Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Normothermic Ex Vivo Karaciğer Makinesi Farede Perfüzyon

Published: September 25, 2023 doi: 10.3791/65363
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Experimental Transplantation Surgery, Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz GmbH, 3Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Menoufia University

Summary

Fare karaciğerleri için normotermik ex vivo karaciğer perfüzyonu (NEVLP) sistemi oluşturuldu. Bu sistem mikrocerrahide deneyim gerektirir ancak tekrarlanabilir perfüzyon sonuçlarına izin verir. Fare karaciğerlerini kullanma yeteneği, yeni perfüzyon katkı maddelerini tanımlamak için moleküler yolakların araştırılmasını kolaylaştırır ve organ onarımına odaklanan deneylerin yürütülmesini sağlar.

Abstract

Bu protokol, fare karaciğerlerini kullanarak optimize edilmiş eritrositsiz bir NEVLP sistemi sunar. Fare karaciğerlerinin ex vivo korunması, modifiye kanüller ve geleneksel ticari ex vivo perfüzyon ekipmanlarından uyarlanmış teknikler kullanılarak sağlanmıştır. Sistem, 12 saatlik perfüzyonu takiben koruma sonuçlarını değerlendirmek için kullanıldı. C57BL / 6J fareleri karaciğer donörü olarak görev yaptı ve karaciğerler, portal ven (PV) ve safra kanalı (BD) kanüle edilerek ve daha sonra organı ılık (37 ° C) heparinize salin ile yıkayarak eksize edildi. Daha sonra ekilen karaciğerler perfüzyon odasına transfer edildi ve normotermik oksijenli makine perfüzyonuna (NEVLP) tabi tutuldu. Giriş ve çıkış perfüzyon numuneleri, perfüzyon analizi için 3 saatlik aralıklarla toplandı. Perfüzyonun tamamlanmasının ardından, histolojik analiz için karaciğer örnekleri alındı ve morfolojik bütünlük, Hematoksilin-Eozin (HE) boyaması yoluyla modifiye Suzuki-Skoru kullanılarak değerlendirildi. Optimizasyon deneyleri aşağıdaki bulguları vermiştir: (1) 30 g'ın üzerindeki fareler, safra kanallarının (BD) daha büyük boyutu nedeniyle deney için daha uygun görülmüştür. (2) 2 Fr (dış çap = 0.66 mm) poliüretan kanül, bir polipropilen kanüle kıyasla portal venin (PV) kanüllenmesi için daha uygundu. Bu, poliüretan malzemenin gelişmiş kavramasına bağlandı ve vücuttan organ odasına transfer sırasında kateter kaymasının azalmasına neden oldu. (3) Safra kanalının (BD) kanülasyonu için 1 Fr (dış çap = 0.33 mm) poliüretan kanülün polipropilen UT - 03 (dış çap = 0.30 mm) kanülüne göre daha etkili olduğu bulunmuştur. Bu optimize protokolle, fare karaciğerleri histolojik yapı üzerinde önemli bir etki yaratmadan 12 saatlik bir süre boyunca başarıyla korunmuştur. Hematoksilin-Eozin (HE) boyaması, karaciğerin iyi korunmuş morfolojik mimarisini ortaya çıkardı, açıkça görülebilen çekirdeklere sahip ağırlıklı olarak canlı hepatositler ve hepatik sinüzoidlerin hafif genişlemesi ile karakterize edildi.

Introduction

Karaciğer transplantasyonu, son dönem karaciğer hastalığı olan bireyler için altın standart tedaviyi temsil eder. Ne yazık ki, donör organlara olan talep mevcut arzı aşmakta ve önemli bir kıtlığa yol açmaktadır. 2021 yılında, yaklaşık 24.936 hasta karaciğer grefti için bekleme listesindeyken, sadece 9.234 nakil başarıyla gerçekleştirildi1. Karaciğer greftlerinin arz ve talebi arasındaki önemli eşitsizlik, donör havuzunu genişletmek ve karaciğer greftlerinin erişilebilirliğini artırmak için alternatif stratejilerin araştırılması gerekliliğini vurgulamaktadır. Donör havuzunu genişletmenin bir yolu, marjinal donörleri kullanmaktır2. Marjinal donörler arasında ileri yaş, orta veya şiddetli steatoz olanları bulunur. Marjinal organların transplantasyonu olumlu sonuçlar verse de, genel sonuçlar optimal değildir. Sonuç olarak, marjinal donörlerin işlevini arttırmayı amaçlayan terapötik stratejilerin geliştirilmesi şu anda devam etmektedir 3,4.

Stratejilerden biri, bu marjinal organların işlevini geliştirmek için makine perfüzyonunu, özellikle normotermik oksijenli makine perfüzyonunu kullanmaktır5. Bununla birlikte, normotermik oksijenli makine perfüzyonunun (NEVLP) yararlı etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmaların hala sınırlı bir anlayışı vardır. Fareler, genetiği değiştirilmiş suşların bol miktarda bulunmasıyla, moleküler yolları araştırmak için değerli modeller olarak hizmet eder. Örneğin, hepatik iskemi-reperfüzyon hasarını hafifletmede otofaji yolaklarının önemi giderek daha fazla kabul görmektedir 6,7. Hepatik iskemi-reperfüzyon hasarında önemli bir moleküler yol miR-20b-5p/ATG7 yol8'dir. Şu anda, bir dizi ATG nakavt ve koşullu nakavt fare suşu mevcuttur, ancak karşılık gelen sıçan suşlarıyoktur 9.

Bu arka plana dayanarak, amaç fare karaciğer greftleri için minyatür bir NEVLP platformu oluşturmaktı. Bu platform, donörün karaciğerinin işlevselliğini iyileştirmeyi amaçlayan potansiyel genetiği değiştirilmiş stratejilerin araştırılmasını ve değerlendirilmesini kolaylaştıracaktır. Ek olarak, sistemin uzun süreli perfüzyon için uygun olması ve genellikle "organ onarımı" olarak adlandırılan karaciğerin ex vivo tedavisini sağlaması çok önemliydi.

Fare karaciğeri perfüzyonu ile ilgili in vitro verilerin sınırlı mevcudiyeti göz önüne alındığında, literatür taraması sıçanlarda yapılan çalışmalara odaklanmıştır. "Normotermik karaciğer perfüzyonu", "ex vivo veya in vitro" ve "sıçanlar" gibi anahtar kelimeler kullanılarak 2010'dan 2022'ye kadar uzanan sistematik bir literatür taraması yapılmıştır. Bu araştırma, kemirgenlerde en uygun koşulları tanımlamayı ve en uygun yaklaşımı belirlememizi sağlamayı amaçlamıştır.

Perfüzyon sistemi, kapalı bir su ceketli cam tampon rezervuarı, bir peristaltik makaralı pompa, bir oksijenatör, bir kabarcık kapanı, bir ısı eşanjörü, bir organ odası ve kapalı bir bisiklet boru sisteminden oluşur (Şekil 1). Sistem, özel bir termostatik makine kullanarak 37 °C'lik sabit bir perfüzyon sıcaklığının hassas bir şekilde korunmasını sağlar. Peristaltik makaralı pompa, perfüzyonun akışını devre boyunca yönlendirir. Perfüzyon devresi, yalıtımlı su ceketli rezervuarda başlar. Daha sonra, perfüzyonat, özel bir gaz şişesinden% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit gaz karışımı alan oksijenatörden yönlendirilir. Oksijenasyonu takiben, perfüzyonat kabarcık tuzağından geçer, burada sıkışmış kabarcıklar peristaltik pompa tarafından rezervuara geri yönlendirilir. Kalan perfüzyonat ısı eşanjöründen akar ve rezervuara geri döndüğü organ odasına girer.

