Summary
Um sistema normotérmico ex vivo de perfusão hepática (NEVLP) foi criado para fígados de camundongos. Este sistema requer experiência em microcirurgia, mas permite resultados reprodutíveis de perfusão. A capacidade de utilizar fígados de camundongos facilita a investigação de vias moleculares para identificar novos aditivos de perfusato e permite a execução de experimentos focados no reparo de órgãos.
Abstract
Este protocolo apresenta um sistema NEVLP livre de eritrócitos otimizado usando fígados de camundongos. A preservação ex vivo de fígados de camundongos foi obtida empregando-se cânulas modificadas e técnicas adaptadas de equipamentos comerciais convencionais de perfusão ex vivo . O sistema foi utilizado para avaliar os resultados de preservação após 12 h de perfusão. Camundongos C57BL/6J serviram como doadores de fígado, e os fígados foram explantados canulando a veia porta (VP) e o ducto biliar (BD) e, posteriormente, lavando o órgão com solução salina heparinizada aquecida (37 °C). Em seguida, os fígados explantados foram transferidos para a câmara de perfusão e submetidos à máquina de perfusão oxigenada normotérmica (NEVLP). Amostras de perfusato de entrada e saída foram coletadas em intervalos de 3 h para análise do perfusato. Ao término da perfusão, amostras de fígado foram obtidas para análise histológica, com integridade morfológica avaliada pelo Suzuki-Score modificado através da coloração pela Hematoxilina-Eosina (HE). Os experimentos de otimização produziram os seguintes achados: (1) camundongos pesando mais de 30 g foram considerados mais adequados para o experimento devido ao maior tamanho de seu ducto biliar (BD). (2) uma cânula de poliuretano 2 Fr (diâmetro externo = 0,66 mm) foi mais adequada para canulação da veia porta (VP) quando comparada a uma cânula de polipropileno. Isso foi atribuído à maior aderência do material de poliuretano, resultando em menor deslizamento do cateter durante a transferência do corpo para a câmara do órgão. (3) para a canulação do ducto biliar (BD), uma cânula de poliuretano 1 Fr (diâmetro externo = 0,33 mm) mostrou-se mais eficaz em comparação com a cânula de polipropileno UT - 03 (diâmetro externo = 0,30 mm). Com este protocolo otimizado, fígados de camundongos foram preservados com sucesso por uma duração de 12 h sem impacto significativo na estrutura histológica. A coloração pela hematoxilina-eosina (HE) revelou uma arquitetura morfológica do fígado bem preservada, caracterizada por hepatócitos predominantemente viáveis com núcleos claramente visíveis e discreta dilatação dos sinusóides hepáticos.
Introduction
O transplante hepático representa o tratamento padrão-ouro para indivíduos com doença hepática terminal. Lamentavelmente, a demanda por órgãos de doadores supera a oferta disponível, levando a uma escassez significativa. Em 2021, aproximadamente 24.936 pacientes estavam na lista de espera por um enxerto de fígado, enquanto apenas 9.234 transplantes foram realizados com sucesso1. A significativa disparidade entre a oferta e a demanda de enxertos hepáticos destaca a necessidade premente de investigar estratégias alternativas para ampliar o pool de doadores e melhorar a acessibilidade dos enxertos hepáticos. Uma forma de ampliar o pool de doadores é utilizar doadores marginais2. Os doadores marginais incluem aqueles com idade avançada, esteatose moderada ou grave. Embora o transplante de órgãos marginais possa produzir resultados favoráveis, os resultados gerais permanecem subótimos. Como resultado, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visem melhorar a função de doadores marginais está atualmente em andamento 3,4.
Uma das estratégias é utilizar a máquina de perfusão, especialmente a máquina de oxigenação normotérmica, para melhorar a função desses órgãos marginais5. No entanto, ainda há uma compreensão limitada dos mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos benéficos da perfusão de máquina oxigenada normotérmica (NEVLP). Camundongos, com sua abundante disponibilidade de cepas geneticamente modificadas, servem como modelos valiosos para a investigação de vias moleculares. Por exemplo, a importância das vias de autofagia na atenuação da lesão de isquemia-reperfusão hepática tem sido cada vez maisreconhecida6,7. Uma importante via molecular na lesão de isquemia-reperfusão hepática éa via miR-20b-5p/ATG78. Atualmente, há uma série de linhagens de camundongos knockout e knock-out condicional disponíveis para ATG, mas nenhuma cepa de rato correspondente9.
Com base nesse contexto, o objetivo foi gerar uma plataforma NEVLP miniaturizada para enxertos hepáticos de camundongos. Essa plataforma facilitaria a exploração e avaliação de potenciais estratégias geneticamente modificadas destinadas a melhorar a funcionalidade do fígado do doador. Além disso, era essencial que o sistema fosse adequado para perfusão a longo prazo, possibilitando o tratamento ex vivo do fígado, comumente referido como "reparo de órgãos".
Considerando a disponibilidade limitada de dados in vitro relevantes sobre a perfusão hepática em camundongos, a revisão da literatura concentrou-se em estudos realizados em ratos. Uma busca sistemática da literatura de 2010 a 2022 foi realizada usando palavras-chave como "normothermic liver perfusion", "ex vivo or in vitro" e "rats". Esta pesquisa teve como objetivo identificar condições ótimas em roedores, permitindo determinar a abordagem mais adequada.
