Summary
Et normoterm ex vivo leverperfusjonssystem (NEVLP) ble opprettet for muselever. Dette systemet krever erfaring innen mikrokirurgi, men gir mulighet for reproduserbare perfusjonsresultater. Evnen til å bruke muselever letter undersøkelsen av molekylære veier for å identifisere nye perfusatadditiver og muliggjør utførelse av eksperimenter fokusert på organreparasjon.
Abstract
Denne protokollen presenterer et optimalisert erytrocyttfritt NEVLP-system ved hjelp av muselever. Ex vivo bevaring av muselever ble oppnådd ved å bruke modifiserte kanyler og teknikker tilpasset konvensjonelt kommersielt ex vivo perfusjonsutstyr. Systemet ble brukt til å evaluere bevaringsresultatene etter 12 timers perfusjon. C57BL/6J-mus fungerte som leverdonorer, og leveren ble eksplantet ved kanylering av portvenen (PV) og gallegangen (BD), og deretter skylling av organet med varmt (37 °C) heparinisert saltvann. Deretter ble de eksplanterte leverene overført til perfusjonskammeret og utsatt for normoterm oksygenert maskinperfusjon (NEVLP). Innløps- og utløpsperfusatprøver ble samlet med 3 timers intervaller for perfusatanalyse. Etter fullført perfusjon ble leverprøver tatt for histologisk analyse, med morfologisk integritet vurdert ved hjelp av modifisert Suzuki-Score gjennom Hematoksylin-Eosin (HE) farging. Optimaliseringsforsøkene ga følgende funn: (1) mus som veide over 30 g ble ansett som mer egnet for forsøket på grunn av den større størrelsen på gallekanalen (BD). (2) en 2 Fr (ytre diameter = 0,66 mm) polyuretankanyle var bedre egnet til kanylering av portvenen (PV) sammenlignet med en polypropylenkanyle. Dette ble tilskrevet polyuretanmaterialets forbedrede grep, noe som resulterte i redusert kateterglidning under overføringen fra kroppen til organkammeret. (3) for kanylering av gallegangen (BD) ble en 1 Fr (ytre diameter = 0,33 mm) polyuretankanyle funnet å være mer effektiv sammenlignet med polypropylen UT - 03 (ytre diameter = 0,30 mm) kanyle. Med denne optimaliserte protokollen ble muselever bevart i en varighet på 12 timer uten signifikant innvirkning på den histologiske strukturen. Farging av hematoksylin-eosin (HE) avslørte en godt bevart morfologisk arkitektur i leveren, karakterisert ved overveiende levedyktige hepatocytter med tydelig synlige kjerner og mild utvidelse av leversinusoider.
Introduction
Levertransplantasjon representerer gullstandardbehandlingen for personer med leversykdom i sluttstadiet. Dessverre overgår etterspørselen etter donororganer det tilgjengelige tilbudet, noe som fører til en betydelig mangel. I 2021 sto ca. 24 936 pasienter på venteliste for levertransplantasjon, mens kun 9 234 transplantasjoner ble utført1. Den betydelige forskjellen mellom tilbud og etterspørsel av levertransplantater fremhever den presserende nødvendigheten av å undersøke alternative strategier for å utvide donorbassenget og forbedre tilgjengeligheten av levertransplantater. En måte å utvide donorpoolen på er å bruke marginale donorer2. Marginale givere inkluderer de med avansert alder, moderat eller alvorlig steatose. Selv om transplantasjon av marginale organer kan gi gunstige resultater, forblir de samlede resultatene suboptimale. Som et resultat er utviklingen av terapeutiske strategier rettet mot å styrke funksjonen til marginale donorer for tiden i gang 3,4.
En av strategiene er å bruke maskinperfusjon, spesielt normoterm oksygenert maskinperfusjon, for å forbedre funksjonen til disse marginale organene5. Imidlertid er det fortsatt en begrenset forståelse av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for de gunstige effektene av normoterm oksygenert maskinperfusjon (NEVLP). Mus, med sin rikelig tilgjengelighet av genetisk modifiserte stammer, tjener som verdifulle modeller for å undersøke molekylære veier. For eksempel har betydningen av autofagibaner for å redusere leveriskemi-reperfusjonsskade blitt stadig mer anerkjent 6,7. En viktig molekylær vei i leveriskemi-reperfusjonsskade er miR-20b-5p / ATG7-banen8. For tiden er det en rekke ATG knockout og betingede knock-out musestammer tilgjengelig, men ingen tilsvarende rottestammer9.
Basert på denne bakgrunnen var målet å generere en miniatyrisert NEVLP-plattform for muselevertransplantater. Denne plattformen vil legge til rette for utforskning og evaluering av potensielle genmodifiserte strategier for å forbedre funksjonaliteten til donorens lever. I tillegg var det viktig at systemet var egnet for langvarig perfusjon, noe som muliggjorde ex vivo-behandling av leveren, ofte referert til som "organreparasjon".
Tatt i betraktning den begrensede tilgjengeligheten av relevante in vitro-data om perfusjon hos mus, fokuserte litteraturgjennomgangen på studier utført på rotter. Et systematisk litteratursøk fra 2010 til 2022 ble utført med søkeord som «normoterm leverperfusjon», «ex vivo eller in vitro» og «rotter». Dette søket hadde som mål å identifisere optimale forhold hos gnagere, slik at vi kunne bestemme den mest hensiktsmessige tilnærmingen.