Burada, fare karaciğerleri için bir NEVLP oluşturma deneyimlerimizi rapor ediyoruz ve oksijen taşıyıcıları olmadan oksijenli ortam kullanılarak gerçekleştirilen bir pilot deneyin umut verici sonuçlarını paylaşıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan deneyleri, mevcut Alman yönetmeliklerine ve hayvan refahı yönergelerine ve Hayvan Araştırmalarını Raporlamak için ARRIVE yönergelerine göre gerçekleştirilmiştir. Hayvan deneyi protokolü Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Almanya tarafından onaylanmıştır (Onay Numarası: UKJ - 17 - 106).

NOT: Karaciğer donörü olarak 34 ± 4 g ağırlığındaki erkek C57BL/6J fareler (ortalama [SEM]'in ortalama ± standart hatası) kullanılmıştır. Kontrollü çevre koşulları altında (% 50 nem ve 18 - 23 ° C) standart fare chow ve suya serbest erişim ile muhafaza edildiler. Cerrahi işlem boyunca 60 nefes/dk'yı aşan solunum hızı korundu ve vücut ısısı 34 °C'nin üzerinde tutuldu.

1. Hazırlık

  1. Ameliyat masasının kurulması
    1. Tüm cerrahi aletleri ve sarf malzemelerini sterilizasyon amacıyla otoklavlayın.
    2. Isıtma tahtası ve elektrokoagülasyon dahil olmak üzere tüm ekipmanı açın.
    3. Sıcak bir inkübatöre (37 ° C) 25 mL heparinize (2.500 U / L) salin içeren bir adet 50 mL şırınga yerleştirin.
    4. Cerrahi aletleri, 6 - 0 ipek sütürü, steril küçük pamuklu aplikatörü, veteriner salini (500 mL) ve dokunmamış gazlı bez süngerlerini (10 cm x 10 cm) ameliyat masasına uygun şekilde yerleştirin.
    5. Safra borusunu safra toplama için almak üzere 0.5 mL mikrosantrifüj tüpünün kapağında küçük bir delik oluşturmak için ameliyat masasına 26 G'lık bir iğne yerleştirin.
    6. Kanülü (1 Fr poliüretan kanül veya UT - 03 polietilen kanül) ve safra toplanması için sterilize edilmiş 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünü ameliyat masasına yerleştirin.
  2. Kendi kendine yapılan portal ven kanülü
    1. 2 Fr kanülünü forseps ile tutun ve kanülün ucundan 1 cm mesafede 30 G'lik bir iğne ile duvarı delin. İğnenin ucu görünür hale gelene kadar iğneyi kanülden itin.
    2. Kanülün ucunu kesin ve keskin bir üçgen elde edin.
  3. Heparinize salinin hazırlanması
    1. Son konsantrasyonu 2.500 IU/mL olan 25 mL heparinize salin hazırlayın.
    2. Tüm hava kabarcıklarını çıkarın ve şırıngayı 40 ° C inkübatöre yerleştirin.
  4. Perfüzyon sisteminin gösterimi
    1. Makine perfüzyon sisteminin ana bileşenleri için Şekil 1'e bakınız.
  5. Organ odasının kurulması
    1. Organ odasının düzeni için Şekil 2'ye bakınız.
  6. Perfüzyon sisteminin kurulumu
    1. Basınç izleme için laboratuvar grafik programını açın.
    2. Basınç kalibratörünü ve basınç sensörünü organ odası seviyesinde bağlayın.
    3. Basınç kalibratörünü 0 mmHg'yi okuyacak şekilde ayarlayın ve basınç kontrol yazılımında karşılık gelen değeri kontrol edin.
    4. Basınç kalibratörünü 20 mmHg'yi okuyacak şekilde ayarlayın ve basınç kontrol yazılımında karşılık gelen değeri tekrar kontrol edin.
    5. Su banyosunu açın ve organ odasını önceden 40 ° C'ye ısıtın.
    6. Tüm sıhhi tesisat sistemini her biri 30 dakika boyunca damıtılmış deiyonize suyla iki kez yıkayın ve sterilizasyon çözeltisinin tamamen çıkarılmasını sağlayın.
    7. Kapsamlı dezenfeksiyonu sağlamak için dezenfeksiyon çözeltisinin tüm sistem boyunca 20 dakikalık bir süre boyunca dolaşımını başlatın.
    8. Gaz karışımını açın (% 95 oksijen (O2) ve% 5 karbondioksit (CO2).
  7. Perfüzyon dolgusu
    1. Williams'ın E besiyerinin tamamını hazırlamak için 50 mL fetal sığır serumu, 3 mL penisilin / streptomisin (1 mg / mL), 0.17 mL insülin (100 IE / mL), 0.34 mL heparin (5000 U / mL) ve 0.07 mL hidrokortizon (100 mg / 2 mL) ile 250 mL Williams E besiyeri takviyesi yapın.
    2. Sistemi hazırlamak için rezervuara ve organ odasına eşit miktarda (150 mL) perfüzyon ekleyin.
      NOT: Dolum işlemi sırasında sterilitenin korunmasına özel dikkat gösterilmelidir. Perfüzyon, kapalı devridaim makinesi perfüzyonunun bu iki temel bileşeninden sürekli olarak pompalanır.
    3. Perfüzyon sistemini oksijenli ortamla hazırlamak için peristaltik pompayı orta hızda (15 mL/dak) açın.