O sistema de perfusão consiste de um reservatório tampão de vidro vedado com camisa d'água, uma bomba de rolos peristálticos, um oxigenador, um coletor de bolhas, um trocador de calor, uma câmara de órgãos e um sistema fechado de tubos de ciclagem (Figura 1). O sistema garante a manutenção precisa de uma temperatura de perfusão constante de 37 °C usando uma máquina termostática dedicada. A bomba de rolos peristálticos conduz o fluxo do perfusato por todo o circuito. O circuito de perfusão inicia-se no reservatório isolado encamisado de água. Posteriormente, o perfusato é direcionado através do oxigenador, que recebe uma mistura gasosa de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono de uma garrafa de gás dedicada. Após a oxigenação, o perfusato passa através da armadilha de bolhas, na qual quaisquer bolhas aprisionadas são redirecionadas de volta para o reservatório pela bomba peristáltica. O perfusato remanescente flui através do trocador de calor e entra na câmara do órgão, de onde retorna ao reservatório.
Aqui, relatamos nossas experiências no estabelecimento de uma NEVLP para fígados de camundongos e compartilhamos os resultados promissores de um experimento piloto realizado usando o meio oxigenado sem carreadores de oxigênio.
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Protocol
Os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos e diretrizes alemães atuais para o bem-estar animal e as diretrizes ARRIVE para relatar pesquisas com animais. O protocolo de experimentação animal foi aprovado pelo Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turíngia, Alemanha (Número de aprovação: UKJ - 17 - 106).
NOTA: Camundongos machos C57BL/6J pesando 34 ± 4 g (média ± erro padrão da média [EPM]) foram utilizados como doadores de fígado. Eles foram mantidos sob condições ambientais controladas (50% de umidade e 18 - 23 °C) com livre acesso à ração padrão e água. Durante todo o procedimento cirúrgico, manteve-se a frequência respiratória superior a 60 ciclos/min e a temperatura corporal foi mantida acima de 34 °C.
1. Preparo
- Configurando a tabela de operações
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e consumíveis para fins de esterilização.
- Ligue todos os equipamentos, incluindo a placa de aquecimento e eletrocoagulação.
- Colocar uma seringa de 50 mL com 25 mL de solução salina heparinizada (2.500 U/L) em estufa aquecida (37 °C).
- Colocar os instrumentais cirúrgicos, a sutura de seda 6 - 0, aplicador pequeno de algodão estéril, soro fisiológico veterinário (500 mL) e compressas de gaze não tecida (10 cm x 10 cm) sobre a mesa de operação adequadamente.
- Coloque uma agulha 26 G na mesa de operação para criar um pequeno orifício na tampa do tubo de microcentrífuga de 0,5 mL para receber o tubo biliar para coleta de bile.
- Colocar a cânula (cânula de poliuretano 1 Fr ou cânula de polietileno UT - 03) e um tubo de microcentrífuga esterilizado de 0,5 mL para coleta de bile na mesa de operação.
- Cânula autoconfeccionada da veia porta
- Segurar a cânula de 2 Fr com pinça e puncionar a parede com uma agulha de 30 G a uma distância de 1 cm da extremidade da cânula. Empurre a agulha através da cânula até que a ponta da agulha fique visível.
- Corte a ponta da cânula resultando em um triângulo afiado.
- Preparo de solução salina heparinizada
- Preparar 25 mL de solução salina heparinizada com concentração final de 2.500 UI/mL.
- Retire todas as bolhas de ar e coloque a seringa na incubadora a 40 °C.
- Demonstração do sistema de perfusão
- Veja a Figura 1 para os principais componentes do sistema de perfusão da máquina.
- Instalação da câmara de órgãos
- Veja a Figura 2 para o layout da câmara de órgãos.
- Configuração do sistema de perfusão
- Ative o programa de gráfico de laboratório para monitoramento de pressão.
- Conecte o calibrador de pressão e o sensor de pressão no nível da câmara do órgão.
- Ajuste o calibrador de pressão para ler 0 mmHg e verifique o valor correspondente no software de controle de pressão.
- Ajuste o calibrador de pressão para ler 20 mmHg e verifique novamente o valor correspondente no software de controle de pressão.
- Ligue o banho-maria e pré-aqueça a câmara de órgãos a 40 °C.
- Lave todo o sistema de encanamento duas vezes com água destilada deionizada por 30 min cada, garantindo a remoção completa da solução sanitizante.
- Inicie a circulação da solução de desinfecção por todo o sistema por uma duração de 20 minutos para garantir a desinfecção completa.
- Ligue a mistura de gases (95% de oxigênio (O 2) e 5% de dióxido de carbono (CO2).
- Enchimento com perfusato
- Suplemento de 250 mL de meio Williams' E com 50 mL de soro fetal bovino, 3 mL de penicilina/estreptomicina (1 mg/mL), 0,17 mL de insulina (100 IE/mL), 0,34 mL de heparina (5000 U/mL) e 0,07 mL de hidrocortisona (100 mg/2 mL) para preparar o meio E completo de Williams.
- Adicionar volumes iguais (150 mL) de perfusato ao reservatório e à câmara orgânica para preparar o sistema.
OBS: Atenção especial deve ser dada à manutenção da esterilidade durante o processo de enchimento. O perfusato é constantemente bombeado através desses dois componentes-chave da perfusão da máquina recirculante fechada. - Ligar a bomba peristáltica em velocidade média (15 mL/min) para iniciar o sistema de perfusão com o meio oxigenado.
2. Explante hepático
- Preparo pré-operatório
- Pese o animal. Preparar o analgésico buprenorfina (0,3 mg/mL) (0,05 mg/kg de peso corporal).
- Conecte a câmara de indução com o soquete de parede. Vire o oxigênio para 0,5 L/min. Vire isoflurano para 3%.
- Colocar o animal na câmara até que se atinja a anestesia profunda (reflexo de retificação positivo).
- Use uma microseringa para aplicar dose de analgesia adaptada ao peso corporal por via subcutânea.
- Use um barbeador elétrico para aparar o pelo na pele abdominal.
- Transfira o mouse para a mesa de operação e ligue o vaporizador de isoflurano a 2,5% para manter a anestesia. Confirme a profundidade da anestesia testando o reflexo interdigital do dedo.