Perfusjonssystemet består av et forseglet vannkappet glassbufferreservoar, en peristaltisk rullepumpe, en oksygenator, en boblefelle, en varmeveksler, et orgelkammer og et lukket sykkelslangesystem (figur 1). Systemet sikrer presist vedlikehold av en konstant perfusjonstemperatur på 37 °C ved hjelp av en dedikert termostatmaskin. Den peristaltiske rullepumpen driver strømmen av perfusatet gjennom hele kretsløpet. Perfusjonskretsen starter ved det isolerte vannkappede reservoaret. Deretter ledes perfusatet gjennom oksygenatoren, som mottar en gassblanding av 95% oksygen og 5% karbondioksid fra en dedikert gassflaske. Etter oksygenering passerer perfusatet gjennom boblefellen, hvor eventuelle innesluttede bobler blir omdirigert tilbake til reservoaret av den peristaltiske pumpen. Det gjenværende perfusatet strømmer gjennom varmeveksleren og kommer inn i orgelkammeret, hvorfra det vender tilbake til reservoaret.
Her rapporterer vi våre erfaringer med å etablere en NEVLP for muselever og deler de lovende resultatene av et piloteksperiment utført ved bruk av det oksygenerte mediet uten oksygenbærere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk ble utført i henhold til gjeldende tyske forskrifter og retningslinjer for dyrevelferd og ARRIVEs retningslinjer for rapportering av dyreforsøk. Dyreforsøksprotokollen ble godkjent av Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Tyskland (godkjenningsnummer: UKJ - 17 - 106).
MERK: Mannlige C57BL/6J-mus som veide 34 ± 4 g (gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittet [SEM]) ble brukt som leverdonorer. De ble vedlikeholdt under kontrollerte miljøforhold (50 % fuktighet og 18–23 °C) med fri tilgang til standard musekhow og vann. Gjennom hele det kirurgiske inngrepet ble det opprettholdt en respirasjonsfrekvens over 60 pust/min, og kroppstemperaturen ble holdt over 34 °C.
1. Forberedelse
- Definere operasjonstabellen
- Autoklav alle kirurgiske instrumenter og forbruksvarer for steriliseringsformål.
- Slå på alt utstyr, inkludert varmebrett og elektrokoagulasjon.
- Plasser en 50 ml sprøyte med 25 ml heparinert (2 500 E/L) saltvann i en varm inkubator (37 °C).
- Plasser de kirurgiske instrumentene, 6-0 silkesuturen, sterilen liten bomullsapplikator, veterinær saltvann (500 ml) og ikke-vevde gasbindsvamper (10 cm x 10 cm) på operasjonsbordet på riktig måte.
- Plasser en 26 G kanyle på operasjonsbordet for å lage et lite hull i lokket på 0,5 ml mikrosentrifugerøret for å motta galleslangen for galleoppsamling.
- Plasser kanylen (1 Fr polyuretankanyle eller UT - 03 polyetylenkanyle) og et sterilisert 0,5 ml mikrosentrifugerør for galleoppsamling på operasjonsbordet.
- Selvfremstillet portalvenekanyle
- Hold 2 Fr kanylen med tang og punkter veggen med en 30 G nål i 1 cm avstand fra enden av kanylen. Trykk kanylen gjennom kanylen til kanylespissen blir synlig.
- Trim spissen av kanylen, noe som resulterer i en skarp trekant.
- Fremstilling av heparinisert saltvann
- Tilbered 25 ml heparinisert saltoppløsning med en endelig konsentrasjon på 2 500 IE/ml.
- Fjern alle luftbobler og legg sprøyten i 40 °C inkubatoren.
- Demonstrasjon av perfusjonssystemet
- Se figur 1 for hovedkomponentene i maskinens perfusjonssystem.
- Oppsett av orgelkammeret
- Se figur 2 for oppsett av orgelkammeret.
- Oppsett av perfusjonssystemet
- Slå på laboratoriekartprogrammet for trykkovervåking.
- Koble trykkkalibratoren og trykksensoren på organkammernivå.
- Juster trykkkalibratoren til å lese 0 mmHg og kontroller den tilsvarende verdien på trykkreguleringsprogramvaren.
- Juster trykkkalibratoren til å lese 20 mmHg og kontroller igjen den tilsvarende verdien på trykkreguleringsprogramvaren.
- Skru på vannbadet, og forvarm orgelkammeret til 40 °C.
- Skyll hele VVS-systemet to ganger med destillert avionisert vann i 30 minutter hver, og sørg for fullstendig fjerning av desinfiseringsløsningen.
- Start sirkulasjonen av desinfeksjonsløsningen gjennom hele systemet i en varighet på 20 minutter for å sikre grundig desinfeksjon.
- Slå på gassblandingen (95% oksygen (O2) og 5% karbondioksid (CO2).
- Perfusat fylling
- Tilsett 250 ml Williams 'E-medium med 50 ml føtal bovint serum, 3 ml penicillin / streptomycin (1 mg / ml), 0,17 ml insulin (100 IE / ml), 0,34 ml heparin (5000 U / ml) og 0,07 ml hydrokortison (100 mg / 2 ml) for å forberede hele Williams 'E-medium.
- Tilsett like store mengder (150 ml) perfusat til reservoaret og orgelkammeret for å klargjøre systemet.
MERK: Spesiell oppmerksomhet må tas for å opprettholde steriliteten under fyllingsprosessen. Perfusatet pumpes kontinuerlig gjennom disse to nøkkelkomponentene i perfusjonen i den lukkede resirkuleringsmaskinen. - Slå på den peristaltiske pumpen ved middels hastighet (15 ml/min) for å klargjøre perfusjonssystemet med det oksygenerte mediet.
2. Levereksplantasjon
- Pre-kirurgi forberedelse
- Vei dyret. Klargjør det smertestillende buprenorfinet (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg kroppsvekt).
- Koble induksjonskammeret til stikkontakten. Vri oksygen til 0,5 l/min. Skru isofluran til 3 %.
- Plasser dyret i kammeret til dyp anestesi (høyre refleks positiv) er nådd.
- Bruk en mikrosprøyte for å påføre kroppsvekttilpasset dose analgesi subkutant.
- Bruk en elektrisk barbermaskin for å trimme pelsen på magehuden.
- Overfør musen til operasjonsbordet og slå på isofluran fordamperen til 2,5% for å opprettholde anestesi. Bekreft dybden av anestesi ved å teste den interdigitale tårefleksen.