2. Karaciğer eksplantasyonu

  1. Ameliyat öncesi hazırlık
    1. Hayvanı tartın. Analjezik buprenorfin (0.3 mg / mL) (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) hazırlayın.
    2. İndüksiyon odasını duvar prizine bağlayın. Oksijeni 0,5 L/dk'ya çevirin. İzofluranı% 3'e çevirin.
    3. Derin anesteziye (sağ refleks pozitif) ulaşılana kadar hayvanı odaya yerleştirin.
    4. Vücut ağırlığına uyarlanmış analjezi dozunu deri altından uygulamak için bir mikro şırınga kullanın.
    5. Karın derisindeki kürkü kesmek için elektrikli tıraş makinesi kullanın.
    6. Fareyi ameliyat masasına aktarın ve anesteziyi korumak için izofluran buharlaştırıcıyı% 2,5'e kadar açın. İnterdigital ayak parmağı refleksini test ederek anestezinin derinliğini onaylayın.
  2. Fare karnının hazırlanması
    1. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin.
    2. Uygun anestezi derinliğini iki kez doğrulamak için interdigital refleksi test edin. Dört uzuvun hepsini bantla sabitleyin.
    3. Karnın her iki tarafını da art arda üç tur iyot-alkol kullanarak orta aksiller çizgiye dezenfekte edin. Cerrahi alanın etrafındaki alanı kaplamak için dokunmamış sterilize gazlı bez kullanın.
    4. Metzenbaum bebek makası ve cerrahi forseps kullanarak farenin karın bölgesinde ksifoidin 1 cm altında 3 cm'lik enine bir kesi yapın.
    5. Cilt insizyonunu iki taraflı olarak her iki taraftaki orta aksiller hatta uzatın.
    6. Yaylı makas kullanarak linea alba boyunca dikkatlice 2 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın.
    7. Karın kası tabakasını elektrokoagülasyon ve Vannas yay makası ile kesin.
    8. Karaciğeri elektrokoagülasyondan korumak için dikkatlice bir parça ıslak gazlı bez yerleştirin.
    9. Koroner ligamentin daha iyi maruz kalması için ksifoid işlemi geri çekmek için yuvarlak iğne ile 6 - 0 ipek sütür kullanın.
    10. Farenin karın boşluğunu tamamen ortaya çıkarmak için iki kaburga retraktörü kullanın.
    11. Hilumu tamamen açığa çıkarmak için ince bağırsağı ıslak bir pamuklu çubukla karın boşluğundan dikkatlice çıkarın.
  3. Ortak safra kanalı hazırlığı
    1. Falsiform, frenik ve gastrohepatik bağları keskin makasla transekte edin.
    2. Dişsiz ince kavisli forseps kullanarak ortak safra kanalını dikkatlice serbest bırakın.
      NOT: Ortak safra kanalı çok kolay hasar görür ve kırılır. Bir kez kırıldıktan sonra, kanüle edilemez. Anatomik pozisyonun yönü nedeniyle, kavisli forsepslerin kullanılması daha iyidir.
    3. Bir sonraki adıma hazırlanmak için ortak safra kanalının üzerine iki adet 6 - 0 ipek dikiş halkası yerleştirin.
  4. Ortak safra kanalı kanülasyonu
    1. Safra kanalını 30 G iğne ile dikkatlice delin. Küçük deliği safra kanalı kanülasyonuna uyacak şekilde büyütmek için sivri kavisli forseps kullanın.
    2. Safra kanalı kanülünü kavramak ve safra kanalına itmek için damar kanülasyon forsepslerini kullanın.
    3. Kanülü önceden ayarlanmış 6 - 0 dikiş halkaları ile iki kez sabitleyin.
      NOT: Kanülasyon sırasında safra direnci hissedilir. Kuvvet iyi kontrol edilmezse, kanül safra çıkış basıncı ile safra yollarından dışarı itilecektir. Kanülün derinliğini dikkatlice ayarlayın. Çok derinse, safra kanalına zarar verebilir ve yeterince derin değilse, kayabilir.
    4. Başarılı kanülasyondan sonra kanüldeki safra akışını gözlemleyin.
  5. Portal ven hazırlığı
    1. Portal veni düz forseps ile sıkıştırın ve bağ dokusunu kavisli forsepslerle dikkatlice serbest bırakın. Portal venin yırtılmasına neden olmamak için sert çekmeyin. Portal ven hasar gördüğünde, portal veni yeniden kanüle etmek zordur.
    2. PV'yi çatallanmadan hemen daha üstün bir şekilde disseke edin ve ilk dikiş halkasını 6 - 0 ipek sütür kullanarak PV üzerine daha sonra kullanmak üzere birleşime yakın bir yere yerleştirin.
    3. PV'nin daha sonra sabitlenmesi için ikinci dikiş halkasını hepatik hiluma mümkün olduğunca yakın yerleştirin.
  6. Portal ven kanülasyonu
    1. Distal portal veni kapatmak için bir arteriyel klips kullanın.
    2. Çok dikkatli bir şekilde, yukarıdaki portal ven kanüllerinden biriyle portal veni delin. Başarılı bir delinmeden sonra kanül içinde kan akışı açıkça gözlemlenebilir.
    3. PV kanülünü önceden yerleştirilmiş 6 - 0 dikiş halkası ile sabitleyin.
  7. Karaciğer kızarması
    1. İzofluranı% 5'e yükseltin ve fareyi aşırı dozda izofluran inhalasyonu ile ötenazi yapın.
    2. İnkübatörden önceden ısıtılmış heparin salin çözeltisi alın. Heparinize salin içinde oluşan tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
    3. Şırıngayı önceden ısıtılmış heparinize salin ile şırınga pompasına sabitleyin.
    4. Şırınga pompasının uzatma tüpünü portal venin kanülüne bağlayın, hızı 2 mL / dak'ya ayarlayın ve karaciğer kızarmasını başlatın.
    5. Yıkama prosedürünün sonunda karaciğerin rengini gözlemleyin. Renk homojen bir sarıya döndüğünde karaciğeri tüketin.
    6. Diyafram, suprahepatik inferior vena kava, infra hepatik vena kava, hepatik arter, distal portal ven ve kalan bağ dokusunu transekte edin.
    7. Karaciğeri Petri kabına yerleştirin.

3. Karaciğer ve oda bağlantısı

  1. Karaciğer transferi
    1. Bir Petri kabı kullanarak karaciğeri dikkatlice organ odasına aktarın.
    2. Karaciğerin kurumasını önlemek için Petri kabında az miktarda salin bulundurun.
      NOT: Portal ven ve safra kanalı bu işlem sırasında kolayca bükülebilir, bu da karaciğer perfüzyonunu ve safra toplanmasını etkileyebilir.
  2. Portal ven kanül bağlantısı
    1. Kanüldeki hava kabarcıklarını tahliye etmek için normal salini portal ven kanülüne bir şırınga ile yavaşça infüze edin.
    2. Portal ven kanülünü organ odasındaki perfüzyonat çıkış tüpüne bağlayın.
  3. Safra kanalı kanül bağlantısı
    1. Fare safra kanalı kanülünü organ odasına bağlı bir lastik kapağın valfinden geçirin.
    2. Safra kanalı kanülünü, kapakta küçük bir delik bulunan önceden hazırlanmış 0,5 mL'lik bir mikrotüpe yerleştirin.
    3. Mikrotüpü organ odasının dışındaki kil üzerine yerleştirin.

4. Akış hızını PV basıncına göre ayarlayın

  1. Peristaltik pompayı 1 mL/dk'dan açın.
  2. Akış hızını ayarlamak için portal ven basıncı okumasını kontrol edin.
  3. Akış hızını ayarlayarak portal ven basıncını fizyolojik aralıkta 7 - 10 mmHg arasında tutun.
    NOT: Nominal akış hızı, tüplerin kullanımına ve konumlandırılmasına bağlı olarak biraz değişebilir.

5. Örnek toplama

  1. Portal ven giriş tüpünden giriş perfüzyon numuneleri ve organ odasından çıkış perfüzyon numunelerini 3 saatlik aralıklarla alın.
  2. 12 saatlik perfüzyon periyodunun sonunda histolojik analiz için tüm karaciğer loblarından örnekler toplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cerrahi prosedürün oluşturulması
Bu deney için toplam 17 hayvan kullanıldı: Portal ven (PV) ve safra kanalının (BD) kanülasyonu da dahil olmak üzere organ tedarik sürecini optimize etmek için 14 fare kullanılırken, prosedürü doğrulamak için 3 fare kullanıldı (Tablo 1). Histolojik sonuçlar (Şekil 3) optimal perfüzyon durumunun belirlenmesini kolaylaştırmak için karşılaştırıldı.