- Preparação do abdome do rato
- Coloque o rato em decúbito dorsal.
- Teste o reflexo interdigital para confirmar a profundidade adequada da anestesia. Fixe os quatro membros com fita adesiva.
- Desinfetar ambos os lados do abdome até a linha axilar média usando três rodadas consecutivas de iodo-álcool. Use gaze esterilizada não tecida para cobrir a área ao redor do campo cirúrgico.
- Faça uma incisão transversal de 3 cm 1 cm abaixo do xifoide na área abdominal do camundongo usando tesoura de bebê Metzenbaum e pinça cirúrgica.
- Estender a incisão da pele bilateralmente à linha axilar média em ambos os lados.
- Faça cuidadosamente uma incisão longitudinal de 2 cm ao longo da linha alba usando uma tesoura de mola.
- Corte a camada muscular abdominal com eletrocoagulação e tesoura de mola Vannas.
- Coloque cuidadosamente um pedaço de gaze úmida para proteger o fígado da eletrocoagulação.
- Use uma sutura de seda 6 - 0 com a agulha redonda para retrair o processo xifoide para melhor exposição do ligamento coronariano.
- Use dois afastadores de costela para expor totalmente a cavidade abdominal do mouse.
- Mova cuidadosamente o intestino delgado para fora da cavidade abdominal com um cotonete molhado para expor totalmente o hilo.
- Preparação do ducto biliar comum
- Transeccionar os ligamentos falciformes, frênicos e gastro-hepáticos com tesouras afiadas.
- Liberte cuidadosamente o ducto biliar comum usando pinças curvas finas sem dentes.
NOTA: O ducto biliar comum é muito facilmente danificado e quebra. Uma vez que quebra, não pode ser canulado. Devido à direção da posição anatômica, pinças curvas são melhores para serem utilizadas. - Coloque duas alças de sutura de seda 6 - 0 sobre o ducto biliar comum em preparação para o próximo passo.
- Canulação do ducto biliar comum
- Puncione cuidadosamente o ducto biliar com uma agulha de 30 G. Use pinças curvas pontiagudas para ampliar o pequeno orifício para encaixar a canulação do ducto biliar.
- Use pinça de canulação do vaso para agarrar a cânula do ducto biliar e empurrá-la para dentro do ducto biliar.
- Dupla fixação da cânula com alças de sutura predefinidas 6 - 0.
NOTA: Durante a canulação, a resistência pela bile é sentida. Se a força não for bem controlada, a cânula será empurrada para fora do trato biliar pela pressão de saída da bile. Ajuste cuidadosamente a profundidade da cânula. Se for muito profundo, pode danificar o ducto biliar e, se não for profundo o suficiente, pode escapar. - Observe o fluxo biliar na cânula após a canulação bem-sucedida.
- Preparo da veia porta
- Aperte a veia porta com pinça plana e libere cuidadosamente o tecido conjuntivo com pinça curva. Não puxe com força para evitar causar ruptura da veia porta. Uma vez que a veia porta é lesada, é difícil recanular a veia porta.
- Dissecar o VP logo superior à bifurcação e colocar a primeira alça de sutura com fio de seda 6 - 0 no PV próximo à confluência para uso posterior.
- Colocar a segunda alça de sutura para posterior fixação das VVPP o mais próximo possível do hilo hepático.
- Canulação da veia porta
- Use um clipe arterial para fechar a veia porta distal.
- Com muito cuidado, puncione a veia porta com uma das cânulas da veia porta acima. O fluxo sanguíneo pode ser claramente observado dentro da cânula após uma punção bem-sucedida.
- Fixar a cânula PV com a alça de sutura 6 - 0 pré-colocada.
- Rubor hepático
- Aumentar o isoflurano para 5% e eutanasiar o rato com uma sobredose de inalação de isoflurano.
- Tome solução salina de heparina pré-aquecida da incubadora. Remova todas as bolhas de ar formadas no interior do soro fisiológico heparinizado.
- Fixe a seringa com soro fisiológico heparinizado pré-aquecido na bomba da seringa.
- Conecte o tubo de extensão da bomba de seringa à cânula da veia porta, ajuste a velocidade para 2 mL/min e inicie a lavagem hepática.
- Observe a cor do fígado no final do procedimento de lavagem. Excise o fígado uma vez que a cor se transforma em um amarelo homogêneo.
- Transeccionar o diafragma, a veia cava inferior supra-hepática, a veia cava infra-hepática, a artéria hepática, a veia porta distal e qualquer tecido conjuntivo remanescente.
- Coloque o fígado na placa de Petri.
3. Conexão do fígado e da câmara
- Transferência hepática
- Transfira cuidadosamente o fígado para a câmara do órgão usando uma placa de Petri.
- Mantenha uma pequena quantidade de soro fisiológico na placa de Petri para evitar que o fígado seque.
NOTA: A veia porta e o ducto biliar podem ser facilmente torcidos durante este procedimento, o que pode afetar a perfusão hepática e a coleção biliar.
- Conexão da cânula da veia porta
- Infundir lentamente soro fisiológico normal na cânula da veia porta com uma seringa para evacuar as bolhas de ar na cânula.
- Conecte a cânula da veia porta ao tubo de saída do perfusato na câmara do órgão.
- Conexão da cânula do ducto biliar
- Guie a cânula do ducto biliar do rato através da válvula de uma tampa de borracha que está conectada à câmara do órgão.
- Insira a cânula do ducto biliar em um microtubo pré-preparado de 0,5 mL com um pequeno orifício na tampa.
- Coloque o microtubo na argila fora da câmara do órgão.
4. Ajuste a taxa de fluxo de acordo com a pressão PV
- Ligue a bomba peristáltica a partir de 1 mL/min.
- Verifique a leitura da pressão da veia porta para ajustar a vazão.