- Forberedelse av musemagen
- Plasser musen i liggende stilling.
- Test interdigital refleks for å dobbeltbekrefte riktig dybde av anestesi. Fest alle fire lemmer med tape.
- Desinfiser begge sider av magen til midtaksillær linje ved hjelp av tre påfølgende runder med jodalkohol. Bruk ikke-vevd sterilisert gasbind for å dekke området rundt det kirurgiske feltet.
- Lag et 3 cm tverrsnitt 1 cm under xiphoid i bukområdet av musen ved hjelp av Metzenbaum baby saks og kirurgisk tang.
- Forleng hudsnittet bilateralt til midtaksillær linje på begge sider.
- Lag forsiktig et 2 cm langsgående snitt langs linea alba ved hjelp av vårsaks.
- Skjær gjennom bukmuskellaget med elektrokoagulasjon og Vannas vårsaks.
- Legg forsiktig et stykke vått gasbind for å beskytte leveren mot elektrokoagulasjon.
- Bruk en 6 - 0 silkesutur med den runde nålen for å trekke xiphoidprosessen for bedre eksponering av koronarligamentet.
- Bruk to ribbe retractors for å fullstendig eksponere bukhulen i musen.
- Flytt forsiktig tynntarmen ut av bukhulen med en våt bomullspinne for å fullstendig eksponere hilum.
- Vanlig preparat av gallekanalen
- Transekter falciforme, frene og gastrohepatiske leddbånd med skarp saks.
- Frigjør forsiktig den vanlige gallekanalen ved hjelp av fine buede tang uten tenner.
MERK: Den vanlige gallekanalen blir veldig lett skadet og går i stykker. Når den går i stykker, kan den ikke kanyleres. På grunn av retningen av den anatomiske posisjonen, er buede tang bedre å bli brukt. - Plasser to 6 - 0 silkesuturløkker over den vanlige gallekanalen som forberedelse til neste trinn.
- Vanlig gallekanalkanylering
- Punkter gallekanalen forsiktig med en 30 G nål. Bruk spisse buede tang for å forstørre det lille hullet slik at det passer til gallekanalkanyleringen.
- Bruk kanyleringstang for fartøy for å ta tak i gallekanalkanylen og skyv den inn i gallekanalen.
- Dobbelt fest kanylen med de forhåndsinnstilte 6 - 0 suturløkkene.
NOTAT: Under kanyleringen kjennes motstand av galle. Hvis kraften ikke er godt kontrollert, vil kanylen bli presset ut av galdeveiene ved trykket av galleutstrømning. Juster forsiktig dybden på kanylen. Hvis den er for dyp, kan den skade gallegangen, og hvis den ikke er dyp nok, kan den skli ut. - Vær oppmerksom på gallestrømmen i kanylen etter vellykket kanylering.
- Forberedelse av portalvene
- Klem portalvenen med flat tang og frigjør bindevevet forsiktig med buede tang. Ikke trekk hardt for å unngå å forårsake rive i portalvenen. Når portalvenen er skadet, er det vanskelig å kanylere portalvenen på nytt.
- Dissekere PV bare bedre enn bifurkasjonen og plasser den første sutursløyfen med 6 - 0 silkesutur på PV nær samløpet for senere bruk.
- Plasser den andre sutursløyfen for senere fiksering av PV så nær leverhilum som mulig.
- Portalvenekanylering
- Bruk en arteriell klips for å lukke den distale portvenen.
- Svært forsiktig, punkter portalvenen med en av de ovennevnte portalvenekanylene. Blodstrømmen kan tydelig observeres i kanylen etter en vellykket punktering.
- Fest PV-kanylen med den forhåndsplasserte 6 - 0 suturløkken.
- Rødme i leveren
- Øk isofluran til 5 % og avlive musen med en overdose inhalasjon av isofluran.
- Ta forvarmet heparin saltoppløsning fra inkubatoren. Fjern alle luftbobler som dannes inne i heparinisert saltvann.
- Fest sprøyten med forvarmet heparinisert saltvann i sprøytepumpen.
- Koble forlengelsesrøret til sprøytepumpen til kanylen i portvenen, juster hastigheten til 2 ml/min, og start leverspylingen.
- Vær oppmerksom på fargen på leveren ved slutten av spylingsprosedyren. Excise leveren når fargen blir til en homogen gul.
- Transekt diafragma, suprahepatisk vena cava inferior, infratisk vena cava i leveren, arteria lever, distal portvene og eventuelt gjenværende bindevev.
- Legg leveren i petriskålen.
3. Lever og kammer tilkobling
- Overføring av leveren
- Overfør leveren forsiktig inn i organkammeret ved hjelp av en petriskål.
- Hold en liten mengde saltvann i petriskålen for å forhindre at leveren tørker ut.
MERK: Portalvenen og gallegangen kan lett vrides under denne prosedyren, noe som kan påvirke leverperfusjon og galleoppsamling.
- Portalvenekanyleforbindelse
- Tilfør vanlig saltvann langsomt inn i portalvenekanylen med en sprøyte for å evakuere luftboblene i kanylen.
- Koble portalvenekanylen inn i perfusatutstrømningsrøret i organkammeret.
- Gallegangskanyle-tilkobling
- Før musens gallekanalkanyle gjennom ventilen til en gummihette som er koblet til orgelkammeret.
- Sett gallekanalkanylen inn i et ferdig forberedt 0,5 ml mikrorør med et lite hull i lokket.
- Plasser mikrorøret på leire utenfor orgelkammeret.
4. Juster strømningshastigheten i henhold til PV-trykk
- Slå på den peristaltiske pumpen fra 1 ml/min.
- Kontroller portalvenetrykkavlesningen for å justere strømningshastigheten.
- Oppretthold portvenetrykket i det fysiologiske området mellom 7 - 10 mmHg ved å justere strømningshastigheten.