Perfüzyon seçimi
Bu çalışma için daha önce kullanılan bir hepatosit kültürü ortamı seçildi10,11. William'ın E ortamı başlangıçta Williams ve Gunn tarafından olgun sıçan karaciğer epitel hücrelerinin uzun süreli in vitro ekimi için serumla indirgenmiş bir ortam olarak tasarlanmıştır12. Bununla birlikte, kemirgen hepatositlerinin büyümesini ve bakımını desteklemede de fayda bulmuştur13. Fetal sığır serumu (FBS), hücre büyümesini, çoğalmasını ve yaşayabilirliğini kolaylaştıran temel besin maddelerinin ve büyüme faktörlerinin zengin bileşimi nedeniyle yaygın olarak kullanılan bir hücre kültürü takviyesidir14. Tam William'ın E besiyeri, %20 fetal sığır serumu, %1 penisilin/streptomisin, 5.000 U/L heparin, 50 U/L insülin ve 0.010 g/L hidrokortizon ile desteklenmiş perfüzyonat olarak kullanıldı (Tablo 2).

Kanül seçimi
Kanülasyon prosedürü ilk önce safra sıvısı toplanması için safra kanalının (BD) kanülasyonunu, ardından portal venin (PV) kanülasyonunu içeriyordu. BD kanülasyonu için, başlangıçta dış çapı 0.3 mm ve iç çapı 0.18 mm olan bir UT-03 polipropilen tüp kullanılmıştır. Bununla birlikte, potansiyel BD hasarı ile ilgili endişeler ve kesilmiş ve sert UT-03 ucu ile ilişkili istenmeyen kateter yer değiştirme riskinin daha yüksek olması nedeniyle, 1 Fr poliüretan tüpler tercih edilmiştir. Poliüretan tüpler, daha yumuşak malzemeleri ve azaltılmış kayganlıkları ile BD kanülasyonu için daha uygun olarak kabul edildi.

Başlangıçta, portal venin (PV) kanüllenmesi için 26 G polipropilen intravenöz iğne kanülasyonu kullanıldı. Bununla birlikte, iğnenin çıkarılması ve ardından kanülün perfüzyon tüpüne tutturulması, intrahepatik sinüzoidleri tıkama potansiyeline sahip kabarcıkların oluşmasına neden olmuştur. Bu sorunun üstesinden gelmek için, 2 Fr poliüretan kanülün distal 1 cm'sine yerleştirilen 30 G'lik bir iğne kullanılarak bir konut kanülü inşa edildi. Bu kendi kendine yapılan "iğne kılavuzlu kanül" daha sonra birleşme noktasının üzerindeki distal PV'ye yerleştirildi. Kateter PV içine yerleştirildiğinde, iğne aynı anda tüpü ilerletirken yavaşça çekildi. Kendi kendine yapılan kanülün ucu, odanın içindeki perfüzyon tüpüne bağlandı. Bu kanülasyon tekniğinde yumuşak bir malzeme kullanmak, damarın arka duvarında yaralanma riskini azaltarak avantaj sağlamıştır.

Validasyon çalışmaları
Giriş ve çıkış perfüzyon numuneleri pH ve potasyum seviyelerinin belirlenmesine tabi tutuldu. Elde edilen sonuçlar (Şekil 4) daha sonra son yayınlarda bildirilen bulgularla karşılaştırılmıştır15,16,17. Üç fare karaciğeri oksijenli olarak perfüze edildi ve 12 saat boyunca William'ın E ortamı ile desteklendi. Bu süre zarfında, 7 - 10 mmHg'lik sabit bir perfüzyon basıncı sürekli olarak kaydedildi. Ortalama pH, 12 saatlik perfüzyon boyunca nispeten kararlıydı ve 7.3 ile 7.7 arasında değişiyordu. Ortalama potasyum seviyeleri de perfüzyon periyodu boyunca stabildi ve 5.9 ila 6.8 mmol / L arasında değişiyordu (Şekil 4). PV akış hızı, deneysel prosedürler sırasında pompa borularının kullanımına ve konumlandırılmasına bağlı olarak 0,8 - 1,2 mL / dak / g aralığında tutulmuştur. Fare karaciğeri perfüzyonunda gözlenen tüm sonuçlar, sıçan karaciğer perfüzyonunda daha önce bildirilen gözlemlerle benzerlikler göstermiştir (Tablo 3).

Doku örnekleri üç karaciğerden (N = 3) toplandı ve HE-boyama için optimize edilmiş protokol kullanılarak 12 saatlik perfüzyona tabi tutuldu, ardından tüm slayt taraması yapıldı. Her karaciğer lobu modifiye Suzuki skoru kullanılarak puanlandı (Tablo 4). Klasik Suzuki skoru18 , üç ek parametre eklenerek arttırıldı: çekirdeklerin piknozu, damarların ayrılması ve sinüzoidlerde ve büyük damarlarda eritrositlerin varlığı. Her parametre yok (0), hafif (1), orta (2) ve şiddetli (3) olarak derecelendirildi. 0 - 7 final puanının iyi korumayı yansıttığı, 8 - 14 - 14 orta derecede koruma olarak alındığı ve 14 - 21 kötü korumayı gösterdiği düşünülmüştür.

Fare karaciğerlerinin korunması, modifiye Suzuki skoruna göre değerlendirildi. İki tıp uzmanı, üç karaciğerin yedi lobunun morfolojisinin bağımsız bir değerlendirmesini yaptı (Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7). Her karaciğer lobu için yedi lob skorunun ortalaması hesaplandı; Düşük puanlar daha iyi korunmuş bir karaciğeri gösterir. Uzmanlar tarafından yapılan değerlendirmeler yüksek derecede uyum sergiledi. Özellikle, çekirdeklerin piknozunun değerlendirilmesinde iki uzman tarafından verilen puanlarda hafif tutarsızlıklar gözlenirken, bu varyasyonlar genel puanlama sonuçlarını önemli ölçüde etkilememiştir.

En iyi ihtimalle, karaciğer parankimi, normal bir karaciğerden neredeyse hiç ayırt edilemeyen, iyi korunmuş tipik bir lobüler yapı ile nispeten sağlamdı. Hepatositler, açıkça görülebilen hücre zarları ve yuvarlak çekirdeklerle canlı görünüyordu. Bununla birlikte, bazı çekirdeklere piknoz uygulandı ve bazı hepatik sinüzoidler hafifçe dilate edildi ve 4 puanla sonuçlandı. (Şekil 3, Şekil 6)

En kötüsü, lobüler yapı bozuldu, damarlar parankimden ayrıldı ve konfluent parankimal nekroz. Hücresel düzeyde, hücresel vakuolizasyon ve çekirdek piknozu, özellikle perisantral bölgede belirgin hale geldi. Ayrıca, hafif ila orta derecede vakuolizasyon gözlendi. Hepatositlerin %30'a varan bir kısmında nekroz uygulanıyordu ve bu da maksimum skorun 14 olmasıydı. (Şekil 3, Şekil 7)

