Summary
Для печени мышей была создана нормотермическая система перфузии печени ex vivo (NEVLP). Эта система требует опыта в микрохирургии, но позволяет получить воспроизводимые результаты перфузии. Возможность использования печени мышей облегчает исследование молекулярных путей для выявления новых добавок перфузата и позволяет проводить эксперименты, направленные на восстановление органов.
Abstract
Этот протокол представляет собой оптимизированную систему NEVLP без эритроцитов с использованием печени мышей. Сохранение печени мышей ex vivo было достигнуто за счет использования модифицированных канюль и методов, адаптированных из обычного коммерческого перфузионного оборудования ex vivo . Система была использована для оценки результатов сохранения после 12 часов перфузии. Мыши C57BL/6J служили донорами печени, а печень эксплантировали путем канюляции воротной вены (PV) и желчного протока (BD) и последующего промывания органа теплым (37 °C) гепаринизированным физиологическим раствором. Затем эксплантированную печень переносили в перфузионную камеру и подвергали нормотермической оксигенированной машинной перфузии (NEVLP). Образцы перфузата на входе и выходе отбирали с интервалом в 3 часа для анализа перфузата. После завершения перфузии были получены образцы печени для гистологического анализа, при этом морфологическая целостность оценивалась с использованием модифицированной шкалы Suzuki-Score путем окрашивания гематоксилин-эозином (HE). Эксперименты по оптимизации дали следующие результаты: (1) мыши весом более 30 г были признаны более подходящими для эксперимента из-за большего размера их желчного протока (BD). (2) полиуретановая канюля 2 Fr (наружный диаметр = 0,66 мм) лучше подходила для канюляции воротной вены (PV) по сравнению с полипропиленовой канюлей. Это было связано с улучшенным сцеплением полиуретанового материала, что привело к уменьшению проскальзывания катетера при переносе из тела в камеру органа. (3) для канюляции желчного протока (BD) полиуретановая канюля 1 Fr (наружный диаметр = 0,33 мм) оказалась более эффективной по сравнению с полипропиленовой канюлей UT - 03 (наружный диаметр = 0,30 мм). С помощью этого оптимизированного протокола печень мышей была успешно сохранена в течение 12 часов без существенного влияния на гистологическую структуру. Окрашивание гематоксилин-эозином (ГЭ) выявило хорошо сохранившуюся морфологическую архитектуру печени, характеризующуюся преимущественно жизнеспособными гепатоцитами с хорошо видимыми ядрами и легкой дилатацией печеночных синусоидов.
Introduction
Трансплантация печени представляет собой золотой стандарт лечения людей с терминальной стадией заболевания печени. К сожалению, спрос на донорские органы превышает имеющееся предложение, что приводит к значительному дефициту. В 2021 году около 24 936 пациентов находились в листе ожидания на пересадку печени, при этом было успешно выполнено только 9 234 трансплантации1. Значительное несоответствие между спросом и предложением на трансплантаты печени подчеркивает настоятельную необходимость изучения альтернативных стратегий для расширения пула доноров и повышения доступности трансплантатов печени. Одним из путей расширения пула доноров является использование маргинальных доноров2. К маргинальным донорам относятся пожилые люди, с умеренным или тяжелым стеатозом. Хотя трансплантация маргинальных органов может дать благоприятные результаты, общие результаты остаются неоптимальными. В результате в настоящеевремя ведется разработка терапевтических стратегий, направленных на усиление функции маргинальных доноров3,4.
Одна из стратегий состоит в том, чтобы использовать машинную перфузию, особенно нормотермическую кислородированную машинную перфузию, для улучшения функции этих маргинальных органов5. Тем не менее, все еще существует ограниченное понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе благотворного воздействия нормотермической оксигенированной машинной перфузии (NEVLP). Мыши, с их обильной доступностью генетически модифицированных штаммов, служат ценными моделями для исследования молекулярных путей. Например, значение путей аутофагии в смягчении ишемии-реперфузионного повреждения печени все чаще признается 6,7. Одним из важных молекулярных путей при ишемии-реперфузии печени является путь miR-20b-5p/ATG78. В настоящее время существует ряд штаммов мышей с нокаутом АТГ и условным нокаутом, но нет соответствующих штаммов крыс9.
Исходя из этого, цель состояла в том, чтобы создать миниатюрную платформу NEVLP для трансплантатов печени мышей. Эта платформа облегчит изучение и оценку потенциальных генетически модифицированных стратегий, направленных на улучшение функциональности печени донора. Кроме того, было важно, чтобы система была пригодна для длительной перфузии, что позволяло проводить лечение печени ex vivo , обычно называемое «восстановлением органов».
Учитывая ограниченную доступность соответствующих данных in vitro о перфузии печени мышей, обзор литературы был сосредоточен на исследованиях, проведенных на крысах. Систематический поиск литературы за период с 2010 по 2022 год проводился с использованием таких ключевых слов, как «нормотермическая перфузия печени», «ex vivo или in vitro» и «крысы». Этот поиск был направлен на выявление оптимальных условий у грызунов, что позволило определить наиболее подходящий подход.
Перфузионная система состоит из герметичного стеклянного буферного резервуара с водяной рубашкой, перистальтического роликового насоса, оксигенатора, пузырьковой ловушки, теплообменника, камеры органа и замкнутой системы циклических трубок (рис. 1). Система обеспечивает точное поддержание постоянной температуры перфузии 37 °C с помощью специальной термостатической машины. Перистальтический роликовый насос приводит в движение поток перфузата по всему контуру. Перфузионный контур начинается в изолированном резервуаре с водяной рубашкой. Затем перфузат направляется через оксигенатор, который получает газовую смесь из 95% кислорода и 5% углекислого газа из специального газового баллона. После оксигенации перфузат проходит через пузырьковую ловушку, в которой любые захваченные пузырьки перенаправляются обратно в резервуар перистальтическим насосом. Оставшийся перфузат проходит через теплообменник и поступает в камеру органа, откуда возвращается в резервуар.