MERK: Nominell strømningshastighet kan variere noe avhengig av bruk og plassering av rør.
5. Prøveinnsamling
- Hent innløpsperfusatprøver fra portvenens innstrømningsrør og utløpsperfusatprøver fra organkammeret i 3-timers intervaller.
- Samle prøver fra alle leverlapper for histologisk analyse ved slutten av perfusjonsperioden på 12 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering av kirurgisk prosedyre
Totalt 17 dyr ble brukt til dette forsøket: 14 mus ble ansatt for å optimalisere organinnkjøpsprosessen, inkludert kanylering av portvenen (PV) og gallegangen (BD), mens 3 mus ble brukt til å validere prosedyren (tabell 1). Histologiske resultater (figur 3) ble sammenlignet for å lette identifiseringen av optimal perfusjonstilstand.
Valg av perfusat
Et tidligere brukt hepatocytdyrkningsmedium ble valgt for denne studien10,11. Williams E-medium ble opprinnelig designet av Williams og Gunn som et serumredusert medium for langvarig in vitro-dyrking av modne rotteleverepitelceller12. Ikke desto mindre har det også funnet nytte i å støtte vekst og vedlikehold av gnagerhepatocytter13. Fetal bovine serum (FBS) er et mye brukt cellekulturtilskudd på grunn av sin rike sammensetning av essensielle næringsstoffer og vekstfaktorer som letter cellevekst, spredning og levedyktighet14. Komplett Williams E-medium ble brukt som parfysat (tab 2), som er supplert med 20 % føtal bovint serum, 1 % penicillin/streptomycin, 5000 U/L heparin, 50 U/L insulin og 0,010 g/l hydrokortison.
Utvalg av kanyle
Kanyleringsprosedyren involverte først kanylering av gallegangen (BD) for gallevæskeoppsamling, etterfulgt av kanylering av portvenen (PV). For BD-kanylering ble det opprinnelig brukt et UT-03 polypropylenrør med en ytre diameter på 0, 3 mm og en indre diameter på 0, 18 mm. På grunn av bekymringer angående potensiell BD-skade og den høyere risikoen for utilsiktet kateterforskyvning forbundet med den trimmede og stive UT-03-spissen, ble det imidlertid foretrukket 1 Fr polyuretanrør. Polyuretanrørene, med sitt mykere materiale og reduserte glatthet, ble ansett som mer egnet for BD-kanylering.
I utgangspunktet ble en 26 G polypropylen intravenøs nålkanyle brukt til kanylering av portvenen (PV). Fjerningen av nålen og påfølgende festing av kanylen til perfusjonsrøret resulterte imidlertid i dannelse av bobler, som hadde potensial til å blokkere de intrahepatiske sinusoidene. For å overvinne dette problemet ble en inneboende kanyle konstruert ved hjelp av en 30 G nål satt inn i den distale 1 cm av en 2 Fr polyuretankanyle. Denne selvfremstillede "nålstyrte kanylen" ble deretter satt inn i den distale PV over samløpet. Da kateteret ble plassert i PV, ble nålen langsomt trukket ut samtidig som røret ble ført frem. Enden av den selvlagde kanylen var koblet til perfusjonsrøret inne i kammeret. Bruk av et mykt materiale i denne kanyleringsteknikken ga en fordel ved å redusere risikoen for skade på fartøyets bakvegg.
Valideringsstudier
Innløps- og utløpsperfusatprøver ble utsatt for bestemmelse av pH- og kaliumnivåer. De oppnådde resultatene (figur 4) ble deretter sammenlignet med funnene rapportert i nyere publikasjoner15,16,17. Tre muselever ble perfusert med oksygenert og supplert med Williams E-medium i 12 timer. Gjennom hele denne perioden ble et stabilt perfusjonstrykk på 7 - 10 mmHg kontinuerlig registrert. Gjennomsnittlig pH var relativt stabil gjennom 12 timers perfusjon og varierte mellom 7,3 og 7,7. Gjennomsnittlige kaliumnivåer var også stabile gjennom perfusjonsperioden og varierte mellom 5,9 og 6,8 mmol/l (figur 4). PV-strømningshastigheten ble opprettholdt innenfor et område på 0,8 - 1,2 ml / min / g, avhengig av bruk og plassering av pumperør under eksperimentelle prosedyrer. Alle resultater observert ved leverperfusjon hos mus viste likheter med tidligere rapporterte observasjoner ved perfusjon hos rotter (tabell 3).
Vevsprøver ble tatt fra tre lever (N = 3) og utsatt for 12 timers perfusjon ved hjelp av optimalisert protokoll for HE-farging, etterfulgt av hel lysbildeskanning. Hver leverlapp ble skåret ved hjelp av en modifisert Suzuki-skår (tabell 4). Den klassiske Suzuki-poengsummen18 ble utvidet ved å inkorporere tre ekstra parametere: pyknose av kjerner, frigjøring av kar og tilstedeværelse av erytrocytter i sinusoider og store kar. Hver parameter ble gradert som fraværende (0), mild (1), moderat (2) og alvorlig (3). Sluttskår på 0 – 7 ble vurdert å reflektere god bevaring, 8 – 14 ble tatt som moderat bevaring og 14 – 21 indikerte dårlig konservering.
Bevaring av muselever ble vurdert basert på modifisert Suzuki-score. To medisinske eksperter gjorde en uavhengig vurdering av morfologien til de syv i de tre leverne (figur 5, figur 6, figur 7). Gjennomsnittet av de syv lappskårene for hver leverlapp ble beregnet; Lavere score indikerer en bedre bevart lever. De sakkyndiges vurderinger viste stor grad av samsvar. Spesielt, mens små avvik i poengene tildelt av de to ekspertene ble observert i vurderingen av pyknose av kjerner, påvirket disse variasjonene ikke de samlede scoringsresultatene signifikant.