Tablo 1: Fare karaciğer perfüzyon modelinin adım adım oluşturulması. Kuruluş sürecinde kanül boyutu, materyali ve pozisyonundaki farklılıklar nedeniyle çeşitli komplikasyonlar gözlendi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: İn vitro organ koruma yöntemlerinin karşılaştırılması 15,17,19,20,21,22. Perfüzyonat seçiminin, oksijen taşıyıcı seçiminin ve besin bileşeni karşılaştırmasının optimizasyonu, çeşitli depolama koşulları altında çok önemlidir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: Normal sıçanlarda hemodinamik ve kan gazı analizi ve sıçan NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Sağlanan bilgiler, sıçan karaciğerinin hemodinamik özelliklerini ve normotermik perfüzyonun anahtar parametrelerini in vitro olarak seçici olarak tanımlamaktadır. Spesifik olarak, PV basıncı tipik olarak 4 ila 10 mmHg arasında değiştiğinde sıçan karaciğer perfüzyonu optimal olarak kabul edilebilir ve PV'ye giren perfüzyondaki kısmi oksijen basıncı 80 ila 550 mmHg arasında değişir ve başarılı in vitro sıçan karaciğer perfüzyonu için gerekli kriterleri karşılar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4: Değiştirilmiş Suzuki skoru. Bu çalışmada kullanılan modifiye Suzuki skoru, üç ek parametre ekleyerek klasik Suzuki skorunu genişletir: çekirdeklerin piknozu, damarların ayrılması ve sinüzoidlerde ve büyük damarlarda eritrositlerin varlığı. Her parametreye 0 (yok), 1 (hafif), 2 (orta) veya 3 (şiddetli) ölçeğinde bir not verildi. 0 ila 8 arasında değişen toplam puan, iyi korumayı gösterir; 9 ila 16 orta derecede korumayı gösterir ve 17 ila 24 zayıf korumayı gösterir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 5: Sıçanlarda NEVLP'nin literatür çalışmasına dayanarak perfüzyon ortamı, perfüzyonat hacmi ve perfüzyon basıncı seçimi (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. Sıçan karaciğerinde norannemik makine perfüzyonu, kullanılan perfüzyonun spesifik tipi ve hacmi ile perfüzyon süresi açısından çalışmalar arasında değişkenlik gösterebilir. Farklı çalışmalar, diyaliz veya yüksek hacimli perfüzyon gibi farklı yaklaşımları uzun süreler boyunca kullanabilir. Bununla birlikte, bu farklılıklara rağmen, portal basınç, portal ven akış hızı ve perfüzyondaki kısmi oksijen basıncı gibi parametreler genellikle kullanılan çeşitli yöntemler arasında minimum varyasyon göstermektedir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Figure 1
Resim 1: Perfüzyon sisteminin şematik diyagramı. Temel bileşenler organ odası, termostatik makine, makaralı pompa, oksijenatör ve rezervuardır. Perfusat, rezervuardan peristaltik bir pompa ile bir oksijenatöre pompalanır. Oksijenatörde %95 O2 ve %5 CO2 olmak üzere kesintisiz gaz akışı vardır. Perfüzyon, perfüzyonda bulunan herhangi bir hava kabarcığının yakalandığı ve rezervuara geri pompalandığı kabarcık tuzağından geçer. Kalan perfüzyonat, tüpün portal vene bağlandığı organ odasına akar. Organ odasından perfüzyonat çıkışı, peristaltik pompa tarafından rezervuara geri yönlendirilir. Safra toplamak için organ odasına bir safra drenaj tüpü bağlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: Perfüzyon odasının yakın çekimi. Organ perfüzyon odası bir perfüzyon giriş ve çıkışı, bir kabarcık tuzağı, bir ısı eşanjörü ve bir safra toplama portu içerir. Perfüzyon pompası basıncının gerçek zamanlı izlenmesi, bir basınç sensörü kullanılarak gerçekleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Normal ve perfüze edilmiş fare karaciğerlerinin histolojik sonuçları. (A) Normal fare karaciğer morfolojisi (kontrol). (B) 12 saatlik perfüzyondan sonra HE-boyama ile görselleştirilen en iyi korunmuş morfoloji örneği. (C). 12 saatlik perfüzyondan sonra HE-boyama ile görselleştirilen en kötü korunmuş morfoloji örneği. Siyah ok vakuolizasyonu, kırmızı ok sinüzoidal dilatasyonu, sarı ok çekirdeklerin piknozunu ve yeşil ok vasküler dekolmanı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Perfüzyon analizi. Ph (A) ve potasyum seviyeleri (B). Her iki parametre de 12 saatlik gözlem süreleri boyunca sabittir ve sabit perfüzyon koşullarını gösterir Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Modifiye edilmiş bir Suzuki skoru 4-7 ile sonuçlanan küçük karaciğer hasarı. 12 saatlik NEVLP'den sonra, karaciğer morfolojisinin yarı kantitatif bir değerlendirmesi yapıldı. Her karaciğer lobundan alınan örnekler ayrı ayrı değerlendirildi ve derecelendirildi, bu da her karaciğer için bir aralık ve ortalama bir puan ile sonuçlandı ve mümkün olan en yüksek puan 4 oldu. Karaciğer lobuna bağlı olarak 4-7 arasında değişen skorlarla iyi korunmuş karaciğer morfolojisi (ortalama = 5) (Skor 0-7: iyi korunmuş karaciğer morfolojisi, skor 8-14 orta derecede korunmuş morfoloji, skor 15-21: kötü korunmuş karaciğer morfolojisi) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Orta derecede karaciğer hasarı, değiştirilmiş bir Suzuki skoru 7-14 ile sonuçlanır. Modifiye Suzuki skoruna göre 12 saatlik normotermik oksijenli makine perfüzyonundan sonra karaciğer morfolojisinin yarı kantitatif değerlendirmesi. Skoru 7 ile 14 arasında değişen orta derecede korunmuş morfoloji (ortalama = 11). (Skor 0-7: iyi korunmuş karaciğer morfolojisi, skor 8-14 orta derecede korunmuş morfoloji, skor 15-21: kötü korunmuş karaciğer morfolojisi) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Minör - orta derecede karaciğer hasarı, değiştirilmiş bir Suzuki skoru 5-11 ile sonuçlanır. Homojen olmayan perfüzyon, farklı karaciğer loblarında minör ila orta derecede korunmuş morfoloji ile sonuçlandı ve skorlar 5 ila 11 arasında değişti (ortalama = 8). (Skor 0-7: iyi korunmuş karaciğer morfolojisi, skor 8-14 orta derecede korunmuş morfoloji, skor 15-21: kötü korunmuş karaciğer morfolojisi) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokoldeki kritik adımlar
Karaciğer eksplantasyonunda iki önemli adım, portal venin (PV) kanülasyonu ve ardından safra kanalının (BD) kanülasyonudur. Bu adımlar, başarılı organ alımı ve ardından perfüzyon veya transplantasyon prosedürlerinin sağlanmasında büyük önem taşımaktadır.

Zorluklar ve çözümler
PV kanülasyonu üç zorluk ortaya çıkarır: damar duvarının yaralanması, kateterin yer değiştirmesi ve yerleştirme işleminin uygulanabilirliği. PV damar duvarının hassas yapısı, kanülasyon sırasında dikkatli bir şekilde ele alınmazsa delinmeye ve ardından kanamaya duyarlı hale getirir. Ayrıca, PV'den herhangi bir kan kaybı, portal basıncı düşürür ve PV kanülünün yerleştirilmesini daha zor hale getirir. Ayrıca, portal venöz duvardaki bir yaralanma, intrahepatik vasküler sisteme hava embolisi sokabilir. Bu nedenle, PV kanülasyon işlemi sırasında hassasiyet ve dikkat göstermek, komplikasyon riskini en aza indirmek için çok önemlidir.