Здесь мы сообщаем о нашем опыте создания NEVLP для печени мышей и делимся многообещающими результатами пилотного эксперимента, проведенного с использованием оксигенированной среды без переносчиков кислорода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных проводились в соответствии с действующими немецкими правилами и рекомендациями по благополучию животных и рекомендациями ARRIVE, касающимися отчетности об исследованиях на животных. Протокол эксперимента на животных был одобрен Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Тюрингия, Германия (номер одобрения: UKJ - 17 - 106).
ПРИМЕЧАНИЕ: Самцы мышей C57BL / 6J с массой тела 34 ± 4 г (среднее значение ± стандартной ошибки среднего значения [SEM]) использовались в качестве доноров печени. Они содержались в контролируемых условиях окружающей среды (влажность 50% и 18 - 23 °C) со свободным доступом к стандартным мышиным кормам и воде. На протяжении всей хирургической процедуры поддерживалась частота дыхания, превышающая 60 вдохов в минуту, а температура тела поддерживалась выше 34 °C.
1. Подготовка
- Настройка операционного стола
- Автоклав все хирургические инструменты и расходные материалы для стерилизации.
- Включите все оборудование, включая доску подогрева и электрокоагуляцию.
- Поместите один шприц объемом 50 мл с 25 мл гепаринизированного физиологического раствора (2 500 ЕД / л) в теплый инкубатор (37 ° C).
- Поместите хирургические инструменты, шелковый шов 6 - 0, стерильный маленький хлопчатобумажный аппликатор, ветеринарный физиологический раствор (500 мл) и нетканые марлевые губки (10 см x 10 см) на операционный стол соответствующим образом.
- Поместите иглу 26 г на операционный стол, чтобы создать небольшое отверстие в крышке микроцентрифужной пробирки объемом 0,5 мл для приема желчной трубки для сбора желчи.
- Поместите канюлю (полиуретановую канюлю 1 Fr или полиэтиленовую канюлю UT - 03) и стерилизованную микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл для сбора желчи на операционный стол.
- Самодельная канюля воротной вены
- Держите канюлю 2 Fr щипцами и проколите стенку иглой 30 G на расстоянии 1 см от конца канюли. Протолкните иглу через канюлю до тех пор, пока кончик иглы не станет виден.
- Обрежьте кончик канюли, получив острый треугольник.
- Приготовление гепаринизированного физиологического раствора
- Приготовьте 25 мл гепаринизированного физиологического раствора с конечной концентрацией 2,500 МЕ/мл.
- Удалите все пузырьки воздуха и поместите шприц в инкубатор с температурой 40 °C.
- Демонстрация перфузионной системы
- На рисунке 1 показаны основные компоненты перфузионной системы машины.
- Обустройство органной камеры
- На рисунке 2 показана компоновка органной камеры.
- Настройка перфузионной системы
- Включите программу лабораторных карт для контроля давления.
- Соедините калибратор давления и датчик давления на уровне камеры органа.
- Отрегулируйте калибратор давления так, чтобы он считывал 0 мм рт.ст., и проверьте соответствующее значение в программном обеспечении для контроля давления.
- Отрегулируйте калибратор давления так, чтобы он считывал 20 мм рт.ст., и еще раз проверьте соответствующее значение в программном обеспечении для контроля давления.
- Включите водяную баню и предварительно прогрейте камеру органа до 40 °C.
- Дважды промойте всю водопроводную систему дистиллированной деионизированной водой в течение 30 минут каждый, обеспечивая полное удаление дезинфицирующего раствора.
- Инициируйте циркуляцию дезинфицирующего раствора по всей системе в течение 20 минут, чтобы обеспечить тщательную дезинфекцию.
- Включите газовую смесь (95% кислорода (О2) и 5% углекислого газа (СО2).
- Наполнение перфузатом
- Дополните 250 мл среды Е Вильямса 50 мл эмбриональной бычьей сыворотки, 3 мл пенициллина/стрептомицина (1 мг/мл), 0,17 мл инсулина (100 МЕ/мл), 0,34 мл гепарина (5000 ЕД/мл) и 0,07 мл гидрокортизона (100 мг/2 мл) для приготовления полной среды Е Вильямса.
- Добавьте равные объемы (150 мл) перфузата в резервуар и камеру органа, чтобы заправить систему.
ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание необходимо уделять поддержанию стерильности в процессе наполнения. Перфузант постоянно прокачивается через эти два ключевых компонента перфузии закрытой рециркуляционной машины. - Включите перистальтический насос на средней скорости (15 мл/мин), чтобы наполнить перфузионную систему насыщенной кислородом средой.
2. Эксплантация печени
- Предоперационная подготовка
- Взвесьте животное. Приготовьте обезболивающее бупренорфин (0,3 мг/мл) (0,05 мг/кг массы тела).
- Соедините индукционную камеру с розеткой. Увеличьте кислород до 0,5 л/мин. Увеличьте изофлуран до 3%.
- Поместите животное в камеру до тех пор, пока не будет достигнута глубокая анестезия (рефлекторная коррекция положительная).
- Используйте микрошприц для подкожного введения дозы анальгезии, адаптированной к массе тела.
- Используйте электробритву, чтобы подстричь мех на коже живота.
- Перенесите мышь на операционный стол и включите испаритель изофлурана на 2,5% для поддержания анестезии. Подтвердите глубину анестезии, проверив межпальцевый рефлекс пальца ноги.