I beste fall var leverparenkymet relativt intakt med en godt bevart typisk lobulær struktur, knapt til å skille fra en normal lever. Hepatocytter syntes levedyktige med tydelig synlige cellemembraner og runde kjerner. Imidlertid gjennomgikk noen kjerner pyknosis, og noen hepatiske sinusoider ble litt utvidet, noe som resulterte i en score på 4. (Figur 3, figur 6)
I verste fall ble den lobulære strukturen forvrengt, med kar løsrevet fra parenkymet og konfluent parenkymal nekrose. På mobilnivå ble cellulær vakuolisering og kjernepyknose åpenbar, spesielt i den perisentrale regionen. Videre ble mild til moderat vakuolisering observert. Opptil 30 % av hepatocytter var under nekrose med maksimal skår 14. (Figur 3, figur 7)
Tabell 1: Trinnvis etablering av perfusjonsmodell for muselever. Ulike komplikasjoner ble observert under etableringsprosessen på grunn av forskjeller i kanylestørrelse, materiale og posisjonering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Sammenligning av in vitro organkonserveringsmetoder 15,17,19,20,21,22. Optimalisering av parfysatvalg, valg av oksygenbærer og sammenligning av næringskomponenter er avgjørende under forskjellige lagringsforhold. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Hemodynamikk og blodgassanalyse hos normale rotter og rotter NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Den oppgitte informasjonen beskriver selektivt de hemodynamiske egenskapene til rottelever og nøkkelparametere for normoterm perfusjon in vitro. Spesielt kan rotteleverperfusjonen betraktes som optimal når PV-trykket vanligvis varierer fra 4 til 10 mmHg, og partialtrykket av oksygen i perfusatet som kommer inn i PV-området varierer fra 80 til 550 mmHg, og oppfyller de nødvendige kriteriene for vellykket in vitro rotteleverperfusjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: Modifisert Suzuki-score. Den modifiserte Suzuki-poengsummen som ble brukt i denne studien, utvider den klassiske Suzuki-poengsummen ved å inkorporere tre tilleggsparametere: pyknose av kjerner, løsrivelse av kar og tilstedeværelsen av erytrocytter i sinusoider og store kar. Hver parameter fikk karakter på en skala fra 0 (fraværende), 1 (mild), 2 (moderat) eller 3 (alvorlig). Den totale poengsummen, fra 0 til 8, indikerer god bevaring; 9 til 16 antyder moderat bevaring, og 17 til 24 indikerer dårlig bevaring. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 5: Valg av perfusatmedium, parfysatvolum og perfusjonstrykk basert på litteraturundersøkelse av NEVLP hos rotter (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. Normothermic maskinperfusjon i rottelever kan vise variabilitet på tvers av studier når det gjelder den spesifikke typen og volumet av perfusat som brukes, samt varigheten av perfusjonen. Ulike studier kan benytte varierende tilnærminger, for eksempel dialyse eller høyvolumperfusjon, i lengre perioder. Til tross for disse forskjellene viser parametere som portaltrykk, portalvenestrømningshastighet og partialtrykk av oksygen i perfusatet generelt minimal variasjon på tvers av de forskjellige metodene som brukes. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Figur 1: Skjematisk diagram over perfusjonssystemet. Nøkkelkomponentene er orgelkammeret, termostatmaskinen, rullepumpen, oksygenatoren og reservoaret. Perfusatet pumpes fra reservoaret av en peristaltisk pumpe inn i en oksygenator. Det er en uavbrutt gasstrøm på 95 % O2 og 5 % CO2 i oksygenatoren. Perfusatet passerer gjennom boblefellen, hvor eventuelle luftbobler i parfysatet fanges opp og pumpes tilbake til reservoaret. Det gjenværende parfysatet strømmer til orgelkammeret, hvor røret er koblet til portalvenen. Parfysatutstrømningen fra orgelkammeret ledes tilbake til reservoaret av den peristaltiske pumpen. Et galledreneringsrør er koblet til orgelkammeret for å samle galle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nærbilde av perfusjonskammeret. Orgelperfusjonskammeret består av et parfysatinntak og utløp, en boblefelle, en varmeveksler og en galleoppsamlingsport. Sanntidsovervåking av perfusatpumpetrykket oppnås ved hjelp av en trykksensor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Histologiske resultater av normale og perfunderte muselever. (A) Normal muselevermorfologi (kontroll). (B) Eksempel på best bevart morfologi som visualisert ved HE-farging etter 12 timers perfusjon. (C). Eksempel på verst bevart morfologi som visualisert ved HE-farging etter 12 timers perfusjon. Den svarte pilen indikerer vakuolisering, den røde pilen peker på sinusformet dilatasjon, den gule pilen viser pyknosis av kjerner og den grønne pilen spesifiserer vaskulær løsrivelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Perfusatanalyse. Ph (A) og kaliumnivå (B). Begge parametrene er stabile gjennom observasjonstidene på 12 timer, noe som indikerer konstante perfusjonsforhold Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Mindre leverskade som resulterer i en modifisert Suzuki-score 4-7. Etter 12 timer med NEVLP ble det gjort en semikvantitativ vurdering av levermorfologi. Prøver fra hver leverlapp ble vurdert og gradert separat, noe som resulterte i et område og en gjennomsnittlig score for hver lever, med høyest mulig score 4. Godt bevart levermorfologi med en skår fra 4-7 avhengig av leverlappen (gjennomsnitt = 5) (Skår 0-7: godt bevart levermorfologi, skår 8-14 moderat bevart morfologi, skår 15-21: dårlig bevart levermorfologi) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Moderat leverskade som resulterer i en modifisert Suzuki-score 7-14. Semikvantitativ vurdering av levermorfologi etter 12 timer med normoterm oksygenert maskinperfusjon i henhold til modifisert Suzuki-score. Moderat bevart morfologi med en skår fra 7 til 14 (gjennomsnitt = 11). (Skår 0-7: godt bevart levermorfologi, skår 8-14 moderat bevart morfologi, skår 15-21: dårlig bevart levermorfologi) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Mindre - moderat leverskade som resulterer i en modifisert Suzuki-score 5-11. Den inhomogene perfusjonen resulterte i lett til moderat bevart morfologi i ulike leverlapper, med skår fra 5 til 11 (gjennomsnitt = 8). (Skår 0-7: godt bevart levermorfologi, skår 8-14 moderat bevart morfologi, skår 15-21: dårlig bevart levermorfologi) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
De to avgjørende trinnene i levereksplantasjon er kanylering av portalvenen (PV) og den påfølgende kanylering av gallekanalen (BD). Disse trinnene er av avgjørende betydning for å sikre vellykket organuthenting og påfølgende perfusjons- eller transplantasjonsprosedyrer.