- Manter a pressão da veia porta na faixa fisiológica entre 7 - 10 mmHg ajustando o fluxo.
NOTA: A vazão nominal pode variar ligeiramente dependendo do uso e posicionamento dos tubos.
5. Coleta de amostras
- Obter amostras de perfusato de entrada do tubo de entrada da veia porta e amostras de perfusato de saída da câmara de órgãos em intervalos de 3h.
- Coletar amostras de todos os lobos hepáticos para análise histológica ao final do período de perfusão de 12 h.
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Representative Results
Estabelecimento do procedimento cirúrgico
Um total de 17 animais foi utilizado para este experimento: 14 camundongos foram empregados para otimizar o processo de captação de órgãos, incluindo a canulação da veia porta (PV) e do ducto biliar (BD), enquanto 3 camundongos foram usados para validar o procedimento (Tabela 1). Os resultados histológicos (Figura 3) foram comparados para facilitar a identificação da condição ótima de perfusão.
Seleção do perfusato
Um meio de cultura de hepatócitos previamente utilizado foi selecionado para este estudo10,11. O meio E de William foi inicialmente projetado por Williams e Gunn como um meio com soro reduzido para cultivo in vitro prolongado de células epiteliais hepáticas maduras de ratos12. No entanto, também tem encontrado utilidade no suporte ao crescimento e manutenção de hepatócitos roedores13. O soro fetal bovino (SFB) é um suplemento de cultura celular amplamente empregado devido à sua rica composição de nutrientes essenciais e fatores de crescimento que facilitam o crescimento, proliferação e viabilidade celular14. O perfusato foi utilizado como perfusato completo de William (Tabela 2), que é suplementado com 20% de soro fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina, 5.000 U/L de heparina, 50 U/L de insulina e 0,010 g/L de hidrocortisona.
Seleção da cânula
O procedimento de canulação envolveu primeiramente a canulação do ducto biliar (BD) para coleta de líquido biliar, seguida da canulação da veia porta (VP). Para a canulação da BD, inicialmente foi utilizado um tubo de polipropileno UT-03 com diâmetro externo de 0,3 mm e diâmetro interno de 0,18 mm. No entanto, devido à preocupação com o potencial dano ao TB e ao maior risco de deslocamento involuntário do cateter associado à ponta UT-03 aparada e rígida, foi dada preferência aos tubos de poliuretano 1 Fr. Os tubos de poliuretano, com seu material mais macio e menor escorregamento, foram considerados mais adequados para a canulação da BD.
Inicialmente, foi utilizada uma cânula de agulha venosa de polipropileno 26G para canulação da veia porta (VP). Entretanto, a retirada da agulha e a posterior fixação da cânula ao tubo de perfusão resultaram na formação de bolhas, com potencial para obstruir os sinusóides intra-hepáticos. Para contornar essa questão, uma cânula de longa permanência foi construída com uma agulha 30G inserida nos 1 cm distais de uma cânula de poliuretano 2 Fr. Essa "cânula guiada por agulha" autoconfeccionada foi então inserida no VP distal acima da confluência. À medida que o cateter era posicionado dentro da VVPP, a agulha era retirada lentamente enquanto avançava simultaneamente o tubo. A extremidade da cânula autoconfeccionada foi conectada ao tubo de perfusão dentro da câmara. O uso de material mole nessa técnica de canulação proporcionou uma vantagem por reduzir o risco de lesão da parede posterior do vaso.
Estudos de validação
Amostras de perfusato de entrada e saída foram submetidas à determinação dos níveis de pH e potássio. Os resultados obtidos (Figura 4) foram então comparados com os achados relatados em publicações recentes15,16,17. Três fígados de camundongos foram perfundidos com oxigenado e suplementados com meio E de William por 12 h. Durante todo esse período, uma pressão de perfusão estável de 7 - 10 mmHg foi continuamente registrada. O pH médio manteve-se relativamente estável ao longo das 12 h de perfusão e variou entre 7,3 e 7,7. Os níveis médios de potássio também se mantiveram estáveis durante todo o período de perfusão e variaram entre 5,9 e 6,8 mmol/L (Figura 4). O fluxo PV foi mantido dentro de uma faixa de 0,8 - 1,2 mL/min/g, dependendo do uso e posicionamento dos tubos da bomba durante os procedimentos experimentais. Todos os resultados observados na perfusão hepática de camundongos demonstraram semelhanças com observações previamente relatadas na perfusão hepática de ratos (Tabela 3).
Amostras de tecido foram coletadas de três fígados (N = 3) e submetidas à perfusão de 12 h usando o protocolo otimizado para coloração HE, seguido de varredura total de lâminas. Cada lobo hepático foi pontuado usando um escore Suzuki modificado (Tabela 4). O escore clássico de Suzuki18 foi aumentado pela incorporação de três parâmetros adicionais: picnose de núcleos, descolamento de vasos e presença de eritrócitos em sinusóides e grandes vasos. Cada parâmetro foi classificado em ausente (0), leve (1), moderado (2) e grave (3). Um escore final de 0 - 7 foi considerado como refletindo boa preservação, 8 - 14 foi tomado como preservação moderada e 14 - 21 indicou má preservação.
A preservação do fígado de camundongos foi avaliada com base no escore Suzuki modificado. Dois médicos peritos realizaram uma avaliação independente da morfologia dos sete lobos dos três fígados (Figura 5, Figura 6, Figura 7). A média dos sete escores dos lobos para cada lobo do fígado foi calculada; Escores mais baixos indicam fígado mais bem preservado. As avaliações realizadas pelos peritos apresentaram alto grau de concordância. Notavelmente, embora pequenas discrepâncias nos escores atribuídos pelos dois especialistas tenham sido observadas na avaliação da picnose dos núcleos, essas variações não afetaram significativamente os resultados gerais da pontuação.