- Подготовка живота мыши
- Поместите мышь в положение лежа на спине.
- Тест межпальцевого рефлекса на двукратное подтверждение подходящей глубины анестезии. Зафиксируйте все четыре конечности скотчем.
- Продезинфицируйте обе стороны живота до середины подмышечной линии, используя три последовательных раунда йода и спирта. Используйте нетканую стерилизованную марлю, чтобы покрыть область вокруг операционного поля.
- Сделайте поперечный разрез 3 см на 1 см ниже мечевидной кости в области живота мыши с помощью детских ножниц Метценбаума и хирургических щипцов.
- Продлите разрез кожи двусторонне до средней подмышечной линии с обеих сторон.
- Аккуратно сделайте продольный надрез длиной 2 см вдоль белой линии с помощью пружинных ножниц.
- Разрежьте мышечный слой живота с помощью электрокоагуляции и пружинных ножниц Vannas.
- Аккуратно положите кусочек влажной марли, чтобы защитить печень от электрокоагуляции.
- Используйте шелковый шов 6 - 0 с круглой иглой, чтобы втянуть мечевидный отросток для лучшего обнажения коронарной связки.
- Используйте два ретрактора ребер, чтобы полностью обнажить брюшную полость мыши.
- Осторожно выведите тонкую кишку из брюшной полости влажным ватным тампоном, чтобы полностью обнажить хилум.
- Подготовка общих желчных протоков
- Разрезайте ложновидные, френовые и гастропеченочные связки острыми ножницами.
- Осторожно освободите общий желчный проток с помощью тонких изогнутых щипцов без зубов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий желчный проток очень легко повреждается и разрывается. Как только он сломается, его нельзя будет канюлировать. Из-за направления анатомического положения лучше использовать изогнутые щипцы. - Поместите две шелковые шовные петли 6 - 0 над общим желчным протоком, готовясь к следующему этапу.
- Канюляция общих желчных протоков
- Аккуратно проколите желчный проток иглой 30 G. Используйте заостренные изогнутые щипцы, чтобы увеличить маленькое отверстие, чтобы оно соответствовало канюляции желчных протоков.
- Используйте щипцы для канюляции сосудов, чтобы захватить канюлю желчного протока и протолкнуть ее в желчный проток.
- Дважды закрепите канюлю с помощью предустановленных шовных петель 6 - 0.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время канюляции ощущается сопротивление желчью. Если сила плохо контролируется, канюля будет выталкиваться из желчевыводящих путей под давлением оттока желчи. Тщательно отрегулируйте глубину канюли. Если он слишком глубокий, он может повредить желчный проток, а если он недостаточно глубокий, он может выскользнуть. - Наблюдайте за потоком желчи в канюле после успешной канюляции.
- Препарирование воротной вены
- Зажмите воротную вену плоскими щипцами и аккуратно освободите соединительную ткань изогнутыми щипцами. Не тяните сильно, чтобы не вызвать разрыв воротной вены. После повреждения воротной вены трудно повторно канюлировать воротную вену.
- Рассеките PV, чуть превышающий бифуркацию, и поместите первую шовную петлю, используя шелковый шов 6 - 0 на PV близко к слиянию для последующего использования.
- Поместите вторую шовную петлю для последующей фиксации ПВ как можно ближе к печеночному бугорку.
- Канюляция воротной вены
- Используйте артериальный зажим, чтобы закрыть дистальную воротную вену.
- Очень осторожно проколите воротную вену одной из вышеперечисленных канюль воротной вены. Кровоток можно четко наблюдать внутри канюли после успешной пункции.
- Закрепите канюлю PV с помощью предварительно установленной шовной петли 6 - 0.
- Гиперемия печени
- Увеличьте изофлуран до 5% и усыпьте мышей при передозировке изофлурана ингаляционно.
- Возьмите из инкубатора подогретый солевой раствор гепарина. Удалите все пузырьки воздуха, образовавшиеся внутри гепаринизированного физиологического раствора.
- Зафиксируйте шприц с предварительно подогретым гепаринизированным физиологическим раствором в шприцевом насосе.
- Подсоедините удлинительную трубку шприцевого насоса к канюле воротной вены, отрегулируйте скорость до 2 мл/мин и начните промывание печени.
- Наблюдайте за цветом печени в конце процедуры промывания. Иссеките печень, как только цвет станет однородным желтым.
- Пересеките диафрагму, надпеченочную нижнюю полую вену, подпеченочную полую вену, печеночную артерию, дистальную воротную вену и любую оставшуюся соединительную ткань.
- Поместите печень в чашку Петри.
3. Соединение печени и камеры
- Пересадка печени
- Осторожно перенесите печень в камеру органа с помощью чашки Петри.
- Держите небольшое количество физиологического раствора в чашке Петри, чтобы предотвратить высыхание печени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воротная вена и желчный проток могут быть легко перекручены во время этой процедуры, что может повлиять на перфузию печени и сбор желчи.
- Соединение канюли воротной вены
- Медленно вливайте нормальный физиологический раствор в канюлю воротной вены с помощью шприца, чтобы удалить пузырьки воздуха в канюле.
- Подключите канюлю воротной вены к трубке перфузатного оттока в камере органа.
- Соединение канюли желчных протоков
- Направьте канюлю желчного протока мыши через клапан резинового колпачка, который соединен с камерой органа.
- Вставьте канюлю желчных протоков в заранее подготовленную микропробирку объемом 0,5 мл с небольшим отверстием в крышке.
- Поместите микротрубку на глину снаружи камеры органа.
4. Отрегулируйте расход в соответствии с давлением PV
- Включите перистальтический насос с 1 мл/мин.