Utfordringer og løsninger
PV-kanylering gir tre utfordringer: skade på karveggen, forskyvning av kateteret og gjennomførbarhet av innføringsprosessen. Den delikate naturen til PV-karveggen gjør den utsatt for punktering og påfølgende blødning hvis den ikke håndteres forsiktig under kanylering. Videre reduserer blodtap fra PV portaltrykket, noe som gjør innsetting av PV-kanylen mer utfordrende. Videre kan en skade på portalveneveggen introdusere luftemboluser i det intrahepatiske vaskulære systemet. Derfor er det viktig å utøve presisjon og forsiktighet under PV-kanyleringsprosessen for å minimere risikoen for komplikasjoner.
Under PV-kanylering er risikoen for kateterforskyvning en vanlig bekymring, spesielt ved bruk av kanyler med glatte materialer. I forhold til polypropylen er bruken av polyuretankanyler gunstigere for PV-kanylering. Den myke og bøyelige naturen til polyuretan reduserer risikoen for kateterforskyvning eller tap betydelig, potensielt tilskrevet dets materielle egenskaper. I tillegg minimerer bruk av en myk kanyle sannsynligheten for å skade endotellaget av blodkar. I studien ble tre typer vaskulære tilgangskanyler, nemlig 24 G polypropylen, 26 G polypropylen og 2 Fr polyuretan, sammenlignet for PV-kanylering. Blant disse alternativene viste både 26 G og 2 Fr polyuretankanyler bedre kompatibilitet med størrelsen på musens PV. Mens 26 G-kanylen viste bedre anatomisk kompatibilitet, ble 2 Fr polyuretankanyle med en ytre diameter på 0,66 mm ansett som egnet for den tiltenkte applikasjonen på grunn av sine unike materialegenskaper, noe som effektivt minimerer risikoen for utilsiktet kateterløsing fra PV.
Når det gjaldt gjennomførbarheten av innsettingen, ble ulike teknikker testet. En måte er å klemme de proksimale og distale endene av PV, kutte et lite hull med fin saks og sette inn PV-kanylen. Denne teknikken nødvendiggjør involvering av en ekstra person på grunn av kompleksiteten og kravet til samtidige handlinger. Det er derfor ikke mulig for en enkelt mikrokirurg å utføre prosedyren uavhengig. Derfor er det nødvendig med et kateter med en indre nål og en ytre kanyle. Som beskrevet tidligere risikerer bruk av den kommersielt tilgjengelige stive og glatte 26 G polypropylenkanylen risikoen for å skli ut og risikere dannelse av luftbobler når kanylen kobles til spylesystemet. For å løse disse bekymringene ble et selvkonstruert "nålstyrt rørsystem" utviklet ved å stikke en 26 G nål fra et nålkateter inn i en lang og bøyelig polyuretan 2 Fr kanyle. Denne tilnærmingen gir tre viktige fordeler: (1) et kateterinnføringssystem, (2) et langt og fleksibelt rør og (3) gunstige materialegenskaper. I løpet av dette trinnet er det imidlertid viktig å være forsiktig for å forhindre at nålespissen kommer i kontakt med PV-veggen mens den beveger seg fremover, da dette kan forårsake irreversibel skade på karveggen.
BD-kanylering presenterte de samme tre utfordringene: skade på karveggen, forskyvning av kateteret og gjennomførbarhet av innføringsprosessen. Til slutt ble 1 Fr polyuretankanylen ansett som mer egnet enn UT - 03 polypropylenkanylen på grunn av dens gunstige materialegenskaper. Til tross for den litt mindre ytre diameteren til UT - 03-kanylen (0,30 mm) sammenlignet med 1 Fr termofølsomt polyuretanrør (0,33 mm), er polyuretanmaterialet stivt og mindre utsatt for bøyning. På den annen side gir 1 Fr-kanylen, som er myk og fleksibel, enklere innsetting og ble dermed vårt foretrukne valg. Men i tilfeller der BD-størrelsen er usedvanlig liten og ikke i stand til å imøtekomme den større 2 Fr-kanylen, forblir UT - 03-kanylen et levedyktig alternativ. I slike tilfeller må det tas særlig hensyn til å forhindre forskyvning av kanylen fra BD.
Som oppsummert i litteraturgjennomgangen (tabell 5), brukte de fleste eksperimentene 19,41,42,46 en portalstrømningshastighet på 1 - 3 ml / min / g lever. Strømningshastigheten bør imidlertid justeres for å opprettholde det fysiologiske portaltrykket i området 4 - 10 mmHg28. Høyt PV-trykk kan forårsake sinusformet dilatasjon og vaskulær løsrivelse. Lavt PV-trykk og lav PV-strømningshastighet kan resultere i lav strømningshypooksygenering med påfølgende mid-zonal til perisentral nekrose. Manipuleringen av PV-strømningshastigheten tjener funksjonen til å regulere PV-trykket, som kan variere i henhold til kanylen som brukes og leverens størrelse, og dermed nødvendiggjøre mindre justeringer av PV-strømningshastigheten. Så i denne studien ble perfusjon startet med en strømningshastighet på 1 ml / min / g lever, og samtidig ble PV-trykket overvåket ved hjelp av en blodtrykksmåler for å opprettholde fysiologisk PV-trykk ved å justere strømningshastigheten.
