加标准。最后，红细胞在鼻窦中存在的分级被用作异质性冲洗和灌注的指标。通过结合这些补充标准，对保存的肝组织状况进行了更细致和准确的评估，从而更深入地了解了离体肝脏保存的效果。
肝细胞空泡化55 发生在底物使用，能量消耗，微管崩解和蛋白质合成抑制的改变之后。肝细胞的细胞核通过大液泡被迫向细胞外围移动。这个过程经常伴有核脓毒症。在这项研究中，与提示不均匀灌注的对照相比，12 小时的正常温机灌注导致不同程度的肝细胞空泡化。
在这项研究中，肝细胞脊髓之间存在扩张的窦窦是值得注意的。这种现象主要起源于肝静脉流出道梗阻，导致肝实质内的血管淤滞和充血。在该小鼠肝脏模型中，由于器官体积小，与保持一致的门静脉灌注压相关的挑战可能有助于观察到肝窦扩张。
坏死变化通常表现在细胞簇、区域或特定区域。与中央周围区域相比，灌注良好的门周区域表现出相对更好的肝细胞保存。如大鼠肝脏20所示，由于肝动脉体积小，双血管肝灌注在小鼠肝脏中提出了更大的挑战。因此，观察到的小鼠肝脏不均匀灌注可至少部分归因于这种限制。
这些观察结果并非接受NEVLP的小鼠肝脏所独有，但也可以在其他NEVLP研究的组织学图像中可视化，尽管它们可能没有明确描述。
小鼠NEVLP的重要性和潜在应用
小鼠肝脏的NEVLP是一个具有挑战性但可行的手术。需要进一步努力充分利用这项技术来阐明NEVLP有益作用的机制。增强我们的知识将促进这项技术的逐步发展，将其从器官保存过渡到“器官修复”领域。
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Disclosures
没有需要披露的财务利益冲突。
Acknowledgments
在撰写本文的整个过程中，我得到了大量的支持和帮助。我特别要感谢我的队友陈新培，感谢他在我手术过程中的出色合作和耐心支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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