- Проверьте показания давления в воротной вене, чтобы отрегулировать скорость потока.
- Поддерживайте давление в воротной вене в физиологическом диапазоне от 7 до 10 мм рт.ст., регулируя скорость потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Номинальный расход может незначительно варьироваться в зависимости от использования и расположения труб.
5. Сбор образцов
- Возьмите образцы перфузата на входе из трубки для притока воротной вены и образцы перфузата на выходе из камеры органа с интервалом в 3 часа.
- Соберите образцы из всех долей печени для гистологического анализа в конце перфузионного периода 12 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Установление хирургического вмешательства
Всего для этого эксперимента было использовано 17 животных: 14 мышей были использованы для оптимизации процесса получения органов, включая канюляцию воротной вены (PV) и желчного протока (BD), в то время как 3 мыши были использованы для проверки процедуры (таблица 1). Гистологические результаты (рис. 3) сравнивали для облегчения определения оптимальных условий перфузии.
Подбор перфузата
Для данного исследования была выбрана ранее использованная питательная среда для гепатоцитов10,11. Среда Уильяма E была первоначально разработана Уильямсом и Ганном как среда с восстановленной сывороткой для длительного культивирования in vitro зрелых эпителиальных клеток печени крыс12. Тем не менее, он также нашел применение в поддержке роста и поддержания гепатоцитов грызунов13. Фетальная бычья сыворотка (FBS) является широко используемой добавкой для клеточных культур из-за ее богатого состава необходимых питательных веществ и факторов роста, которые способствуют росту, пролиферации и жизнеспособности клеток14. В качестве перфузата использовалась полная среда Уильяма Е (таблица 2), которая дополняется 20% эмбриональной бычьей сывороткой, 1% пенициллином/стрептомицином, 5000 ЕД/л гепарина, 50 ЕД/л инсулина и 0,010 г/л гидрокортизона.
Выбор канюли
Процедура канюляции включала сначала канюляцию желчного протока (BD) для сбора желчной жидкости, а затем канюляцию воротной вены (PV). Для канюляции BD изначально использовалась полипропиленовая трубка UT-03 с наружным диаметром 0,3 мм и внутренним диаметром 0,18 мм. Однако из-за опасений по поводу потенциального повреждения BD и более высокого риска непреднамеренного смещения катетера, связанного с обрезанным и жестким наконечником UT-03, предпочтение было отдано полиуретановым трубкам 1 Fr. Полиуретановые трубки с их более мягким материалом и пониженной скользкостью считались более подходящими для канюляции BD.
Первоначально для канюляции воротной вены (ПВ) использовалась полипропиленовая внутривенная игольчатая канюля 26 г. Однако удаление иглы и последующее прикрепление канюли к перфузионной трубке приводило к образованию пузырьков, которые могли препятствовать внутрипеченочным синусоидам. Чтобы преодолеть эту проблему, была построена постоянная канюля с использованием иглы 30 G, вставленной в дистальный 1 см полиуретановой канюли 2 Fr. Затем эта самодельная «игольчатая канюля» была вставлена в дистальный отдел PV над слиянием. Когда катетер был расположен внутри PV, игла медленно извлекалась, одновременно продвигая трубку. Конец самодельной канюли соединялся с перфузионной трубкой внутри камеры. Использование мягкого материала в этой технике канюляции обеспечило преимущество за счет снижения риска повреждения задней стенки сосуда.
Валидационные исследования
Образцы перфузата на входе и выходе подвергали определению рН и уровня калия. Полученные результаты (рис. 4) затем сравнивали с результатами, представленными в последних публикациях15,16,17. Печень трех мышей перфузировали оксигенированной средой и дополняли средой Е Уильяма в течение 12 часов. На протяжении всего этого периода непрерывно регистрировалось стабильное перфузионное давление 7 - 10 мм рт.ст. Средний рН был относительно стабильным в течение 12 часов перфузии и колебался от 7,3 до 7,7. Средние уровни калия также были стабильными в течение всего периода перфузии и варьировались от 5,9 до 6,8 ммоль/л (рис. 4). Расход PV поддерживался в диапазоне 0,8 - 1,2 мл / мин / г в зависимости от использования и расположения трубок насоса во время экспериментальных процедур. Все результаты, наблюдаемые при перфузии печени мышей, продемонстрировали сходство с ранее зарегистрированными наблюдениями при перфузии печени крыс (таблица 3).
Образцы тканей были взяты из трех печени (N = 3) и подвергнуты 12-часовой перфузии с использованием оптимизированного протокола HE-окрашивания с последующим сканированием всего предметного стекла. Каждая доля печени была оценена с использованием модифицированной шкалы Сузуки (таблица 4). Классическаяоценка Suzuki 18 баллов была увеличена за счет включения трех дополнительных параметров: пикноза ядер, отслойки сосудов и наличия эритроцитов в синусоидах и крупных сосудах. Каждый параметр был оценен как отсутствующий (0), легкий (1), умеренный (2) и тяжелый (3). Итоговый балл от 0 до 7 считался отражающим хорошую сохранность, 8 - 14 - умеренную сохранность, а 14 - 21 - плохую сохранность.
Сохранность печени мышей оценивали на основе модифицированной шкалы Сузуки. Два медицинских эксперта провели независимую оценку морфологии семи долей трех печени (рис. 5, рис. 6, рис. 7). Было рассчитано среднее значение семи баллов по каждой доле печени; Более низкие баллы указывают на лучшую сохранность печени. Оценки, сделанные экспертами, показали высокую степень соответствия. Примечательно, что, хотя при оценке пикноза ядер наблюдались небольшие расхождения в оценках, присвоенных двумя экспертами, эти вариации существенно не повлияли на общие результаты оценки.