Under utviklingen av NEVLP-modellen ble det forsøkt å ytterligere forbedre oksygenforsyningen til den perfuserte leveren ved å tilsette vaskede røde blodlegemer til perfusatet. Likevel ble signifikant sedimentering av erytrocytter observert i det store kammer og reservoar, og derved redusert levering av oksygenbærere til orgelet under perfusjon. Videre ble skade på erytrocytter forårsaket av den mekaniske virkningen av den peristaltiske perfusjonspumpen, som driver perfusatet ved å komprimere et silisiumrør. Begge grunnene gjorde det lettere for oss å ikke bruke røde blodlegemer i dette eksperimentet. Perfluorkarbonbaserte oksygenbærere kan være i stand til å løse disse problemene47.
For å vurdere levedyktigheten av levertransplantatet under perfusjon, ble gallevæske fra mus samlet med 3 timers intervaller. Likevel er det vanskelig å samle galle via kateteret på grunn av den høye viskositeten til gallevæske fra mus. Dette kompenseres først av kapillærkreftene indusert av det fine 1 Fr polyuretankateteret plassert i BD. Imidlertid kunne bare ca. 20 μl gallevæske samles i løpet av den første timen av forsøket. I stedet for å drenere gjennom kanylen ble det observert retrograd fylling av galleblæren.
På slutten av 12-timers perfusjonsperioden ble galleblæren fylt med klar gallevæske som tyder på aktiv galleproduksjon under maskinperfusjon. Dette kan potensielt motvirkes ved å plassere et større rør i galleblæren.
I mellomtiden ble den histologiske skaden på den hepatiske cellulære og lobulære strukturen vurdert for å bestemme resultatet av bevaring. Det ble observert at selv i samme lever var bevaring inhomogen. Inhomogeniteten i strukturendringene tyder på at perfusjonen var heterogen i hele leveren (figur 5, figur 6, figur 7). Videre gir de histologiske funnene bevis på at det er levedyktig å bevare den strukturelle integriteten til muselevertransplantatet i en minimumsvarighet på 12 timer under maskinperfusjon. Tilstedeværelsen av intakt leverhistologi kan imidlertid bare hjelpe til med vurderingen, men kan ikke definitivt bestemme leverens funksjon og levedyktighet. Det skal bemerkes at nekrose, som den ultimate manifestasjonen av cellulær skade, kanskje ikke lett observeres til et senere stadium. Dermed kan stole utelukkende på histologisk vurdering ikke gi en helhetlig forståelse av leverens funksjonelle status og levedyktighet. Andre komplementære analyser og evalueringer er nødvendige for å fastslå den generelle tilstanden til leveren, inkludert funksjonelle analyser, biokjemiske markører og vurdering av metabolsk aktivitet.
God konservering ble oppnådd etter 12 timers perfusjon. Men ytterligere forlengelse av perfusjonstiden som muligens nødvendig for organreparasjon krever å ta opp noen problemer. For det første bør det bemerkes at for å oppnå langvarig perfusjonsvarighet på over 12 timer vil det være nødvendig å opprettholde sterile forhold i stedet for bare rene forhold. I disse første forsøkene var imidlertid fokuset på å opprettholde rene forhold i stedet for sterile forhold, da sikring av sterilitet ville introdusere ytterligere kompleksiteter i prosedyren. For det andre vil lengre perfusjon muligens kreve å legge til en dialyseenhet, som beskrevet av Herman Tolboom22, for å fjerne akkumulerende giftige metabolske avfallsprodukter. De brukte et system med et totalt volum på 55 - 60 ml for å perfusere en rottelever på 10 g i 4 timer. I denne studien ble et relativt stort reservoar med et totalvolum på 300 ml utnyttet til tross for den lille størrelsen på museleveren, som veier ca. 1 g. Denne konfigurasjonen resulterte i en ytterligere fortynningsfaktor på 50 ganger. Bemerkelsesverdig nok ble det ikke observert noen skadelige effekter i løpet av den 12 timers perfusjonsperioden med dette oppsettet. For det tredje vil lengre perfusjon også kreve tilsetning av oksygenbærere, i beste fall i form av kunstig hemoglobin for å sikre tilstrekkelig oksygenforsyning, som beskrevet av Dondossola et al.47 og Jägers et al.48.
Utviklingen av "ikke-iskemisk" levertransplantasjon basert på NEVLP har utvilsomt brakt nye ideer og metoder for å løse eller til og med forhindre problemet med iskemi-reperfusjonsskade. Imidlertid er NEVLP et veldig lovende konsept for å forbedre organbevaring og dens potensielle anvendelse for å utvide organbevaring til organreparasjon47.
For tiden brukes tre forskjellige teknikker for maskinperfusjon eksperimentelt og klinisk. Hovedforskjellen er arbeidstemperaturen: hypoterm maskinperfusjon, subnomorm maskinperfusjon og normoterm maskinperfusjon (tabell 2). Andre forskjeller inkluderer valg av konserveringsløsning, perfusatløsning og tilsetning av oksygenbærere (tabell 5).
NEVLP er hovedsakelig en fordel fordi (1) organet opprettholdes ved normal temperatur, (2) det er oksygenert og (3) det er metabolsk fullt tilført. Systemet gir en utmerket plattform for diagnostisk evaluering, intervensjonsterapi og til slutt organreparasjon49. NEVLP utgjør imidlertid en stor utfordring for ex vivo-orgelstøtteteknologien. Utfordringen for NEVLP er å speile den nær-fysiologiske tilstanden. Inntil nylig, på grunn av den lille størrelsen og mangelen på standard evalueringskriterier, ble bare et begrenset antall gnagere NEVLP-studier utført 25,26,27,28,29,30,31.