Na melhor das hipóteses, o parênquima hepático estava relativamente intacto, com uma estrutura lobular típica bem preservada, dificilmente distinguível de um fígado normal. Hepatócitos mostraram-se viáveis com membranas celulares claramente visíveis e núcleos redondos. Entretanto, alguns núcleos apresentaram picnose, e alguns sinusóides hepáticos estavam levemente dilatados, resultando em um escore de 4. (Figura 3, Figura 6)
Na pior das hipóteses, a estrutura lobular estava distorcida, com vasos descolados do parênquima e necrose parenquimatosa confluente. No nível celular, a vacuolização celular e a picnose dos núcleos tornaram-se evidentes, especialmente na região pericentral. Além disso, vacuolização leve a moderada foi observada. Até 30% dos hepatócitos estavam submetidos a necrose, resultando em um escore máximo de 14. (Figura 3, Figura 7)
Tabela 1: Passo a passo do estabelecimento de um modelo de perfusão hepática em camundongos. Várias complicações foram observadas durante o processo de estabelecimento devido a diferenças no tamanho, material e posicionamento da cânula. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Comparação dos métodos de preservação de órgãos in vitro 15,17,19,20,21,22. A otimização da seleção de perfusato, seleção de carreadores de oxigênio e comparação de componentes nutricionais é crucial sob várias condições de armazenamento. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: Análise hemodinâmica e gasométrica em ratos normais e NEVLP de ratos 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. As informações fornecidas descrevem seletivamente as características hemodinâmicas do fígado de ratos e os principais parâmetros da perfusão normotérmica in vitro. Especificamente, a perfusão hepática de ratos pode ser considerada ótima quando a pressão do PV tipicamente varia de 4 a 10 mmHg, e a pressão parcial de oxigênio no perfusato que entra no PV varia de 80 a 550 mmHg, preenchendo os critérios necessários para o sucesso da perfusão hepática in vitro do rato. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 4: Escore Suzuki modificado. O escore de Suzuki modificado utilizado neste estudo expande o escore clássico de Suzuki ao incorporar três parâmetros adicionais: picnose de núcleos, descolamento de vasos e presença de eritrócitos em sinusóides e grandes vasos. A cada parâmetro foi atribuída uma nota em uma escala de 0 (ausente), 1 (leve), 2 (moderado) ou 3 (grave). O escore total, variando de 0 a 8, indica boa conservação; 9 a 16 sugerem preservação moderada e 17 a 24 indicam má preservação. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 5: Seleção do meio de perfusato, volume do perfusato e pressão de perfusão com base em investigação da literatura sobre NEVLP em ratos (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. A perfusão normotérmica em máquina em fígado de ratos pode apresentar variabilidade entre os estudos em termos do tipo e volume específicos de perfusato utilizados, bem como da duração da perfusão. Diferentes estudos podem empregar abordagens variadas, como diálise ou perfusão de alto volume, por períodos prolongados. No entanto, apesar dessas diferenças, parâmetros como pressão portal, vazão da veia porta e pressão parcial de oxigênio no perfusato geralmente demonstram mínima variação entre os vários métodos empregados. Clique aqui para baixar esta tabela.
Figura 1: Diagrama esquemático do sistema de perfusão. Os principais componentes são a câmara de órgãos, a máquina termostática, a bomba de roletes, o oxigenador e o reservatório. O perfusato é bombeado do reservatório por uma bomba peristáltica para um oxigenador. Há um fluxo ininterrupto de gás de 95% de O2 e 5% de CO2 no oxigenador. O perfusato passa através da armadilha de bolhas, onde quaisquer bolhas de ar presentes no perfusato são capturadas e bombeadas de volta para o reservatório. O perfusato remanescente flui para a câmara do órgão, onde o tubo é conectado à veia porta. A saída do perfusato da câmara orgânica é direcionada de volta ao reservatório pela bomba peristáltica. Um tubo de drenagem biliar é conectado à câmara do órgão para coletar a bile. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Close-up da câmara de perfusão. A câmara de perfusão do órgão é composta por uma entrada e saída de perfusato, um coletor de bolhas, um trocador de calor e uma porta de coleta de bile. O monitoramento em tempo real da pressão da bomba de perfusato é realizado usando um sensor de pressão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados histológicos de fígados normais e perfundidos de camundongos. (A) Morfologia hepática normal de camundongos (controle). (B) Exemplo de morfologia mais bem preservada visualizada pela coloração HE após 12 h de perfusão. (C). Exemplo de morfologia pior preservada visualizada pela coloração HE após 12 h de perfusão. A seta preta indica vacuolização, a seta vermelha aponta para dilatação senoidal, a seta amarela mostra picnose de núcleos e a seta verde especifica descolamento vascular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise do perfusato. Ph (A) e potássio (B). Ambos os parâmetros são estáveis ao longo dos tempos de observação de 12 h, indicando condições de perfusão constantes Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Pequena lesão hepática resultando em um escore Suzuki modificado 4-7. Após 12 horas de NEVLP, uma avaliação semiquantitativa da morfologia hepática foi realizada. As amostras de cada lobo hepático foram avaliadas e graduadas separadamente, resultando em um intervalo e um escore médio para cada fígado, sendo o maior escore possível 4. Morfologia hepática bem preservada com escore variando de 4-7 dependendo do lobo hepático (média = 5) (Escore 0-7: morfologia hepática bem preservada, escore 8-14 morfologia moderadamente preservada, escore 15-21: morfologia hepática mal preservada) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Dano hepático moderado resultando em um escore Suzuki modificado de 7-14. Avaliação semiquantitativa da morfologia hepática após 12 horas de perfusão normotérmica oxigenada em máquina de acordo com o escore Suzuki modificado. Morfologia moderadamente preservada com escore variando de 7 a 14 (média = 11). (escore 0-7: morfologia hepática bem preservada, escore 8-14 morfologia moderadamente preservada, escore 15-21: morfologia hepática mal preservada) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Dano hepático leve - moderado, resultando em um escore Suzuki modificado 5-11. A perfusão não homogênea resultou em morfologia preservada de pequena a moderada nos diferentes lobos hepáticos, com escores variando de 5 a 11 (média = 8). (escore 0-7: morfologia hepática bem preservada, escore 8-14 morfologia moderadamente preservada, escore 15-21: morfologia hepática mal preservada) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Etapas críticas do protocolo
As duas etapas cruciais no explante hepático são a canulação da veia porta (VP) e a subsequente canulação do ducto biliar (BD). Essas etapas são de suma importância para garantir o sucesso da recuperação de órgãos e subsequentes procedimentos de perfusão ou transplante.
Desafios e soluções
A canulação das VVPP apresenta três desafios: lesão da parede do vaso, deslocamento do cateter e praticabilidade do processo de inserção. A natureza delicada da parede do vaso PV torna-o suscetível a punção e sangramento subsequente se não manuseado cuidadosamente durante a canulação. Além disso, qualquer perda sanguínea proveniente da VP reduz a pressão portal, tornando a inserção da cânula das VVPP mais desafiadora. Além disso, uma lesão na parede da veia portal pode introduzir êmbolos gasosos no sistema vascular intra-hepático. Portanto, exercitar a precisão e a cautela durante o processo de canulação das VVPP é fundamental para minimizar o risco de complicações.
Durante a canulação das VVPP, o risco de deslocamento do cateter é uma preocupação comum, principalmente quando se utilizam cânulas com materiais escorregadios. Em comparação ao polipropileno, o uso de cânulas de poliuretano é mais favorável para a canulação do PV. A natureza macia e maleável do poliuretano reduz significativamente o risco de deslocamento ou perda do cateter, potencialmente atribuído às suas propriedades materiais. Além disso, o uso de uma cânula macia minimiza a probabilidade de lesão da camada endotelial dos vasos sanguíneos. No estudo, três tipos de cânulas de acesso vascular, a saber, polipropileno 24G, polipropileno 26G e poliuretano 2Fr, foram comparados para canulação PV. Dentre essas opções, tanto as cânulas de poliuretano 26G quanto as 2 Fr demonstraram melhor compatibilidade com o tamanho do PV do camundongo. Enquanto a cânula 26G exibiu melhor compatibilidade anatômica, a cânula de poliuretano 2 Fr com diâmetro externo de 0,66 mm foi considerada adequada para a aplicação pretendida devido às suas propriedades materiais únicas, minimizando efetivamente o risco de deslocamento não intencional do cateter da VP.
Quanto à praticidade da inserção, diferentes técnicas foram testadas. Uma forma é pinçar as extremidades proximal e distal do VP, cortar um pequeno orifício com tesoura fina e inserir a cânula do VP. Esta técnica requer o envolvimento de uma pessoa adicional devido à complexidade e exigência de ações simultâneas. Consequentemente, não é viável que um único microcirurgião realize o procedimento de forma independente. Portanto, um cateter com uma agulha interna e uma cânula externa é necessário. Como descrito anteriormente, o uso da cânula de polipropileno 26 G rígida e lisa disponível comercialmente traz o risco de escorregar e arriscar a formação de bolhas de ar ao conectar a cânula ao sistema de descarga. Para atender a essas preocupações, um "sistema de tubo guiado por agulha" autoconstruído foi concebido inserindo uma agulha 26 G de um cateter de agulha em uma cânula longa e maleável de poliuretano 2 Fr. Essa abordagem oferece três vantagens principais: (1) um sistema de inserção de cateter, (2) um tubo longo e flexível e (3) propriedades favoráveis do material. No entanto, durante essa etapa, é fundamental ter cautela para evitar que a ponta da agulha entre em contato com a parede do PV durante o avanço, pois isso pode causar danos irreversíveis à parede do vaso.
A canulação da DB apresentou os mesmos três desafios: lesão da parede do vaso, deslocamento do cateter e praticidade do processo de inserção. Por fim, a cânula de poliuretano 1 Fr foi considerada mais adequada que a cânula de polipropileno UT - 03 devido às suas propriedades materiais favoráveis. Apesar do diâmetro externo ligeiramente menor da cânula UT - 03 (0,30 mm) em comparação com o tubo de poliuretano termossensível de 1 Fr (0,33 mm), o material de poliuretano é rígido e menos propenso a dobrar. Por outro lado, a cânula de 1 Fr, por ser macia e flexível, facilita a inserção e assim se tornou nossa escolha preferida. No entanto, nos casos em que o tamanho da BD é excepcionalmente pequeno e incapaz de acomodar a cânula maior de 2 Fr, a cânula UT - 03 permanece uma alternativa viável. Nesses casos, atenção especial deve ser dada para evitar o deslocamento da cânula da DB.
Conforme resumido na revisão da literatura (Tabela 5), a maioria dos experimentadores 19,41,42,46 utilizou fluxo portal de 1 - 3 mL/min/g de fígado. Entretanto, o fluxo deve ser ajustado para manter a pressão portal fisiológica na faixa de 4 - 10 mmHg28. A alta pressão do PV pode causar dilatação sinusoidal e descolamento vascular. Baixa pressão de PV e baixa taxa de fluxo de PV podem resultar em hipooxigenação de baixo fluxo com subsequente necrose médio-zonal a pericentral. A manipulação do fluxo PV tem a função de regular a pressão do PV, que pode variar de acordo com a cânula utilizada e o tamanho do fígado, necessitando assim de pequenos ajustes no fluxo PV. Assim, neste estudo, a perfusão foi iniciada com fluxo de 1 mL/min/g de fígado e, ao mesmo tempo, a pressão das VVPP foi monitorada com transdutor de pressão arterial para manter a pressão fisiológica das VVPP ajustando o fluxo.
Durante o desenvolvimento do modelo NEVLP, uma tentativa foi feita para melhorar ainda mais o fornecimento de oxigênio para o fígado perfundido, adicionando hemácias lavadas ao perfusato. No entanto, observou-se sedimentação significativa de eritrócitos na grande câmara e reservatório, reduzindo a oferta de carreadores de oxigênio ao órgão durante a perfusão. Além disso, o dano aos eritrócitos foi causado pela ação mecânica da bomba de perfusão peristáltica, que aciona o perfusato comprimindo um tubo de silicone. Ambas as razões facilitaram nossa decisão de não usar hemácias neste experimento. Carreadores de oxigênio à base de perfluorcarbono podem ser capazes de resolver esses problemas47.
Para avaliar a viabilidade do enxerto hepático durante a perfusão, o líquido biliar de camundongo foi coletado em intervalos de 3 h. No entanto, é difícil coletar bile através do cateter devido à alta viscosidade do líquido biliar de camundongo. Esta é inicialmente compensada pelas forças capilares induzidas pelo cateter fino de poliuretano 1 Fr colocado no BD. No entanto, apenas cerca de 20 μL de líquido biliar puderam ser coletados na primeira hora do experimento. Ao invés de drenagem pela cânula, observou-se enchimento retrógrado da vesícula biliar.
Ao final do período de 12 h de perfusão, a vesícula biliar foi preenchida com líquido biliar claro, sugerindo produção ativa de bile durante a perfusão da máquina. Isso pode ser potencialmente neutralizado colocando um tubo maior na vesícula biliar.
Enquanto isso, o dano histológico da estrutura celular e lobular hepática foi avaliado para determinar o resultado da preservação. Observou-se que, mesmo dentro de um mesmo fígado, a preservação foi não homogênea. A não homogeneidade das alterações estruturais sugere que a perfusão foi heterogênea em todo o fígado (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Além disso, os achados histológicos fornecem evidências de que é viável preservar a integridade estrutural do enxerto hepático de camundongos por uma duração mínima de 12 horas durante a perfusão da máquina. No entanto, a presença de histologia hepática intacta pode apenas auxiliar na avaliação, mas não pode determinar definitivamente a função e a viabilidade do fígado. Deve-se notar que a necrose, como a manifestação final do dano celular, pode não ser facilmente observável até um estágio posterior. Assim, confiar apenas na avaliação histológica pode não fornecer uma compreensão abrangente do estado funcional e da viabilidade do fígado. Outros ensaios e avaliações complementares são necessários para determinar a condição geral do fígado, incluindo ensaios funcionais, marcadores bioquímicos e avaliação da atividade metabólica.
Boa preservação foi obtida após 12 horas de perfusão. No entanto, estender ainda mais o tempo de perfusão, conforme possivelmente necessário para o reparo do órgão, requer a abordagem de algumas questões. Em primeiro lugar, deve-se notar que alcançar durações de perfusão de longo prazo superiores a 12 horas exigiria a manutenção de condições estéreis em vez de apenas condições limpas. No entanto, nesses experimentos iniciais, o foco foi manter condições limpas em vez de condições estéreis, pois garantir a esterilidade introduziria complexidades adicionais ao procedimento. Em segundo lugar, uma perfusão mais longa possivelmente exigiria a adição de uma unidade de diálise, como descrito por Herman Tolboom22, para remover os resíduos metabólicos tóxicos acumulados. Eles usaram um sistema com um volume total de 55 - 60 mL para perfundir um fígado de rato de 10 g por 4 h. Neste estudo, um reservatório relativamente grande com um volume total de 300 mL foi utilizado, apesar do pequeno tamanho do fígado de camundongo, que pesa aproximadamente 1 g. Essa configuração resultou em um fator de diluição adicional de 50 vezes. Notavelmente, nenhum efeito prejudicial foi observado durante o período de perfusão de 12 horas com essa configuração. Em terceiro lugar, uma perfusão mais longa também exigiria a adição de carreadores de oxigênio, na melhor das hipóteses na forma de hemoglobina artificial para garantir um suprimento adequado de oxigênio, como descrito por Dondossola et al.47 e Jägers et al.48.
O desenvolvimento do transplante hepático "não-isquêmico" baseado na PNEV trouxe, sem dúvida, novas ideias e métodos para resolver ou mesmo prevenir o problema da lesão de isquemia-reperfusão. No entanto, a NEVLP é um conceito muito promissor para melhorar a preservação de órgãos e sua potencial aplicação para estender a preservação de órgãos ao reparo de órgãos47.
Atualmente, três diferentes técnicas de perfusão em máquina são utilizadas experimentalmente e clinicamente. A principal diferença é a temperatura de trabalho: perfusão da máquina hipotérmica, perfusão da máquina subnomothermica e perfusão da máquina normotérmica (Tabela 2). Outras diferenças incluem a escolha da solução de preservação, da solução de perfusato e da adição de carreadores de oxigênio (Tabela 5).
A NEVLP é principalmente vantajosa porque (1) o órgão é mantido em sua temperatura normal, (2) é oxigenado e (3) é metabolicamente totalmente fornecido. O sistema fornece uma excelente plataforma para avaliação diagnóstica, terapia de intervenção e, finalmente, reparo de órgãos49. No entanto, a NEVLP representa um grande desafio para a tecnologia de suporte de órgãos ex vivo. O desafio para a NEVLP é espelhar a condição quase fisiológica. Até recentemente, devido ao pequeno tamanho e à falta de critérios padronizados de avaliação, apenas um número limitado de estudos com PPEV em roedores era realizado25,26,27,28,29,30,31.