В лучшем случае паренхима печени была относительно интактной с хорошо сохранившейся типичной дольковой структурой, едва отличимой от нормальной печени. Гепатоциты оказались жизнеспособными с хорошо видимыми клеточными мембранами и круглыми ядрами. Тем не менее, некоторые ядра подверглись пикнозу, а некоторые печеночные синусоиды были слегка расширены, в результате чего было получено 4 балла. (Рисунок 3, Рисунок 6)
В худшем случае дольковая структура была искажена, с сосудами, отделившимися от паренхимы, и сливающимся паренхиматозным некрозом. На клеточном уровне стала очевидной клеточная вакуолизация и пикноз ядер, особенно в перицентральной области. Кроме того, наблюдалась легкая и умеренная вакуолизация. Некрозу подверглось до 30 % гепатоцитов, в результате чего максимальный балл составил 14 баллов. (Рисунок 3, Рисунок 7)
Таблица 1: Пошаговое создание модели перфузии печени мышей. В процессе создания наблюдались различные осложнения из-за различий в размере, материале и расположении канюли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Сравнение методов сохранения органов in vitro 15,17,19,20,21,22. Оптимизация выбора перфузата, выбора носителя кислорода и сравнения питательных компонентов имеет решающее значение при различных условиях хранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Анализ гемодинамики и газов крови у нормальных крыс и крыс NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Представленная информация выборочно описывает гемодинамические особенности печени крыс и основные параметры нормотермической перфузии in vitro. В частности, перфузия печени крысы может считаться оптимальной, когда давление PV обычно колеблется от 4 до 10 мм рт.ст., а парциальное давление кислорода в перфузате, поступающем в PV, колеблется от 80 до 550 мм рт.ст., что соответствует необходимым критериям для успешной перфузии печени крыс in vitro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Модифицированная оценка Suzuki. Модифицированная оценка Сузуки, используемая в этом исследовании, расширяет классическую оценку Сузуки, включая три дополнительных параметра: пикноз ядер, отслоение сосудов и наличие эритроцитов в синусоидах и крупных сосудах. Каждому параметру была присвоена оценка по шкале 0 (отсутствие), 1 (легкая), 2 (умеренная) или 3 (тяжелая). Общий балл в диапазоне от 0 до 8 указывает на хорошую сохранность; От 9 до 16 предполагает умеренную сохранность, а от 17 до 24 указывает на плохую сохранность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 5: Выбор перфузатной среды, объема перфузата и перфузионного давления на основе литературного исследования NEVLP у крыс (2010-2022 гг.)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. Нормотермическая машинная перфузия печени крыс может демонстрировать вариабельность в разных исследованиях с точки зрения конкретного типа и объема используемого перфузата, а также продолжительности перфузии. В различных исследованиях могут использоваться различные подходы, такие как диализ или перфузия большого объема, в течение длительных периодов времени. Однако, несмотря на эти различия, такие параметры, как портальное давление, скорость потока в воротной вене и парциальное давление кислорода в перфузате, как правило, демонстрируют минимальные различия между различными используемыми методами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Рисунок 1: Принципиальная схема перфузионной системы. Ключевыми компонентами являются камера органа, термостатическая машина, роликовый насос, оксигенатор и резервуар. Перфузант перекачивается из резервуара перистальтическим насосом в оксигенатор. В оксигенаторе происходит непрерывный поток газа 95% O2 и 5% CO2. Перфузат проходит через пузырьковую ловушку, где любые пузырьки воздуха, присутствующие в перфузате, улавливаются и перекачиваются обратно в резервуар. Оставшийся перфузат поступает в камеру органа, где трубка соединяется с воротной веной. Перфузиальный отток из камеры органа направляется обратно в резервуар перистальтическим насосом. Желчная дренажная трубка соединяется с камерой органа для сбора желчи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Крупный план перфузионной камеры. Камера перфузии органов состоит из входного и выходного отверстий перфузи, пузырьковой ловушки, теплообменника и отверстия для сбора желчи. Мониторинг давления перфузионного насоса в режиме реального времени осуществляется с помощью датчика давления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Гистологические результаты нормальной и перфузированной печени мышей. (A) Нормальная морфология печени мыши (контроль). (B) Пример наиболее хорошо сохранившейся морфологии, визуализированной с помощью HE-окрашивания после 12 часов перфузии. (C). Пример наихудшей сохранившейся морфологии, визуализированной с помощью HE-окрашивания после 12 ч перфузии. Черная стрелка указывает на вакуолизацию, красная стрелка указывает на синусоидальную дилатацию, желтая стрелка показывает пикноз ядер, а зеленая стрелка указывает на сосудистую отслойку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Перфузатный анализ. рН (А) и уровень калия (В). Оба параметра стабильны в течение 12 часов, что указывает на постоянные условия перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Незначительное повреждение печени, приводящее к измененной оценке Suzuki 4-7. После 12 часов НВЛП была проведена полуколичественная оценка морфологии печени. Образцы из каждой доли печени оценивались и оценивались отдельно, в результате чего был получен диапазон и средний балл для каждой печени, при этом максимально возможный балл составлял 4. Хорошо сохранившаяся морфология печени с оценкой от 4 до 7 в зависимости от доли печени (среднее значение = 5) (оценка 0-7: хорошо сохранившаяся морфология печени, 8-14 баллов умеренно сохранившаяся морфология, оценка 15-21: плохо сохранившаяся морфология печени) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Умеренное повреждение печени, приводящее к модифицированной оценке Suzuki 7-14. Полуколичественная оценка морфологии печени после 12 часов нормотермической оксигенированной машинной перфузии в соответствии с модифицированной шкалой Сузуки. Умеренно сохранившаяся морфология с оценкой от 7 до 14 (среднее значение = 11). (Оценка 0-7: хорошо сохранившаяся морфология печени, оценка 8-14 умеренно сохранившаяся морфология, оценка 15-21: плохо сохранившаяся морфология печени) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Незначительное - умеренное повреждение печени, приводящее к модифицированной оценке Suzuki 5-11. Неоднородная перфузия привела к незначительной или умеренной сохраненной морфологии в разных долях печени с баллами от 5 до 11 (среднее значение = 8). (Оценка 0-7: хорошо сохранившаяся морфология печени, оценка 8-14 умеренно сохранившаяся морфология, оценка 15-21: плохо сохранившаяся морфология печени) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в протоколе
Двумя важнейшими этапами эксплантации печени являются канюляция воротной вены (PV) и последующая канюляция желчного протока (BD). Эти шаги имеют первостепенное значение для обеспечения успешного извлечения органов и последующих процедур перфузии или трансплантации.
Проблемы и решения
Фотоэлектрическая канюляция сопряжена с тремя проблемами: повреждение стенки сосуда, смещение катетера и целесообразность процесса введения. Деликатный характер стенки фотоэлектрического сосуда делает его восприимчивым к проколу и последующему кровотечению, если с ним не обращаться осторожно во время канюляции. Кроме того, любая кровопотеря от PV снижает портальное давление, что затрудняет установку фотоэлектрической канюли. Кроме того, повреждение стенки воротной вены может привести к попаданию воздушной эмболы во внутрипеченочную сосудистую систему. Таким образом, проявление точности и осторожности во время процесса фотоэлектрической канюляции имеет решающее значение для минимизации риска осложнений.
Во время фотоэлектрической канюляции риск смещения катетера является общей проблемой, особенно при использовании канюль со скользкими материалами. По сравнению с полипропиленом, использование полиуретановых канюль более благоприятно для фотоэлектрической канюляции. Мягкая и податливая природа полиуретана значительно снижает риск смещения или потери катетера, что может быть связано со свойствами его материала. Кроме того, использование мягкой канюли сводит к минимуму вероятность повреждения эндотелиального слоя кровеносных сосудов. В исследовании сравнивались три типа канюль сосудистого доступа, а именно полипропилен 24 г, полипропилен 26 г и полиуретан 2 Fr. Среди этих вариантов полиуретановые канюли 26 G и 2 Fr продемонстрировали лучшую совместимость с размером фотоэлектрической мыши мыши. В то время как канюля 26 G продемонстрировала лучшую анатомическую совместимость, полиуретановая канюля 2 Fr с наружным диаметром 0,66 мм была признана подходящей для предполагаемого применения из-за ее уникальных свойств материала, эффективно сводящих к минимуму риск непреднамеренного смещения катетера из PV.
Что касается практичности введения, то были опробованы различные методы. Один из способов — зажать проксимальный и дистальный концы фотоэлектрического блока, вырезать тонкими ножницами небольшое отверстие и вставить фотоэлектрическую канюлю. Эта техника требует привлечения дополнительного человека из-за сложности и необходимости одновременных действий. Следовательно, один микрохирург не может выполнить процедуру самостоятельно. Поэтому необходим катетер с внутренней иглой и внешней канюлей. Как описано ранее, использование имеющейся в продаже жесткой и гладкой полипропиленовой канюли 26 G сопряжено с риском выскальзывания и образования пузырьков воздуха при подключении канюли к системе промывки. Чтобы решить эти проблемы, была разработана самодельная «система игольчатых трубок» путем введения иглы 26 G из игольчатого катетера в длинную и податливую полиуретановую канюлю 2 Fr. Этот подход предлагает три ключевых преимущества: (1) система введения катетера, (2) длинная и гибкая трубка и (3) благоприятные свойства материала. Однако на этом этапе крайне важно проявлять осторожность, чтобы не допустить контакта кончика иглы со стенкой PV во время продвижения, так как это может привести к необратимому повреждению стенки сосуда.
Канюляция BD представляла те же три проблемы: повреждение стенки сосуда, смещение катетера и практичность процесса введения. В конечном счете, полиуретановая канюля 1 Fr была признана более подходящей, чем полипропиленовая канюля UT - 03 из-за ее благоприятных свойств материала. Несмотря на несколько меньший наружный диаметр канюли UT - 03 (0,30 мм) по сравнению с термочувствительной полиуретановой трубкой 1 Fr (0,33 мм), полиуретановый материал является жестким и менее склонным к изгибу. С другой стороны, канюля 1 Fr, мягкая и гибкая, облегчает установку и, таким образом, стала нашим предпочтительным выбором. Однако в тех случаях, когда размер BD исключительно мал и не может вместить более крупную канюлю 2 Fr, канюля UT - 03 остается жизнеспособной альтернативой. В таких случаях особое внимание должно уделяться предотвращению смещения канюли из БД.
Как резюмировано в обзоре литературы (табл. 5), большинство экспериментаторов 19,41,42,46 использовали портальную скорость потока 1 - 3 мл/мин/г печени. Однако скорость потока должна быть отрегулирована для поддержания физиологического портального давления в диапазоне 4 - 10 мм рт.ст.28. Высокое фотоэлектрическое давление может вызвать синусоидальную дилатацию и отслоение сосудов. Низкое давление PV и низкая скорость потока PV могут привести к гипооксигенации с низким потоком с последующим среднезональным и перицентральным некрозом. Манипулирование расходом PV выполняет функцию регулирования давления PV, которое может варьироваться в зависимости от используемой канюли и размера печени, что требует незначительных корректировок скорости потока PV. Таким образом, в этом исследовании перфузия была начата при скорости потока 1 мл / мин / г печени, и в то же время давление PV контролировалось с помощью датчика артериального давления для поддержания физиологического давления PV путем регулировки скорости потока.
В ходе разработки модели НВЛП была предпринята попытка дальнейшего улучшения снабжения перфузированной печени кислородом путем добавления в перфузат промытых эритроцитов. Тем не менее, в большой камере и резервуаре наблюдалось значительное оседание эритроцитов, тем самым уменьшая доставку переносчиков кислорода к органу при перфузии. Кроме того, повреждение эритроцитов было вызвано механическим действием перистальтического перфузионного насоса, который приводит в движение перфузат, сжимая кремниевую трубку. Обе причины облегчили наше решение не использовать эритроциты в этом эксперименте. Носители кислорода на основе перфторуглеродов могут решить эти проблемы47.
Для оценки жизнеспособности печеночного трансплантата во время перфузии желчную жидкость мыши собирали с интервалом в 3 часа. Тем не менее, трудно собрать желчь через катетер из-за высокой вязкости желчной жидкости мыши. Первоначально это компенсируется капиллярными силами, индуцированными тонким полиуретановым катетером 1 Fr, помещенным в BD. Однако только около 20 мкл желчной жидкости можно было собрать в течение первого часа эксперимента. Вместо того, чтобы дренироваться через канюлю, наблюдалось ретроградное наполнение желчного пузыря.
В конце 12-часового периода перфузии желчный пузырь был заполнен прозрачной желчной жидкостью, что свидетельствует об активной выработке желчи во время машинной перфузии. Этому можно противодействовать, поместив большую трубку в желчный пузырь.
В то же время оценивали гистологическое повреждение клеточной и дольковой структуры печени для определения результата консервации. Было замечено, что даже в пределах одной и той же печени сохранность была неоднородной. Неоднородность структурных изменений свидетельствует о том, что перфузия была неоднородной по всей печени (рис. 5, рис. 6, рис. 7). Кроме того, гистологические данные свидетельствуют о том, что жизнеспособно сохранять структурную целостность трансплантата печени мыши в течение как минимум 12 часов во время машинной перфузии. Тем не менее, наличие интактной гистологии печени может только помочь в оценке, но не может окончательно определить функцию и жизнеспособность печени. Следует отметить, что некроз, как конечное проявление клеточного повреждения, не может быть легко наблюдаем до более поздней стадии. Таким образом, полагаясь исключительно на гистологическую оценку, можно не дать всестороннего понимания функционального состояния и жизнеспособности печени. Для выяснения общего состояния печени необходимы другие дополнительные анализы и оценки, включая функциональные анализы, биохимические маркеры и оценку метаболической активности.
Хорошая сохранность была достигнута после 12 часов перфузии. Тем не менее, дальнейшее продление времени перфузии, насколько это возможно необходимо для восстановления органа, требует решения некоторых проблем. Во-первых, следует отметить, что достижение длительной продолжительности перфузии, превышающей 12 часов, потребует поддержания стерильных условий, а не просто чистых условий. Однако в этих первоначальных экспериментах основное внимание уделялось поддержанию чистых, а не стерильных условий, поскольку обеспечение стерильности внесло бы дополнительные сложности в процедуру. Во-вторых, более длительная перфузия, возможно, потребует добавления диализного блока, как описано Германом Толбумом22, для удаления накапливающихся токсичных продуктов метаболизма. Они использовали систему общим объемом 55 - 60 мл для перфузии печени крысы по 10 г в течение 4 ч. В этом исследовании был использован относительно большой резервуар с общим объемом 300 мл, несмотря на небольшой размер печени мыши, который весит примерно 1 г. Такая конфигурация привела к дополнительному коэффициенту разбавления в 50 раз. Примечательно, что никаких вредных эффектов не наблюдалось в течение 12-часового периода перфузии с этой установкой. В-третьих, более длительная перфузия также потребует добавления переносчиков кислорода, в лучшем случае в виде искусственного гемоглобина для обеспечения адекватного снабжения кислородом, как описано Dondossola et al.47 и Jägers et al.48.
Развитие «неишемической» трансплантации печени на основе НВЛП, несомненно, принесло новые идеи и методы к решению или даже предотвращению проблемы ишемии-реперфузионного повреждения. Тем не менее, NEVLP является очень многообещающей концепцией для улучшения сохранности органов и ее потенциального применения для расширения сохранения органов до восстановления органов47.
В настоящее время экспериментально и клинически используются три различных метода машинной перфузии. Ключевое различие заключается в рабочей температуре: гипотермическая машинная перфузия, субноматемная машинная перфузия и нормотермическая машинная перфузия (табл. 2). Другие отличия включают выбор консервирующего раствора, перфузатного раствора и добавление кислородных носителей (таблица 5).
NEVLP в основном имеет преимущество, потому что (1) орган поддерживается при нормальной температуре, (2) он насыщен кислородом и (3) он метаболически полностью питается. Система обеспечивает отличную платформу для диагностической оценки, интервенционной терапии и, в конечном итоге, восстановления органов49. Тем не менее, NEVLP представляет собой серьезную проблему для технологии поддержки органов ex vivo. Задача NEVLP состоит в том, чтобы отразить почти физиологическое состояние. До недавнего времени из-за небольшого размера и отсутствия стандартных критериев оценки было проведено лишь ограниченное количество исследований NEVLP на грызунах 25,26,27,28,29,30,31.
Здесь было продемонстрировано, что модель мыши является допустимой моделью, которая позволяет сохранять время 12 часов. Для сравнения, в большинстве исследований на крысах сообщалось о времени перфузии 6 часов или менее28,33. Кроме того, использование мелких животных имеет преимущество для молекулярных исследований по сравнению с крупными животными из-за наличия большого количества реагентов и более низких затрат на эксперименты. Например, мыши в настоящее время являются предпочтительным вариантом для тестирования нокаутных моделей семейства генов ATG, особенно для изучения сигнальных путей ишемии-реперфузионного повреждения в печени 8,50.
Эксперименты на печени крыс в отношении NEVLP показали, что сохранение нормотермической машинной перфузии связано с уменьшением гепатоцеллюлярного повреждения и улучшением ранней посттрансплантационной выживаемости по сравнению с сохранением холода 31,40,51,52,53,54. NEVLP с использованием печени крыс также подходит для изучения добавок лекарств или клеток к перфузату. Впечатляющим примером является исследование26-летнего Сюань Тяня, который использовал модифицированные гемоксигеназой-1 мезенхимальные стволовые клетки в сочетании с нормотермической машинной перфузией для улучшения качества трансплантатов печени через сигнальный путь Wnt. 39-летний Хаоцзе Ван подтвердил в своем недавнем исследовании, что добавление мезенхимальных стволовых клеток костного мозга к перфузату может значительно улучшить качество NEVLP у крыс для кратковременной перфузии. В их исследовании с использованием печени DCD мезенхимальные стволовые клетки костного мозга в сочетании с NEVLP ингибировали синусоидальный застой печени и повреждение эндотелия. Добавление мезенхимальных стволовых клеток предотвращало внутрипеченочную активацию макрофагов и межклеточную адгезию. Кроме того, добавление мезенхимальных стволовых клеток регулировало баланс эндотелина-1 / эндотелиального оксида азота для улучшения перфузии печени и микроциркуляции.
Мыши предлагают явное преимущество перед крысами, когда дело доходит до NEVLP, особенно в контексте молекулярных исследований, сосредоточенных на трансгенной или генетически модифицированной печени. Однако из-за небольшого размера животного процедура представляет собой большую, но управляемую задачу для микрохирурга37.
Система оценок для гистологической оценки
Гистологическая оценка имеет решающее значение для определения влияния условий перфузии на морфологическую целостность трансплантата.
Хотя оценка Сузуки обычно используется в исследованиях, оценивающих патологию печени, было отмечено, что эта система оценки может неадекватно отражать конкретные результаты, наблюдаемые при сохранении печени ex-vivo. Чтобы устранить это ограничение, были введены четыре дополнительных критерия для повышения всесторонней оценки сохраненной ткани печени (таблица 4). Во-первых, было реализовано включение оценки ядерного пикноза, поскольку она служит ценным параметром, указывающим на повреждение клеток. Во-вторых, в качестве дополнительного критерия была включена оценка отслойки сосудов и гепатоцитов, что означает повреждение печеночной дольки. Наконец, классификация присутствия эритроцитов в синусоидах использовалась в качестве индикатора гетерогенной промывки и перфузии. Благодаря включению этих дополнительных критериев была достигнута более тонкая и точная оценка состояния сохраненной ткани печени, что обеспечило более глубокое понимание эффектов сохранения печени ex-vivo.
Вакуолизация55 гепатоцитов происходит после изменений в использовании субстрата, расходе энергии, распаде микротрубочек и ингибировании синтеза белка. Ядро гепатоцита вынуждено смещаться к периферии клетки крупными вакуолями. Этот процесс часто сопровождается ядерным пикнозом. В этом исследовании 12 ч нормотермической машинной перфузии приводили к разной степени вакуолизации гепатоцитов по сравнению с контролем, предполагающим неоднородную перфузию.
Наличие расширенных синусоид между гепатоцитарными канатинами было заметно в этом исследовании. Это явление в первую очередь возникает из-за обструкции венозного оттока печени, что приводит к застою сосудов и застою в паренхиме печени. В этой модели печени мыши проблемы, связанные с поддержанием постоянного давления портальной перфузии из-за небольшого размера органа, могут способствовать наблюдаемому расширению печеночных синусоид.
Некротические изменения обычно проявляются в клеточных кластерах, региональных областях или определенных зонах. Хорошо перфузированная перипортальная область показала относительно лучшую сохранность гепатоцитов по сравнению с перицентральной областью. Двухсосудистая перфузия печени, как показано на примере печеникрыс 20, представляет собой более серьезную проблему для печени мышей из-за небольшого размера печеночной артерии. Следовательно, наблюдаемая неоднородная перфузия печени мыши может быть приписана, по крайней мере частично, этому ограничению.
Эти наблюдения не являются исключительными для печени мышей, подвергающихся NEVLP, но также могут быть визуализированы на гистологических изображениях из других исследований NEVLP, хотя они не могут быть явно описаны.
Важность и потенциальное применение мышиного NEVLP
НВЛП печени мышей является сложной, но выполнимой процедурой. Необходимы дальнейшие усилия для наилучшего использования этой технологии для выяснения механизма, лежащего в основе благотворного эффекта NEVLP. Расширение наших знаний будет способствовать прогрессивной эволюции этой технологии, переводя ее за пределы сохранения органов в область «восстановления органов».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Финансовые конфликты интересов, подлежащие раскрытию, отсутствуют.
Acknowledgments
На протяжении всего периода написания этой статьи я получал большую поддержку и помощь. Я особенно хотел бы поблагодарить моего товарища по команде Синьпэй Чена за его прекрасное сотрудничество и терпеливую поддержку во время моей операции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B.
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. 3rd Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N.
- van der, V. alk J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) - farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von,, Horn, C., Zlatev, H., Pletz, J., Lüer, B., Minor, T. Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William's E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