PV kanülasyonu sırasında, kateter yer değiştirme riski, özellikle kaygan malzemelere sahip kanüller kullanıldığında yaygın bir endişe kaynağıdır. Polipropilene kıyasla, poliüretan kanüllerin kullanımı PV kanülasyonu için daha uygundur. Poliüretanın yumuşak ve esnek yapısı, potansiyel olarak malzeme özelliklerine atfedilen kateter yer değiştirme veya kayıp riskini önemli ölçüde azaltır. Ek olarak, yumuşak bir kanül kullanmak, kan damarlarının endotel tabakasına zarar verme olasılığını en aza indirir. Çalışmada PV kanülasyonu için 24 G polipropilen, 26 G polipropilen ve 2 Fr poliüretan olmak üzere üç tip vasküler erişim kanülü karşılaştırılmıştır. Bu seçenekler arasında, hem 26 G hem de 2 Fr poliüretan kanüller, fare PV'sinin boyutuyla daha iyi uyumluluk göstermiştir. 26 G kanül daha iyi anatomik uyumluluk sergilerken, dış çapı 0.66 mm olan 2 Fr poliüretan kanül, benzersiz malzeme özellikleri nedeniyle amaçlanan uygulama için uygun görülmüş ve PV'den kasıtsız kateter çıkımı riskini etkili bir şekilde en aza indirmiştir.

Yerleştirmenin uygulanabilirliği ile ilgili olarak, farklı teknikler test edildi. Bunun bir yolu, PV'nin proksimal ve distal uçlarını sıkıştırmak, ince makasla küçük bir delik açmak ve PV kanülünü yerleştirmektir. Bu teknik, eşzamanlı eylemlerin karmaşıklığı ve gerekliliği nedeniyle ek bir kişinin katılımını gerektirir. Sonuç olarak, tek bir mikrocerrahın prosedürü bağımsız olarak gerçekleştirmesi mümkün değildir. Bu nedenle, iç iğneli bir kateter ve bir dış kanül gereklidir. Daha önce açıklandığı gibi, ticari olarak temin edilebilen sert ve pürüzsüz 26 G polipropilen kanülün kullanılması, kanülü yıkama sistemine bağlarken kayma ve hava kabarcıklarının oluşması riskini taşır. Bu endişeleri gidermek için, bir iğne kateterinden 26 G'lik bir iğnenin uzun ve esnek bir poliüretan 2 Fr kanülüne sokulmasıyla kendi kendine inşa edilmiş bir "iğne kılavuzlu tüp sistemi" tasarlanmıştır. Bu yaklaşım üç temel avantaj sunar: (1) kateter yerleştirme sistemi, (2) uzun ve esnek bir tüp ve (3) uygun malzeme özellikleri. Bununla birlikte, bu adım sırasında, ilerlerken iğne ucunun PV duvarına temas etmesini önlemek için dikkatli olmak çok önemlidir, çünkü bu, damar duvarında geri dönüşü olmayan bir hasara neden olabilir.

BD kanülasyonu aynı üç zorluğu ortaya çıkardı: damar duvarının yaralanması, kateterin yer değiştirmesi ve yerleştirme işleminin uygulanabilirliği. Sonuçta, 1 Fr poliüretan kanül, uygun malzeme özellikleri nedeniyle UT - 03 polipropilen kanülden daha uygun görülmüştür. UT - 03 kanülünün (0.30 mm) 1 Fr ısıya duyarlı poliüretan tüpe (0.33 mm) kıyasla biraz daha küçük dış çapına rağmen, poliüretan malzeme serttir ve bükülmeye daha az eğilimlidir. Öte yandan, yumuşak ve esnek olan 1 Fr kanül, daha kolay yerleştirme sağlar ve böylece tercih ettiğimiz seçenek haline gelmiştir. Bununla birlikte, BD boyutunun son derece küçük olduğu ve daha büyük 2 Fr kanülünü barındıramadığı durumlarda, UT - 03 kanülü uygulanabilir bir alternatif olmaya devam etmektedir. Bu gibi durumlarda, kanülün BD'den yer değiştirmesini önlemek için özel dikkat gösterilmelidir.

Literatür taramasında özetlendiği gibi (Tablo 5),deneycilerin çoğu 19,41,42,46 portal akış hızını 1 - 3 mL / dak / g karaciğer kullanmıştır. Bununla birlikte, fizyolojik portal basıncı 4 - 10 mmHg28 aralığında tutmak için akış hızı ayarlanmalıdır. Yüksek PV basıncı sinüzoidal dilatasyona ve vasküler dekolmana neden olabilir. Düşük PV basıncı ve düşük PV akış hızı, düşük akışlı hipooksijenasyona ve ardından orta zonalden perisantral nekroza neden olabilir. PV akış hızının manipülasyonu, kullanılan kanüle ve karaciğerin boyutuna göre değişebilen PV basıncını düzenleme işlevine hizmet eder, böylece PV akış hızında küçük ayarlamalar yapılmasını gerektirir. Bu nedenle, bu çalışmada, perfüzyon 1 mL / dak / g karaciğer akış hızında başlatılmış ve aynı zamanda, akış hızını ayarlayarak fizyolojik PV basıncını korumak için bir kan basıncı transdüseri kullanılarak PV basıncı izlenmiştir.

NEVLP modelinin geliştirilmesi sırasında, perfüzyona yıkanmış kırmızı kan hücreleri ekleyerek perfüze edilen karaciğere oksijen tedarikini daha da iyileştirmek için bir girişimde bulunulmuştur. Bununla birlikte, büyük oda ve rezervuarda eritrositlerin önemli ölçüde çökelmesi gözlenmiş, böylece perfüzyon sırasında oksijen taşıyıcılarının organa verilmesi azaltılmıştır. Ayrıca, eritrositlere verilen hasar, bir silikon tüpü sıkıştırarak perfüzyonu tahrik eden peristaltik perfüzyon pompasının mekanik etkisinden kaynaklanmıştır. Her iki neden de bu deneyde kırmızı kan hücrelerini kullanmama kararımızı kolaylaştırdı. Perflorokarbon bazlı oksijen taşıyıcıları bu sorunları çözebilir47.

Perfüzyon sırasında karaciğer greftinin canlılığını değerlendirmek için, fare safra sıvısı 3 saatlik aralıklarla toplandı. Bununla birlikte, fare safra sıvısının yüksek viskozitesi nedeniyle kateter yoluyla safra toplamak zordur. Bu başlangıçta BD'ye yerleştirilen ince 1 Fr poliüretan kateter tarafından indüklenen kılcal kuvvetlerle telafi edilir. Bununla birlikte, deneyin ilk saatinde sadece yaklaşık 20 μL safra sıvısı toplanabildi. Kanülden boşalmak yerine, safra kesesinin retrograd dolgusu gözlendi.

12 saatlik perfüzyon periyodunun sonunda safra kesesi, makine perfüzyonu sırasında aktif safra üretimini düşündüren berrak safra sıvısı ile dolduruldu. Bu, safra kesesine daha büyük bir tüp yerleştirilerek potansiyel olarak önlenebilir.

Bu arada, hepatik hücresel ve lobüler yapının histolojik hasarı, korunma sonucunu belirlemek için değerlendirildi. Aynı karaciğer içinde bile korumanın homojen olmadığı gözlendi. Yapısal değişikliklerin homojen olmaması, perfüzyonun karaciğer boyunca heterojen olduğunu düşündürmektedir (Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7). Ayrıca, histolojik bulgular, makine perfüzyonu sırasında fare karaciğer greftinin yapısal bütünlüğünün en az 12 saat süreyle korunabileceğine dair kanıtlar sunmaktadır. Bununla birlikte, sağlam karaciğer histolojisinin varlığı sadece değerlendirmeye yardımcı olabilir, ancak karaciğerin işlevini ve canlılığını kesin olarak belirleyemez. Hücresel hasarın nihai tezahürü olarak nekrozun daha sonraki bir aşamaya kadar kolayca gözlemlenemeyebileceği belirtilmelidir. Bu nedenle, sadece histolojik değerlendirmeye güvenmek, karaciğerin fonksiyonel durumu ve canlılığı hakkında kapsamlı bir anlayış sağlamayabilir. Fonksiyonel tahliller, biyokimyasal belirteçler ve metabolik aktivitenin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere karaciğerin genel durumunu belirlemek için diğer tamamlayıcı tahliller ve değerlendirmeler gereklidir.