Foi demonstrado aqui que o modelo de mouse é um modelo válido que permite um tempo de preservação de 12 horas. Em comparação, a maioria dos estudos em ratos relatou tempos de perfusão de 6 horas ou menos28,33. Além disso, o uso de animais de pequeno porte é vantajoso para estudos moleculares em relação aos animais de grande porte devido à disponibilidade de reagentes abundantes e ao menor custo experimental. Por exemplo, camundongos são atualmente uma opção preferencial para testar modelos knockout da família de genes ATG, especialmente para estudar vias de sinalização de lesão de isquemia-reperfusão no fígado 8,50.
Experimentos em fígados de ratos relacionados à NEVLP revelaram que a preservação da perfusão por máquina normotérmica está associada à redução do dano hepatocelular e melhora da sobrevida pós-transplante precoce em comparação com a preservação a frio 31,40,51,52,53,54. NEVLP usando fígados de rato também é adequado para estudar as adições de drogas ou células ao perfusato. Um exemplo impressionante é o estudo de Xuan Tian26, que utilizou células-tronco mesenquimais modificadas pela heme oxigenase-1 combinadas com perfusão em máquina normotérmica para melhorar a qualidade dos enxertos hepáticos via via de sinalização Wnt. HaojieWang39 confirmou em seu estudo recente que a adição de células-tronco mesenquimais da medula óssea ao perfusato pode melhorar muito a qualidade da NEVLP em ratos para perfusão de curto prazo. Em seu estudo usando fígados DCD, células-tronco mesenquimais da medula óssea combinadas com NEVLP inibiram a congestão sinusoidal hepática e a lesão endotelial. A adição de células-tronco mesenquimais impediu a ativação de macrófagos intra-hepáticos e a adesão intercelular. Além disso, a adição de células-tronco mesenquimais regulou o balanço endotelina-1/óxido nítrico endotelial para melhorar a perfusão e a microcirculação hepática.
Os camundongos oferecem uma vantagem distinta sobre os ratos quando se trata de NEVLP, particularmente no contexto de estudos moleculares focados em fígados transgênicos ou geneticamente modificados. No entanto, devido ao pequeno tamanho do animal, o procedimento representa um desafio maior, porém manejável, para o microcirurgião37.
Sistema de graduação para avaliação histológica
A avaliação histológica é decisiva para determinar o impacto das condições de perfusão na integridade morfológica do enxerto.
Embora o escore de Suzuki seja comumente utilizado em estudos que avaliam patologia hepática, observou-se que esse sistema de pontuação pode não capturar adequadamente os achados específicos observados na preservação hepática ex-vivo. Para resolver essa limitação, quatro critérios adicionais foram introduzidos para melhorar a avaliação abrangente do tecido hepático preservado (Tabela 4). Primeiramente, implementou-se a inclusão da avaliação da picnose nuclear, que serve como um valioso parâmetro indicativo de dano celular. Em segundo lugar, a avaliação do descolamento de vasos e hepatócitos, que significa dano ao lóbulo hepático, foi incorporada como critério adicional. Por fim, a graduação da presença de eritrócitos nos sinusóides foi utilizada como indicador de rubor e perfusão heterogêneos. Ao incorporar esses critérios suplementares, uma avaliação mais matizada e precisa da condição do tecido hepático preservado foi alcançada, proporcionando uma compreensão mais profunda dos efeitos da preservação hepática ex-vivo.
A vacuolização dos hepatócitos55 ocorre após alterações no uso do substrato, gasto energético, desintegração dos microtúbulos e inibição da síntese proteica. O núcleo do hepatócito é forçado a se deslocar para a periferia da célula por grandes vacúolos. Este processo é frequentemente acompanhado por picnose nuclear. Neste estudo, 12 h de perfusão normotérmica em máquina levaram a diferentes graus de vacuolização dos hepatócitos em relação ao controle, sugerindo perfusão não homogênea.
A presença de sinusóides dilatados entre os cordões dos hepatócitos foi notável neste estudo. Esse fenômeno decorre principalmente da obstrução do fluxo venoso hepático, levando à estase vascular e congestão dentro do parênquima hepático. Neste modelo de fígado de camundongo, os desafios associados à manutenção de uma pressão de perfusão portal consistente devido ao pequeno tamanho do órgão podem contribuir para a dilatação observada dos sinusóides hepáticos.
As alterações necróticas tipicamente se manifestam em aglomerados celulares, áreas regionais ou zonas específicas. A área periportal bem perfundida exibiu preservação relativamente melhor dos hepatócitos em comparação com a área pericentral. A perfusão hepática biarterial, como demonstrado em fígados deratos20, apresenta um desafio maior em fígados de camundongos devido ao pequeno tamanho da artéria hepática. Consequentemente, a perfusão não homogênea observada no fígado de camundongos pode ser atribuída, pelo menos em parte, a essa limitação.
Essas observações não são exclusivas de fígados de camundongos submetidos à NEVLP, mas também podem ser visualizadas em imagens histológicas de outros estudos de NEVLP, embora possam não ser explicitamente descritas.
Importância e Potenciais Aplicações do NEVLP em Camundongos
A NEVLP de fígados de camundongos é um procedimento desafiador, mas viável. Mais esforços são necessários para fazer o melhor uso dessa tecnologia para elucidar o mecanismo subjacente ao efeito benéfico da NEVLP. Aprimorar nosso conhecimento facilitará a evolução progressiva dessa tecnologia, fazendo a transição da preservação de órgãos para o âmbito do "reparo de órgãos".
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Disclosures
Não há conflitos de interesse financeiros a serem divulgados.
Acknowledgments
Ao longo da redação deste artigo, recebi muito apoio e assistência. Eu particularmente gostaria de agradecer ao meu companheiro de equipe XinPei Chen por sua maravilhosa colaboração e apoio ao paciente durante minha operação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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