Det har blitt demonstrert her at musemodellen er en gyldig modell som tillater en bevaringstid på 12 timer. Til sammenligning har de fleste rottestudier rapportert perfusjonstider på 6 timer eller mindre28,33. I tillegg er bruk av små dyr en fordel for molekylære studier sammenlignet med store dyr på grunn av tilgjengeligheten av rikelig reagenser og lavere eksperimentelle kostnader. For eksempel er mus for tiden et foretrukket alternativ for å teste knockout-modeller av ATG-genfamilien, spesielt for å studere signalveier for iskemi-reperfusjonsskade i leveren 8,50.
Eksperimenter på rottelever angående NEVLP har vist at normoterm maskinperfusjonsbevaring er assosiert med redusert hepatocellulær skade og forbedret tidlig overlevelse etter transplantasjon sammenlignet med kuldebevaring 31,40,51,52,53,54. NEVLP ved bruk av rottelever er også egnet for å studere tilsetninger av stoffer eller celler til parfysatet. Et imponerende eksempel er studiet av Xuan Tian26, som brukte heme oxygenase-1 modifiserte mesenkymale stamceller kombinert med normoterm maskinperfusjon for å forbedre kvaliteten på levertransplantater via Wnt-signalveien. Haojie Wang, 39, har bekreftet i sin nylige studie at tilsetning av benmarg mesenkymale stamceller til perfusatet kan forbedre kvaliteten på NEVLP hos rotter for kortvarig perfusjon. I studien ved bruk av DCD-lever hemmet benmargsmesenkymale stamceller kombinert med NEVLP leversinusformet overbelastning og endotelskade. Tilsetning av mesenkymale stamceller forhindret intrahepatisk makrofagaktivering og intercellulær adhesjon. Videre regulerte tilsetningen av mesenkymale stamceller endotelin-1 / endotelial nitrogenoksidbalanse for å forbedre leverperfusjon og mikrosirkulasjon.
Mus gir en klar fordel i forhold til rotter når det gjelder NEVLP, spesielt i sammenheng med molekylære studier fokusert på transgene eller genetisk modifiserte lever. På grunn av dyrets lille størrelse utgjør prosedyren imidlertid en større, men håndterbar utfordring for mikrokirurgen37.
Karaktersystem for histologisk vurdering
Den histologiske vurderingen er avgjørende for å bestemme betydningen av perfusjonsbetingelser på transplantatets morfologiske integritet.
Mens Suzuki-poengsummen ofte brukes i studier som vurderer leverpatologi, har det blitt bemerket at dette scoringssystemet kanskje ikke tilstrekkelig fanger opp de spesifikke funnene som er observert i ex vivo leverbevaring. For å møte denne begrensningen ble det innført ytterligere fire kriterier for å forbedre den omfattende evalueringen av bevart levervev (tab 4). For det første ble inkluderingen av nukleær pyknosevurdering implementert, da den tjener som en verdifull parameter som indikerer cellulær skade. For det andre ble evalueringen av kar- og hepatocyttavløsning, som betyr skade på leverlobulen, innlemmet som et ekstra kriterium. Til slutt ble graderingen av erytrocytters tilstedeværelse i sinusoider benyttet som en indikator på heterogen rødme og perfusjon. Ved å inkorporere disse supplerende kriteriene ble det oppnådd en mer nyansert og nøyaktig vurdering av det bevarte levervevets tilstand, noe som ga en dypere forståelse av effekten av ex vivo leverbevaring.
Hepatocyttvakuolisering55 oppstår etter endringer i substratbruk, energiforbruk, mikrotubulioppløsning og hemming av proteinsyntese. Kjernen til hepatocytten er tvunget til å skifte mot periferien av cellen av store vakuoler. Denne prosessen er ofte ledsaget av kjernefysisk pyknosis. I denne studien førte 12 timer normoterm maskinperfusjon til forskjellige grader av vakuolisering av hepatocytter sammenlignet med kontrollen som tyder på inhomogen perfusjon.
Tilstedeværelsen av dilaterte sinusoider mellom hepatocyttstrengene var bemerkelsesverdig i denne studien. Dette fenomenet oppstår primært fra hepatisk venøs utstrømningsobstruksjon, noe som fører til vaskulær stase og overbelastning i leverparenkymet. I denne muselevermodellen kan utfordringene forbundet med å opprettholde et konsistent portalperfusjonstrykk på grunn av organets lille størrelse bidra til observert dilatasjon av leversinusoider.
Nekrotiske endringer manifesterer seg vanligvis i celleklynger, regionale områder eller bestemte soner. Det godt gjennomsyrede periportale området viste relativt bedre bevaring av hepatocytter sammenlignet med det perisentrale området. Leverperfusjon med to kar, som demonstrert i rottelever20, gir en større utfordring i muselever på grunn av den lille størrelsen på leverarterien. Følgelig kan den observerte inhomogene perfusjonen av museleveren tilskrives, i det minste delvis, til denne begrensningen.
Disse observasjonene er ikke eksklusive for muselever som gjennomgår NEVLP, men kan også visualiseres i histologiske bilder fra andre NEVLP-studier, selv om de kanskje ikke er eksplisitt beskrevet.
Viktigheten og potensielle anvendelser av mus NEVLP
NEVLP av muselever er en utfordrende, men gjennomførbar prosedyre. Videre innsats er nødvendig for å utnytte denne teknologien best mulig for å belyse mekanismen bak den gunstige effekten av NEVLP. Forbedring av vår kunnskap vil legge til rette for den progressive utviklingen av denne teknologien, og overføre den utover organbevaring mot riket av "organreparasjon".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen økonomiske interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Gjennom skrivingen av denne artikkelen har jeg fått mye støtte og hjelp. Jeg vil spesielt takke min lagkamerat XinPei Chen for hans fantastiske samarbeid og tålmodige støtte under operasjonen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B.
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. 3rd Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N.
- van der, V. alk J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) - farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von,, Horn, C., Zlatev, H., Pletz, J., Lüer, B., Minor, T. Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William's E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