12 saatlik perfüzyondan sonra iyi koruma sağlandı. Bununla birlikte, organ onarımı için mümkün olan perfüzyon süresini daha da uzatmak, bazı sorunların ele alınmasını gerektirir. Öncelikle belirtmek gerekir ki, 12 saati aşan uzun süreli perfüzyon sürelerine ulaşmak, sadece temiz koşullardan ziyade steril koşulların korunmasını gerektirecektir. Bununla birlikte, bu ilk deneylerde, sterilite sağlamak prosedüre ek karmaşıklıklar getireceğinden, steril koşullardan ziyade temiz koşulların korunmasına odaklanılmıştır. İkincisi, daha uzun perfüzyon, biriken toksik metabolik atık ürünlerini gidermek için Herman Tolboom22 tarafından tanımlandığı gibi bir diyaliz ünitesi eklenmesini gerektirecektir. 4 saat boyunca 10 g'lık bir sıçan karaciğerini perfüze etmek için toplam hacmi 55 - 60 mL olan bir sistem kullandılar. Bu çalışmada, yaklaşık 1 g ağırlığındaki fare karaciğerinin küçük boyutuna rağmen, toplam hacmi 300 mL olan nispeten büyük bir rezervuar kullanılmıştır. Bu yapılandırma, 50 kat ek bir seyreltme faktörü ile sonuçlandı. Dikkat çekici bir şekilde, bu kurulumla 12 saatlik perfüzyon süresi boyunca zararlı bir etki gözlenmemiştir. Üçüncüsü, daha uzun perfüzyon, Dondossola ve ark.47 ve Jägers ve ark.48 tarafından tanımlandığı gibi, yeterli oksijen tedarikini sağlamak için en iyi ihtimalle yapay hemoglobin formunda oksijen taşıyıcılarının eklenmesini de gerektirecektir.

NEVLP'ye dayalı "iskemik olmayan" karaciğer transplantasyonunun geliştirilmesi, şüphesiz iskemi-reperfüzyon hasarı sorununu çözmeye ve hatta önlemeye yönelik yeni fikirler ve yöntemler getirmiştir. Bununla birlikte, NEVLP, organ korumasını iyileştirmek için çok umut verici bir kavramdır ve organ korumasını organ onarımına genişletmek için potansiyel uygulamasıdır47.

Günümüzde deneysel ve klinik olarak üç farklı makine perfüzyon tekniği kullanılmaktadır. Temel fark çalışma sıcaklığıdır: hipotermik makine perfüzyonu, subnoannemik makine perfüzyonu ve normotermik makine perfüzyonu (Tablo 2). Diğer farklılıklar arasında koruma çözeltisi seçimi, perfüzyon çözeltisi ve oksijen taşıyıcılarının eklenmesi sayılabilir (Tablo 5).

NEVLP esas olarak avantajlıdır, çünkü (1) organ normal sıcaklığında tutulur, (2) oksijenlenir ve (3) metabolik olarak tamamen sağlanır. Sistem, tanısal değerlendirme, müdahale tedavisi ve nihayetinde organ onarımı için mükemmel bir platform sağlar49. Bununla birlikte, NEVLP, ex vivo organ destek teknolojisi için büyük bir zorluk teşkil etmektedir. NEVLP için zorluk, fizyolojik duruma yakın durumu yansıtmaktır. Yakın zamana kadar, küçük boyut ve standart değerlendirme kriterlerinin eksikliği nedeniyle, sadece sınırlı sayıda kemirgen NEVLP çalışması yapıldı 25,26,27,28,29,30,31.

Burada fare modelinin 12 saatlik bir koruma süresine izin veren geçerli bir model olduğu gösterilmiştir. Buna karşılık, çoğu sıçan çalışması perfüzyon sürelerini 6 saat veya daha az28,33 olarak bildirmiştir. Ek olarak, küçük hayvanların kullanımı, bol miktarda reaktifin mevcudiyeti ve daha düşük deney maliyetleri nedeniyle moleküler çalışmalar için büyük hayvanlara kıyasla avantajlıdır. Örneğin, fareler şu anda ATG gen ailesinin nakavt modellerini test etmek için, özellikle karaciğerdeki iskemi-reperfüzyon hasarının sinyal yollarını incelemek için tercih edilen bir seçenektir 8,50.

NEVLP ile ilgili sıçan karaciğerleri üzerinde yapılan deneyler, normotermik makine perfüzyon korumasının, soğuk korumaya kıyasla hepatosellüler hasarın azalması ve transplantasyon sonrası erken sağkalımın iyileşmesi ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur 31,40,51,52,53,54. Sıçan karaciğerlerini kullanan NEVLP, perfusata ilaç veya hücre ilavelerini incelemek için de uygundur. Etkileyici bir örnek, Wnt sinyal yolu aracılığıyla karaciğer greftlerinin kalitesini artırmak için normotermik makine perfüzyonu ile birleştirilmiş heme oksijenaz-1 modifiye mezenkimal kök hücreleri kullanan Xuan Tian26'nın çalışmasıdır. 39 yaşındaki Haojie Wang, son çalışmasında, perfüzyona kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin eklenmesinin, kısa süreli perfüzyon için sıçanlarda NEVLP kalitesini büyük ölçüde artırabileceğini doğruladı. DCD karaciğerlerini kullanan çalışmalarında, NEVLP ile kombine edilen kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, hepatik sinüzoidal tıkanıklığı ve endotel hasarını inhibe etmiştir. Mezenkimal kök hücrelerin eklenmesi intrahepatik makrofaj aktivasyonunu ve hücreler arası adezyonu engelledi. Ayrıca, mezenkimal kök hücrelerin eklenmesi, karaciğer perfüzyonunu ve mikrosirkülasyonunu iyileştirmek için endotelin-1 / endotelyal nitrik oksit dengesini düzenlemiştir.

Fareler, özellikle transgenik veya genetiği değiştirilmiş karaciğerlere odaklanan moleküler çalışmalar bağlamında, NEVLP söz konusu olduğunda sıçanlara göre belirgin bir avantaj sunmaktadır. Bununla birlikte, hayvanın küçük boyutu nedeniyle, prosedür mikrocerrah37 için daha büyük ama yönetilebilir bir zorluk teşkil etmektedir.

Histolojik değerlendirme için derecelendirme sistemi
Histolojik değerlendirme, perfüzyon koşullarının greftin morfolojik bütünlüğü üzerindeki etkisini belirlemede belirleyicidir.

Suzuki skoru, karaciğer patolojisini değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmakla birlikte, bu puanlama sisteminin ex-vivo karaciğer korunmasında gözlenen spesifik bulguları yeterince yakalayamayabileceği belirtilmiştir. Bu sınırlamayı ele almak için, korunmuş karaciğer dokusunun kapsamlı değerlendirmesini geliştirmek için dört ek kriter getirilmiştir (Tablo 4). İlk olarak, hücresel hasarın göstergesi olan değerli bir parametre olarak hizmet ettiği için nükleer piknoz değerlendirmesinin dahil edilmesi uygulanmıştır. İkincisi, hepatik lobülün hasar anlamına gelen damar ve hepatosit dekolmanı değerlendirilmesi ek bir kriter olarak dahil edilmiştir. Son olarak, sinüzoidlerde eritrositlerin varlığının derecelendirilmesi, heterojen kızarma ve perfüzyonun bir göstergesi olarak kullanılmıştır. Bu ek kriterleri dahil ederek, korunmuş karaciğer dokusunun durumunun daha nüanslı ve doğru bir değerlendirmesi sağlandı ve ex-vivo karaciğer korumasının etkilerinin daha derin bir şekilde anlaşılması sağlandı.

Hepatosit vakuolizasyonu55 , substrat kullanımındaki değişiklikler, enerji harcaması, mikrotübül parçalanması ve protein sentezinin inhibisyonundan sonra ortaya çıkar. Hepatositin çekirdeği, büyük vakuoller tarafından hücrenin çevresine doğru kaymaya zorlanır. Bu sürece sıklıkla nükleer piknoz eşlik eder. Bu çalışmada, 12 saatlik normotermik makine perfüzyonu, homojen olmayan perfüzyonu düşündüren kontrole kıyasla hepatositlerin farklı derecelerde vakuolizasyonuna yol açmıştır.

Bu çalışmada hepatosit kordonları arasında dilate sinüzoidlerin varlığı dikkat çekiciydi. Bu fenomen esas olarak hepatik venöz çıkış obstrüksiyonundan kaynaklanır ve hepatik parankim içinde vasküler staz ve tıkanıklığa yol açar. Bu fare karaciğer modelinde, organın küçük boyutu nedeniyle tutarlı bir portal perfüzyon basıncının korunmasıyla ilgili zorluklar, hepatik sinüzoidlerin gözlenen genişlemesine katkıda bulunabilir.

Nekrotik değişiklikler tipik olarak hücre kümelerinde, bölgesel alanlarda veya belirli bölgelerde kendini gösterir. İyi perfüze edilmiş periportal alan, perisantral alana kıyasla hepatositlerin nispeten daha iyi korunmasını sağlamıştır. Çift damarlı karaciğer perfüzyonu, sıçan karaciğerlerindegösterildiği gibi 20, hepatik arterin küçük boyutu nedeniyle fare karaciğerlerinde daha büyük bir zorluk oluşturur. Sonuç olarak, fare karaciğerinin gözlenen homojen olmayan perfüzyonu, en azından kısmen, bu sınırlamaya bağlanabilir.

Bu gözlemler NEVLP uygulanan fare karaciğerlerine özgü değildir, ancak açıkça tanımlanmamış olsalar da, diğer NEVLP çalışmalarından elde edilen histolojik görüntülerde de görselleştirilebilir.

Fare NEVLP'nin Önemi ve Potansiyel Uygulamaları
Fare karaciğerlerinin NEVLP'si zorlu ama uygulanabilir bir prosedürdür. NEVLP'nin yararlı etkisinin altında yatan mekanizmayı aydınlatmak için bu teknolojiden en iyi şekilde yararlanmak için daha fazla çabaya ihtiyaç vardır. Bilgimizi arttırmak, bu teknolojinin ilerici evrimini kolaylaştıracak ve onu organ korumanın ötesine "organ onarımı" alanına doğru dönüştürecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Açıklanacak finansal çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu yazının yazımı boyunca çok fazla destek ve yardım aldım. Takım arkadaşım XinPei Chen'e operasyonum sırasında harika işbirliği ve hasta desteği için özellikle teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 ml Micro Tube PP Sarstedt 72699
1 Fr Rubber Cannula Vygon Sample Cannula
10 µL Micro Syringe Hamilton 701N
2 Fr Rubber Cannula Vygon Sample Cannula
24 G Butterfly Cannula Terumo SR+OF2419
26 G Butterfly Cannula Terumo SR+DU2619WX
30 G Hypodermic Needle Sterican 100246
50 ml Syringe Pump Braun 110356
6-0 Perma-Hand Seide Ethicon 639H
Arterial Clip Braun BH014R
Autoclavable Moist Chamber Hugo Sachs Elektronik 73-4733
Big Cotton Applicator  NOBA Verbandmittel Danz GmbH 974018
Bubble Trap Hugo-Sachs-Elektronik V83163
Buprenovet (0.3 mg / ml) Elanco /
CIDEX OPA solution (2 L) Cilag GmbH 20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C ERBE /
Fetal Bovine Serum(500 ml)  Sigma-Aldrich F7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) House Supply /
Heating Circulating Baths Harvard-Apparatus 75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml) Braun 1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) Pfizer 15427276
Insulin(100 IE / ml) Sigma I0516-5ML
Iris Scissors  Fine Science Instruments 15000-03
Isofluran (250 ml) Cp-Pharma 1214
Membrane Oxygenator Hugo Sachs Elektronik T18728
Microsurgery Microscope  Leica M60
Mouse Retractor Set  Carfil Quality 180000056
NanoZoomer 2.0 HT Hamamatsu /
Non-Woven Sponges  Kompressen 866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)  C.C.Pro Z-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm) Braun 4256000
Peristaltic Pump Harvard-Apparatus P-70
Petri Dishc 100x15 mm VWR® 391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) Livisto 799-416
Pressure Transducer Simulator UTAH Medical Products 650-950
Reusable Blood Pressure Transducers AD Instruments MLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation Forceps Fine Science Instruments 00608-11
Small Cotton Applicator NOBA Verbandmittel Danz GmbH 974116
Straight Forceps 10 cm  Fine Science Instruments 00632-11
Suture Tying Forceps Fine Science Instruments 11063-07
Syringe 50ml Original Perfusor Braun 8728810F-06
UT - 03 Cannula Unique Medical, Japan /
Vannas Spring Scissors Fine Science Instruments 15018-10
Veterinary Saline (500 ml) WDT 18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L Harvard-Apparatus 73-3441
William's E Medium (500 ML) Thermofischer Scientific A1217601

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
  2. Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
  3. Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
  4. Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
  5. Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
  6. Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
  7. Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. 3rd Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
  8. Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
  9. Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
  10. van der, V. alk J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
  11. Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
  12. Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
  13. Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
  14. Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
  15. Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
  16. Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
  17. Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
  18. Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
  19. Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
  20. Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
  21. Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
  22. Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
  23. Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
  24. Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
  25. Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
  26. Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
  27. Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
  28. Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) - farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
  29. Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
  30. Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
  31. Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
  32. Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
  33. Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
  34. Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
  35. Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
  36. Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
  37. Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
  38. Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
  39. Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
  40. Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
  41. Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
  42. Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
  43. Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
  44. Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
  45. Von,, Horn, C., Zlatev, H., Pletz, J., Lüer, B., Minor, T. Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
  46. Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William's E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
  47. Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
  48. Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
  49. Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
  50. Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
  51. Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
  52. Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
  53. Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
  54. Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
  55. van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 199 Karaciğer Perfüzyonu Normothermic Mouse Ex Vivo
Normothermic <em>Ex Vivo Karaciğer</em> Makinesi Farede Perfüzyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Dirsch, O., Albadry, M.,… More

Chen, H., Dirsch, O., Albadry, M., Ana, P. H., Dahmen, U. Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse. J. Vis. Exp. (199), e65363, doi:10.3791/65363 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter