Summary
È stato creato un sistema di perfusione epatica normotermica ex vivo (NEVLP) per i fegati di topo. Questo sistema richiede esperienza in microchirurgia, ma consente risultati di perfusione riproducibili. La capacità di utilizzare fegati di topo facilita lo studio dei percorsi molecolari per identificare nuovi additivi perfufulati e consente l'esecuzione di esperimenti incentrati sulla riparazione degli organi.
Abstract
Questo protocollo presenta un sistema NEVLP ottimizzato privo di eritrociti utilizzando fegati di topo. La conservazione ex vivo dei fegati di topo è stata ottenuta impiegando cannule modificate e tecniche adattate dalle tradizionali apparecchiature commerciali di perfusione ex vivo . Il sistema è stato utilizzato per valutare i risultati di conservazione dopo 12 ore di perfusione. I topi C57BL / 6J sono serviti come donatori di fegato e i fegati sono stati espiantati inannulando la vena porta (PV) e il dotto biliare (BD), e successivamente lavando l'organo con soluzione salina eparinizzata calda (37 ° C). Quindi, i fegati espiantati sono stati trasferiti nella camera di perfusione e sottoposti a perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I campioni di perfusato in ingresso e in uscita sono stati raccolti a intervalli di 3 ore per l'analisi del perfusato. Al termine della perfusione, sono stati ottenuti campioni di fegato per l'analisi istologica, con integrità morfologica valutata utilizzando Suzuki-Score modificato attraverso la colorazione dell'ematossilina-eosina (HE). Gli esperimenti di ottimizzazione hanno prodotto i seguenti risultati: (1) i topi di peso superiore a 30 g sono stati ritenuti più adatti per l'esperimento a causa delle maggiori dimensioni del loro dotto biliare (BD). (2) una cannula in poliuretano da 2 Fr (diametro esterno = 0,66 mm) era più adatta per l'incannulamento della vena porta (PV) rispetto a una cannula in polipropilene. Ciò è stato attribuito alla maggiore presa del materiale poliuretanico, con conseguente riduzione dello slittamento del catetere durante il trasferimento dal corpo alla camera dell'organo. (3) per l'incannulamento del dotto biliare (BD), una cannula in poliuretano da 1 Fr (diametro esterno = 0,33 mm) è risultata più efficace rispetto alla cannula in polipropilene UT - 03 (diametro esterno = 0,30 mm). Con questo protocollo ottimizzato, i fegati di topo sono stati conservati con successo per una durata di 12 ore senza un impatto significativo sulla struttura istologica. La colorazione dell'ematossilina-eosina (HE) ha rivelato un'architettura morfologica ben conservata del fegato, caratterizzata da epatociti prevalentemente vitali con nuclei chiaramente visibili e lieve dilatazione delle sinusoidi epatiche.
Introduction
Il trapianto di fegato rappresenta il trattamento gold standard per gli individui con malattia epatica allo stadio terminale. Purtroppo, la domanda di organi da donatore supera l'offerta disponibile, portando a una carenza significativa. Nel 2021, circa 24.936 pazienti erano in lista d'attesa per un trapianto di fegato, mentre solo 9.234 trapianti sono stati eseguiti con successo1. La significativa disparità tra l'offerta e la domanda di innesti di fegato evidenzia la pressante necessità di studiare strategie alternative per ampliare il pool di donatori e migliorare l'accessibilità degli innesti di fegato. Un modo per espandere il pool di donatori consiste nell'utilizzare donatori marginali2. I donatori marginali includono quelli con età avanzata, steatosi moderata o grave. Sebbene il trapianto di organi marginali possa produrre risultati favorevoli, i risultati complessivi rimangono non ottimali. Di conseguenza, è attualmente in corso lo sviluppo di strategie terapeutiche volte a migliorare la funzione dei donatori marginali 3,4.
Una delle strategie è quella di utilizzare la perfusione della macchina, in particolare la perfusione della macchina ossigenata normotermica, per migliorare la funzione di questi organi marginali5. Tuttavia, esiste ancora una comprensione limitata dei meccanismi molecolari che sono alla base degli effetti benefici della perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I topi, con la loro abbondante disponibilità di ceppi geneticamente modificati, servono come modelli preziosi per studiare i percorsi molecolari. Ad esempio, l'importanza delle vie autofagiche nel mitigare il danno da ischemia-riperfusione epatica è stata sempre più riconosciuta 6,7. Un'importante via molecolare nel danno da ischemia-riperfusione epatica è la via 8 di miR-20b-5p/ATG7. Attualmente, sono disponibili un certo numero di ceppi di topi knockout ATG e knock-out condizionali, ma nessun ceppo di ratto corrispondente9.
Sulla base di questo background, l'obiettivo era quello di generare una piattaforma NEVLP miniaturizzata per innesti di fegato di topo. Questa piattaforma faciliterebbe l'esplorazione e la valutazione di potenziali strategie geneticamente modificate volte a migliorare la funzionalità del fegato del donatore. Inoltre, era essenziale che il sistema fosse adatto alla perfusione a lungo termine, consentendo il trattamento ex vivo del fegato, comunemente indicato come "riparazione d'organo".
Considerando la limitata disponibilità di dati in vitro rilevanti sulla perfusione epatica di topo, la revisione della letteratura si è concentrata su studi condotti sui ratti. Una ricerca sistematica della letteratura che va dal 2010 al 2022 è stata eseguita utilizzando parole chiave come "perfusione epatica normotermica", "ex vivo o in vitro" e "ratti". Questa ricerca mirava a identificare le condizioni ottimali nei roditori, permettendoci di determinare l'approccio più appropriato.
Il sistema di perfusione è costituito da un serbatoio tampone di vetro sigillato con camicia d'acqua, una pompa a rulli peristaltica, un ossigenatore, una trappola a bolle, uno scambiatore di calore, una camera d'organo e un sistema di tubi ciclici chiusi (Figura 1). Il sistema garantisce il mantenimento preciso di una temperatura di perfusione costante di 37 °C utilizzando una macchina termostatica dedicata. La pompa a rulli peristaltici guida il flusso del perfusato in tutto il circuito. Il circuito di perfusione inizia nel serbatoio isolato con camicia d'acqua. Successivamente, il perfusato viene diretto attraverso l'ossigenatore, che riceve una miscela di gas del 95% di ossigeno e del 5% di anidride carbonica da una bombola di gas dedicata. Dopo l'ossigenazione, il perfusato passa attraverso la trappola a bolle, in cui eventuali bolle intrappolate vengono reindirizzate al serbatoio dalla pompa peristaltica. Il perfusato rimanente scorre attraverso lo scambiatore di calore ed entra nella camera dell'organo, da dove ritorna al serbatoio.
Qui, riportiamo le nostre esperienze nella creazione di un NEVLP per fegati di topo e condividiamo i risultati promettenti di un esperimento pilota eseguito utilizzando il mezzo ossigenato senza vettori di ossigeno.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le attuali normative e linee guida tedesche per il benessere degli animali e le linee guida ARRIVE per la segnalazione della ricerca sugli animali. Il protocollo di sperimentazione animale è stato approvato dal Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turingia, Germania (numero di approvazione: UKJ - 17 - 106).
NOTA: I topi maschi C57BL/6J del peso di 34 ± 4 g (errore medio ± standard della media [SEM]) sono stati utilizzati come donatori di fegato. Sono stati mantenuti in condizioni ambientali controllate (50% di umidità e 18 - 23 ° C) con libero accesso a chow di topo standard e acqua. Durante la procedura chirurgica, è stata mantenuta una frequenza respiratoria superiore a 60 respiri / min e la temperatura corporea è stata mantenuta al di sopra di 34 ° C.
1. Preparazione
- Impostazione della tabella delle operazioni
- Autoclave tutti gli strumenti chirurgici e materiali di consumo per scopi di sterilizzazione.
- Accendere tutte le apparecchiature, compresa la scheda riscaldante e l'elettrocoagulazione.
- Introdurre una siringa da 50 mL con 25 mL di soluzione salina eparinizzata (2.500 U/L) in un incubatore caldo (37 °C).
- Posizionare gli strumenti chirurgici, la sutura di seta 6 - 0, il piccolo applicatore di cotone sterile, la soluzione salina veterinaria (500 ml) e le spugne di garza non tessuta (10 cm x 10 cm) sul tavolo operatorio in modo appropriato.
- Posizionare un ago da 26 G sul tavolo operatorio per creare un piccolo foro nel coperchio della provetta da microcentrifuga da 0,5 mL per ricevere il tubo biliare per la raccolta della bile.
- Posizionare la cannula (cannula in poliuretano 1 Fr o cannula in polietilene UT - 03) e una provetta sterilizzata da microcentrifuga da 0,5 ml per la raccolta della bile sul tavolo operatorio.
- Cannula venosa porta autoprodotta
- Tenere la cannula 2 Fr con una pinza e perforare la parete con un ago da 30 G a una distanza di 1 cm dall'estremità della cannula. Spingere l'ago attraverso la cannula fino a quando la punta dell'ago diventa visibile.
- Tagliare la punta della cannula ottenendo un triangolo acuto.
- Preparazione di soluzione salina eparinizzata
- Preparare 25 ml di soluzione salina eparinizzata con una concentrazione finale di 2.500 UI/ml.
- Rimuovere tutte le bolle d'aria e posizionare la siringa nell'incubatore a 40 °C.
- Dimostrazione del sistema di perfusione
- Vedere la Figura 1 per i componenti principali del sistema di perfusione della macchina.
- Allestimento della camera d'organo
- Vedere la Figura 2 per la disposizione della camera dell'organo.
- Messa a punto del sistema di perfusione
- Attivare il programma grafico di laboratorio per il monitoraggio della pressione.
- Collegare il calibratore di pressione e il sensore di pressione a livello della camera dell'organo.
- Regolare il calibratore di pressione per leggere 0 mmHg e controllare il valore corrispondente sul software di controllo della pressione.
- Regolare il calibratore di pressione per leggere 20 mmHg e controllare nuovamente il valore corrispondente sul software di controllo della pressione.
- Accendere il bagnomaria e preriscaldare la camera dell'organo a 40 °C.
- Lavare l'intero sistema idraulico due volte con acqua deionizzata distillata per 30 minuti ciascuno, garantendo la completa rimozione della soluzione igienizzante.
- Avviare la circolazione della soluzione di disinfezione in tutto il sistema per una durata di 20 minuti per garantire una disinfezione completa.
- Accendere la miscela di gas (95% di ossigeno (O 2) e 5% di anidride carbonica (CO2).
- Riempimento in perfusato
- Integrare 250 mL di terreno E di Williams con 50 mL di siero bovino fetale, 3 mL di penicillina/streptomicina (1 mg/ml), 0,17 mL di insulina (100 IE/mL), 0,34 mL di eparina (5000 U/mL) e 0,07 mL di idrocortisone (100 mg/2 mL) per preparare il mezzo Williams' E completo.
- Aggiungere volumi uguali (150 ml) di perfulato al serbatoio e alla camera dell'organo per innescare il sistema.
NOTA: È necessario prestare particolare attenzione al mantenimento della sterilità durante il processo di riempimento. Il perfufato viene costantemente pompato attraverso questi due componenti chiave della perfusione della macchina a ricircolo chiuso. - Accendere la pompa peristaltica a velocità media (15 ml/min) per innescare il sistema di perfusione con il mezzo ossigenato.
2. Espianto di fegato
- Preparazione pre-operatoria
- Pesare l'animale. Preparare l'analgesico buprenorfina (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg di peso corporeo).
- Collegare la camera di induzione con la presa a muro. Portare l'ossigeno a 0,5 L/min. Portare l'isoflurano al 3%.
- Posizionare l'animale nella camera fino a raggiungere l'anestesia profonda (riflesso di raddrizzamento positivo).
- Utilizzare una micro siringa per applicare la dose di analgesia adattata al peso corporeo per via sottocutanea.
- Utilizzare un rasoio elettrico per tagliare la pelliccia sulla pelle addominale.
- Trasferire il mouse sul tavolo operatorio e accendere il vaporizzatore isoflurano al 2,5% per mantenere l'anestesia. Confermare la profondità dell'anestesia testando il riflesso interdigitale della punta.
- Preparazione dell'addome del topo
- Posizionare il mouse in posizione supina.
- Testare il riflesso interdigitale per confermare due volte la profondità appropriata dell'anestesia. Fissare tutti e quattro gli arti con del nastro adesivo.
- Disinfettare entrambi i lati dell'addome fino alla linea ascellare centrale usando tre cicli consecutivi di iodio-alcool. Utilizzare garze sterilizzate non tessute per coprire l'area intorno al campo chirurgico.
- Effettuare un'incisione trasversale di 3 cm 1 cm sotto lo xifoide nella zona addominale del topo usando le forbici per bambini Metzenbaum e una pinza chirurgica.
- Estendere l'incisione cutanea bilateralmente alla linea medioascellare su entrambi i lati.
- Fare con attenzione un'incisione longitudinale di 2 cm lungo la linea alba usando le forbici a molla.
- Tagliare lo strato muscolare addominale con elettrocoagulazione e forbici a molla Vannas.
- Posizionare con cura un pezzo di garza bagnata per proteggere il fegato dall'elettrocoagulazione.
- Utilizzare una sutura di seta 6 - 0 con l'ago rotondo per ritrarre il processo xifoideo per una migliore esposizione del legamento coronarico.
- Utilizzare due divaricatori costali per esporre completamente la cavità addominale del topo.
- Spostare con attenzione l'intestino tenue fuori dalla cavità addominale con un batuffolo di cotone bagnato per esporre completamente l'ilo.
- Preparazione del dotto biliare comune
- Transetto i legamenti falciformi, frenici e gastroepatici con forbici affilate.
- Liberare con cura il dotto biliare comune usando una pinza curva fine senza denti.
NOTA: Il dotto biliare comune è molto facilmente danneggiato e si rompe. Una volta che si rompe, non può essere incannulato. A causa della direzione della posizione anatomica, è meglio usare una pinza curva. - Posizionare due anelli di sutura di seta 6 - 0 sul dotto biliare comune in preparazione per il passaggio successivo.
- Incannulamento del dotto biliare comune
- Forare accuratamente il dotto biliare con un ago da 30 G. Utilizzare una pinza curva appuntita per allargare il piccolo foro per adattarsi all'incannulamento del dotto biliare.
- Utilizzare una pinza per l'incannulamento dei vasi per afferrare la cannula del dotto biliare e spingerla nel dotto biliare.
- Fissare due volte la cannula con i passanti di sutura 6 - 0 preimpostati.
NOTA: Durante l'incannulamento, si avverte resistenza alla bile. Se la forza non è ben controllata, la cannula verrà spinta fuori dalle vie biliari dalla pressione del deflusso biliare. Regolare con attenzione la profondità della cannula. Se è troppo profondo, può danneggiare il dotto biliare e, se non è abbastanza profondo, potrebbe scivolare fuori. - Osservare il flusso biliare nella cannula dopo l'incannulamento riuscito.
- Preparazione della vena porta
- Bloccare la vena porta con una pinza piatta e liberare con cura il tessuto connettivo con una pinza curva. Non tirare forte per evitare di causare lacerazione della vena porta. Una volta che la vena porta è danneggiata, è difficile ri-cannulare la vena porta.
- Sezionare il PV appena superiore alla biforcazione e posizionare il primo anello di sutura usando la sutura di seta 6 - 0 sul PV vicino alla confluenza per un uso successivo.
- Posizionare il secondo anello di sutura per la successiva fissazione del PV il più vicino possibile all'ilo epatico.
- Incannulamento della vena porta
- Utilizzare una clip arteriosa per chiudere la vena porta distale.
- Con molta attenzione, forare la vena porta con una delle cannule della vena porta sopra. Il flusso sanguigno può essere chiaramente osservato all'interno della cannula dopo una puntura di successo.
- Fissare la cannula PV con l'anello di sutura 6 - 0 pre-posizionato.
- Vampate di calore del fegato
- Aumentare l'isoflurano al 5% e eutanasia il topo con un sovradosaggio di inalazione di isoflurano.
- Prendere la soluzione salina di eparina preriscaldata dall'incubatore. Rimuovere tutte le bolle d'aria formate all'interno della soluzione salina eparinizzata.
- Fissare la siringa con soluzione salina eparinizzata preriscaldata nella pompa della siringa.
- Collegare il tubo di prolunga della pompa della siringa alla cannula della vena porta, regolare la velocità a 2 ml / min e avviare il lavaggio del fegato.
- Osservare il colore del fegato alla fine della procedura di lavaggio. Eliminare il fegato una volta che il colore diventa giallo omogeneo.
- Transetto il diaframma, la vena cava inferiore sopraepatica, la vena cava infraepatica, l'arteria epatica, la vena porta distale e qualsiasi tessuto connettivo rimanente.
- Mettere il fegato nella capsula di Petri.
3. Connessione fegato e camera
- Trasferimento del fegato
- Trasferire con cautela il fegato nella camera dell'organo usando una capsula di Petri.
- Mantenere una piccola quantità di soluzione salina nella capsula di Petri per evitare che il fegato si secchi.
NOTA: La vena porta e il dotto biliare possono essere facilmente attorcigliati durante questa procedura, il che può influenzare la perfusione epatica e la raccolta della bile.
- Connessione cannula venosa porta
- Infondere lentamente la soluzione salina normale nella cannula della vena porta con una siringa per evacuare le bolle d'aria nella cannula.
- Collegare la cannula della vena porta nel tubo di deflusso del perfulato nella camera dell'organo.
- Connessione cannula del dotto biliare
- Guidare la cannula del dotto biliare del topo attraverso la valvola di un cappuccio di gomma collegato alla camera dell'organo.
- Inserire la cannula del dotto biliare in un microtubo da 0,5 ml pre-preparato con un piccolo foro nel coperchio.
- Posizionare il microtubo sull'argilla all'esterno della camera dell'organo.
4. Regolare la portata in base alla pressione fotovoltaica
- Accendere la pompa peristaltica da 1 ml/min.
- Controllare la lettura della pressione della vena porta per regolare la portata.
- Mantenere la pressione della vena porta nell'intervallo fisiologico tra 7 - 10 mmHg regolando la portata.
NOTA: La portata nominale può variare leggermente a seconda dell'utilizzo e del posizionamento dei tubi.
5. Raccolta dei campioni
- Ottenere campioni di perfusato in ingresso dal tubo di afflusso della vena porta e campioni di perfusato di uscita dalla camera dell'organo in intervalli di 3 ore.
- Raccogliere campioni da tutti i lobi del fegato per l'analisi istologica alla fine del periodo di perfusione di 12 ore.
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Representative Results
Istituzione della procedura chirurgica
Un totale di 17 animali sono stati utilizzati per questo esperimento: 14 topi sono stati impiegati per ottimizzare il processo di approvvigionamento degli organi, compreso l'incannulamento della vena porta (PV) e del dotto biliare (BD), mentre 3 topi sono stati utilizzati per convalidare la procedura (Tabella 1). I risultati istologici (Figura 3) sono stati confrontati per facilitare l'identificazione della condizione di perfusione ottimale.
Selezione di perfulato
Per questo studio è stato selezionato un terreno di coltura di epatociti precedentemente utilizzato10,11. Il mezzo E di William è stato inizialmente progettato da Williams e Gunn come mezzo ridotto dal siero per la coltivazione prolungata in vitro di cellule epiteliali epatiche mature di ratto12. Tuttavia, ha anche trovato utilità nel sostenere la crescita e il mantenimento degli epatociti dei roditori13. Il siero bovino fetale (FBS) è un integratore di coltura cellulare ampiamente impiegato grazie alla sua ricca composizione di nutrienti essenziali e fattori di crescita che facilitano la crescita, la proliferazione e la vitalità delle cellule14. Il mezzo E completo di William è stato utilizzato come perfusato (Tabella 2), che è integrato con il 20% di siero fetale bovino, l'1% di penicillina / streptomicina, 5.000 U / L di eparina, 50 U / L di insulina e 0,010 g / L di idrocortisone.
Selezione di cannule
La procedura di incannulamento prevedeva prima l'incannulamento del dotto biliare (BD) per la raccolta del liquido biliare, seguito dall'incannulamento della vena porta (PV). Per l'incannulamento BD, è stato inizialmente utilizzato un tubo in polipropilene UT-03 con un diametro esterno di 0,3 mm e un diametro interno di 0,18 mm. Tuttavia, a causa delle preoccupazioni relative al potenziale danno BD e al rischio più elevato di spostamento involontario del catetere associato alla punta UT-03 tagliata e rigida, è stata data una preferenza ai tubi in poliuretano 1 Fr. I tubi in poliuretano, con il loro materiale più morbido e la ridotta scivolosità, sono stati considerati più adatti per l'incannulamento BD.
Inizialmente, una cannula ad ago endovenoso in polipropilene da 26 G è stata utilizzata per incannulare la vena porta (PV). Tuttavia, la rimozione dell'ago e il successivo attacco della cannula al tubo di perfusione hanno provocato la formazione di bolle, che avevano il potenziale di ostruire le sinusoidi intraepatiche. Per ovviare a questo problema, è stata costruita una cannula a permanenza utilizzando un ago da 30 G inserito nel distale 1 cm di una cannula poliuretanica 2 Fr. Questa "cannula ad agoguida" autocostruita è stata quindi inserita nel PV distale sopra la confluenza. Poiché il catetere è stato posizionato all'interno del PV, l'ago è stato lentamente ritirato mentre contemporaneamente avanzava il tubo. L'estremità della cannula autocostruita era collegata al tubo di perfusione all'interno della camera. L'utilizzo di un materiale morbido in questa tecnica di incannulamento ha fornito un vantaggio riducendo il rischio di lesioni alla parete posteriore della nave.
Studi di convalida
I campioni di perfusato in ingresso e in uscita sono stati sottoposti alla determinazione dei livelli di pH e potassio. I risultati ottenuti (Figura 4) sono stati poi confrontati con i risultati riportati nelle recenti pubblicazioni15,16,17. Tre fegati di topo sono stati perfusi con ossigenati e integrati con il mezzo E di William per 12 ore. Durante questo periodo, è stata registrata continuamente una pressione di perfusione stabile di 7 - 10 mmHg. Il pH medio era relativamente stabile durante la perfusione di 12 ore e variava tra 7,3 e 7,7. Anche i livelli medi di potassio erano stabili durante tutto il periodo di perfusione e variavano tra 5,9 e 6,8 mmol / L (Figura 4). La portata fotovoltaica è stata mantenuta entro un intervallo di 0,8 - 1,2 ml / min / g a seconda dell'utilizzo e del posizionamento dei tubi della pompa durante le procedure sperimentali. Tutti i risultati osservati nella perfusione epatica di topo hanno dimostrato somiglianze con le osservazioni precedentemente riportate nella perfusione epatica di ratto (Tabella 3).
I campioni di tessuto sono stati raccolti da tre fegati (N = 3) e sono stati sottoposti a perfusione di 12 ore utilizzando il protocollo ottimizzato per la colorazione HE, seguita dalla scansione dell'intero vetrino. Ogni lobo del fegato è stato valutato utilizzando un punteggio Suzuki modificato (Tabella 4). Il classico punteggio Suzuki18 è stato aumentato incorporando tre parametri aggiuntivi: picnosi dei nuclei, distacco dei vasi e presenza di eritrociti nelle sinusoidi e nei grandi vasi. Ogni parametro è stato classificato come assente (0), lieve (1), moderato (2) e grave (3). Un punteggio finale di 0 - 7 è stato considerato per riflettere una buona conservazione, 8 - 14 è stato preso come conservazione moderata e 14 - 21 ha indicato una cattiva conservazione.
La conservazione dei fegati di topo è stata valutata in base al punteggio Suzuki modificato. Due esperti medici hanno condotto una valutazione indipendente della morfologia dei sette lobi dei tre fegati (Figura 5, Figura 6, Figura 7). È stata calcolata la media dei sette punteggi del lobo per ciascun lobo del fegato; Punteggi più bassi indicano un fegato meglio conservato. Le valutazioni rese dagli esperti hanno mostrato un alto grado di concordanza. In particolare, mentre lievi discrepanze nei punteggi assegnati dai due esperti sono state osservate nella valutazione della picnosi dei nuclei, queste variazioni non hanno avuto un impatto significativo sui risultati complessivi del punteggio.
Nella migliore delle ipotesi, il parenchima epatico era relativamente intatto con una tipica struttura lobulare ben conservata, difficilmente distinguibile da un fegato normale. Gli epatociti apparivano vitali con membrane cellulari chiaramente visibili e nuclei rotondi. Tuttavia, alcuni nuclei hanno subito la picnosi e alcune sinusoidi epatiche sono state leggermente dilatate, risultando in un punteggio di 4. (Figura 3, Figura 6)
Nel peggiore dei casi, la struttura lobulare era distorta, con vasi staccati dal parenchima e necrosi parenchimale confluente. A livello cellulare, la vacuolizzazione cellulare e la picnosi dei nuclei sono diventate evidenti, specialmente nella regione pericentrale. Inoltre, è stata osservata una vacuolizzazione da lieve a moderata. Fino al 30% degli epatociti era sottoposto a necrosi, con un punteggio massimo di 14. (Figura 3, Figura 7)
Tabella 1: Definizione graduale di un modello di perfusione epatica di topo. Durante il processo di costituzione sono state osservate varie complicazioni dovute alle differenze nelle dimensioni, nel materiale e nel posizionamento della cannula. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Confronto dei metodi di conservazione organistica in vitro 15,17,19,20,21,22. L'ottimizzazione della selezione del perfusato, della selezione del vettore di ossigeno e del confronto dei componenti nutrizionali è fondamentale in varie condizioni di conservazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Emodinamica e analisi dei gas ematici in ratti normali e ratto NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Le informazioni fornite descrivono selettivamente le caratteristiche emodinamiche del fegato di ratto e i parametri chiave della perfusione normotermica in vitro. In particolare, la perfusione epatica di ratto può essere considerata ottimale quando la pressione fotovoltaica varia tipicamente da 4 a 10 mmHg e la pressione parziale dell'ossigeno nel perfusato che entra nel PV varia da 80 a 550 mmHg, soddisfacendo i criteri necessari per il successo della perfusione epatica di ratto in vitro. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Punteggio Suzuki modificato. Il punteggio Suzuki modificato utilizzato in questo studio espande il classico punteggio Suzuki incorporando tre parametri aggiuntivi: picnosi dei nuclei, distacco dei vasi e presenza di eritrociti nelle sinusoidi e nei grandi vasi. A ciascun parametro è stato assegnato un voto su una scala di 0 (assente), 1 (lieve), 2 (moderato) o 3 (grave). Il punteggio totale, che va da 0 a 8, indica una buona conservazione; Da 9 a 16 suggerisce una conservazione moderata e da 17 a 24 indica una scarsa conservazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 5: Selezione del mezzo di perfuffato, del volume del perfusato e della pressione di perfusione sulla base di un workup della letteratura di NEVLP nei ratti (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. La perfusione della macchina normothermica nel fegato di ratto può mostrare variabilità tra gli studi in termini di tipo specifico e volume di perfusato utilizzato, nonché della durata della perfusione. Diversi studi possono impiegare approcci diversi, come la dialisi o la perfusione ad alto volume, per periodi prolungati. Tuttavia, nonostante queste differenze, parametri come la pressione portale, la portata della vena porta e la pressione parziale dell'ossigeno nel perfusato generalmente dimostrano una variazione minima tra i vari metodi impiegati. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Figura 1: Schema del sistema di perfusione. I componenti chiave sono la camera dell'organo, la macchina termostatica, la pompa a rulli, l'ossigenatore e il serbatoio. Il perfulato viene pompato dal serbatoio da una pompa peristaltica in un ossigenatore. C'è un flusso di gas ininterrotto del 95% di O2 e del 5% di CO2 nell'ossigenatore. Il perfusato passa attraverso la trappola a bolle, dove eventuali bolle d'aria presenti nel perfufato vengono catturate e pompate di nuovo nel serbatoio. Il perfusato rimanente scorre verso la camera dell'organo, dove il tubo è collegato alla vena porta. Il deflusso del perfulato dalla camera dell'organo viene diretto verso il serbatoio dalla pompa peristaltica. Un tubo di drenaggio della bile è collegato alla camera dell'organo per raccogliere la bile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Primo piano della camera di perfusione. La camera di perfusione dell'organo comprende un ingresso e un'uscita di perfuffato, una trappola a bolle, uno scambiatore di calore e una porta di raccolta della bile. Il monitoraggio in tempo reale della pressione della pompa del perfufulato viene effettuato utilizzando un sensore di pressione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Risultati istologici di fegati di topo normali e perfusi. (A) Morfologia normale del fegato di topo (controllo). (B) Esempio di morfologia meglio conservata come visualizzata mediante colorazione HE-dopo 12 ore di perfusione. (C). Esempio di morfologia peggio conservata come visualizzata mediante colorazione HE-dopo 12 ore di perfusione. La freccia nera indica la vacuolizzazione, la freccia rossa indica la dilatazione sinusoidale, la freccia gialla mostra la bicnosi dei nuclei e la freccia verde specifica il distacco vascolare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi del perfusato. Livelli di Ph (A) e potassio (B). Entrambi i parametri sono stabili per tutto il tempo di osservazione di 12 ore, indicando condizioni di perfusione costanti Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Danni epatici minori con conseguente punteggio Suzuki modificato 4-7. Dopo 12 ore di NEVLP, è stata condotta una valutazione semiquantitativa della morfologia epatica. I campioni di ciascun lobo epatico sono stati valutati e classificati separatamente, risultando in un intervallo e un punteggio medio per ciascun fegato, con il punteggio più alto possibile di 4. Morfologia epatica ben conservata con un punteggio che varia da 4-7 a seconda del lobo epatico (media = 5) (Punteggio 0-7: morfologia epatica ben conservata, punteggio 8-14 morfologia moderatamente conservata, punteggio 15-21: morfologia epatica mal conservata) Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Danno epatico moderato con conseguente punteggio Suzuki modificato 7-14. Valutazione semiquantitativa della morfologia epatica dopo 12 ore di perfusione normotermica ossigenata della macchina secondo il punteggio Suzuki modificato. Morfologia moderatamente conservata con un punteggio compreso tra 7 e 14 (media = 11). (Punteggio 0-7: morfologia epatica ben conservata, punteggio 8-14 morfologia moderatamente conservata, punteggio 15-21: morfologia epatica mal conservata) Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Lieve - danno epatico moderato con conseguente modifica del punteggio Suzuki 5-11. La perfusione disomogenea ha determinato una morfologia preservata da lieve a moderata in diversi lobi del fegato, con punteggi compresi tra 5 e 11 (media = 8). (Punteggio 0-7: morfologia epatica ben conservata, punteggio 8-14 morfologia moderatamente conservata, punteggio 15-21: morfologia epatica mal conservata) Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Passaggi critici nel protocollo
I due passaggi cruciali nell'espianto di fegato sono l'incannulamento della vena porta (PV) e il successivo incannulamento del dotto biliare (BD). Questi passaggi sono di fondamentale importanza per garantire il successo del prelievo degli organi e delle successive procedure di perfusione o trapianto.
Sfide e soluzioni
L'incannulamento fotovoltaico presenta tre sfide: lesione della parete del vaso, spostamento del catetere e praticabilità del processo di inserimento. La natura delicata della parete del vaso fotovoltaico lo rende suscettibile alla perforazione e al successivo sanguinamento se non maneggiato con cura durante l'incannulamento. Inoltre, qualsiasi perdita di sangue dal PV riduce la pressione del portale, rendendo più difficile l'inserimento della cannula fotovoltaica. Inoltre, una lesione alla parete venosa portale può introdurre emboli d'aria nel sistema vascolare intraepatico. Pertanto, esercitare precisione e cautela durante il processo di incannulamento fotovoltaico è fondamentale per ridurre al minimo il rischio di complicanze.
Durante l'incannulamento PV, il rischio di spostamento del catetere è una preoccupazione comune, in particolare quando si utilizzano cannule con materiali scivolosi. Rispetto al polipropilene, l'uso di cannule in poliuretano è più favorevole per l'incannulamento fotovoltaico. La natura morbida e flessibile del poliuretano riduce significativamente il rischio di spostamento o perdita del catetere, potenzialmente attribuito alle sue proprietà del materiale. Inoltre, l'uso di una cannula morbida riduce al minimo la probabilità di danneggiare lo strato endoteliale dei vasi sanguigni. Nello studio, tre tipi di cannule di accesso vascolare, vale a dire 24 G di polipropilene, 26 G di polipropilene e 2 Fr di poliuretano, sono stati confrontati per l'incannulamento fotovoltaico. Tra queste opzioni, entrambe le cannule in poliuretano 26 G e 2 Fr hanno dimostrato una migliore compatibilità con le dimensioni del PV del mouse. Mentre la cannula da 26 G ha mostrato una migliore compatibilità anatomica, la cannula in poliuretano 2 Fr con un diametro esterno di 0,66 mm è stata ritenuta adatta per l'applicazione prevista grazie alle sue proprietà uniche del materiale, riducendo efficacemente il rischio di spostamento involontario del catetere dal PV.
Per quanto riguarda la praticabilità dell'inserimento, sono state testate diverse tecniche. Un modo è quello di bloccare le estremità prossimale e distale del PV, tagliare un piccolo foro con forbici sottili e inserire la cannula PV. Questa tecnica richiede il coinvolgimento di una persona aggiuntiva a causa della complessità e della necessità di azioni simultanee. Di conseguenza, non è possibile per un singolo microchirurgo eseguire la procedura in modo indipendente. Pertanto, è necessario un catetere con un ago interno e una cannula esterna. Come descritto in precedenza, l'utilizzo della cannula in polipropilene da 26 G rigida e liscia disponibile in commercio comporta il rischio di scivolare fuori e rischiare la formazione di bolle d'aria quando si collega la cannula al sistema di lavaggio. Per affrontare queste preoccupazioni, è stato ideato un "sistema di tubi agugliati" autocostruito inserendo un ago da 26 G da un catetere ad ago in una lunga e flessibile cannula poliuretanica 2 Fr. Questo approccio offre tre vantaggi chiave: (1) un sistema di inserimento del catetere, (2) un tubo lungo e flessibile e (3) proprietà favorevoli del materiale. Tuttavia, durante questa fase, è fondamentale prestare attenzione per evitare che la punta dell'ago entri in contatto con la parete fotovoltaica durante l'avanzamento, poiché ciò potrebbe causare danni irreversibili alla parete del vaso.
L'incannulamento BD presentava le stesse tre sfide: lesione della parete del vaso, spostamento del catetere e praticabilità del processo di inserimento. In definitiva, la cannula in poliuretano 1 Fr è stata ritenuta più adatta della cannula in polipropilene UT - 03 grazie alle sue proprietà favorevoli del materiale. Nonostante il diametro esterno leggermente inferiore della cannula UT - 03 (0,30 mm) rispetto al tubo in poliuretano termosensibile da 1 Fr (0,33 mm), il materiale poliuretanico è rigido e meno incline alla flessione. D'altra parte, la cannula 1 Fr, essendo morbida e flessibile, offre un inserimento più facile e quindi è diventata la nostra scelta preferita. Tuttavia, nei casi in cui la dimensione BD è eccezionalmente piccola e non è in grado di ospitare la cannula più grande da 2 Fr, la cannula UT - 03 rimane una valida alternativa. In tali casi, deve essere prestata particolare attenzione per impedire lo spostamento della cannula dal BD.
Come riassunto nella revisione della letteratura (Tabella 5), la maggior parte degli sperimentatori 19,41,42,46 ha utilizzato una portata portale di 1 - 3 ml / min / g di fegato. Tuttavia, la portata deve essere regolata per mantenere la pressione portale fisiologica nell'intervallo 4 - 10 mmHg28. L'alta pressione fotovoltaica può causare dilatazione sinusoidale e distacco vascolare. Una bassa pressione fotovoltaica e una bassa portata fotovoltaica potrebbero provocare un'ipo-ossigenazione a basso flusso con successiva necrosi da medio-zonale a pericentrale. La manipolazione della portata FV ha la funzione di regolare la pressione fotovoltaica, che può variare a seconda della cannula utilizzata e delle dimensioni del fegato, rendendo quindi necessari piccoli aggiustamenti alla portata fotovoltaica. Quindi, in questo studio, la perfusione è stata avviata a una portata di 1 ml / min / g di fegato e, allo stesso tempo, la pressione fotovoltaica è stata monitorata utilizzando un trasduttore di pressione sanguigna per mantenere la pressione fisiologica del fotovoltaico regolando la portata.
Durante lo sviluppo del modello NEVLP, è stato fatto un tentativo di migliorare ulteriormente l'apporto di ossigeno al fegato perfuso aggiungendo globuli rossi lavati al perfuffato. Tuttavia, è stata osservata una significativa sedimentazione degli eritrociti nella grande camera e nel serbatoio, riducendo così la consegna di vettori di ossigeno all'organo durante la perfusione. Inoltre, il danno agli eritrociti è stato causato dall'azione meccanica della pompa di perfusione peristaltica, che guida il perfulato comprimendo un tubo di silicio. Entrambi i motivi hanno facilitato la nostra decisione di non usare i globuli rossi in questo esperimento. I vettori di ossigeno a base di perfluorocarburi possono essere in grado di risolvere questi problemi47.
Per valutare la vitalità dell'innesto di fegato durante la perfusione, il liquido biliare del topo è stato raccolto a intervalli di 3 ore. Tuttavia, è difficile raccogliere la bile attraverso il catetere a causa dell'elevata viscosità del fluido biliare del topo. Questo è inizialmente compensato dalle forze capillari indotte dal sottile catetere poliuretanico 1 Fr posto nel BD. Tuttavia, solo circa 20 μL di liquido biliare potrebbero essere raccolti entro la prima ora dell'esperimento. Invece di drenare attraverso la cannula, è stato osservato il riempimento retrogrado della cistifellea.
Alla fine del periodo di perfusione di 12 ore, la cistifellea era piena di liquido biliare chiaro che suggeriva la produzione di bile attiva durante la perfusione della macchina. Questo può essere potenzialmente contrastato posizionando un tubo più grande nella cistifellea.
Nel frattempo, il danno istologico della struttura cellulare e lobulare epatica è stato valutato per determinare il risultato della conservazione. È stato osservato che anche all'interno dello stesso fegato, la conservazione era disomogenea. La disomogeneità dei cambiamenti strutturali suggerisce che la perfusione era eterogenea in tutto il fegato (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Inoltre, i risultati istologici forniscono la prova che è possibile preservare l'integrità strutturale dell'innesto di fegato di topo per una durata minima di 12 ore durante la perfusione della macchina. Tuttavia, la presenza di istologia epatica intatta può solo aiutare nella valutazione, ma non può determinare definitivamente la funzione e la vitalità del fegato. Va notato che la necrosi, come manifestazione ultima del danno cellulare, potrebbe non essere facilmente osservabile fino a una fase successiva. Pertanto, basarsi esclusivamente sulla valutazione istologica potrebbe non fornire una comprensione completa dello stato funzionale e della vitalità del fegato. Altri saggi e valutazioni complementari sono necessari per accertare le condizioni generali del fegato, compresi i saggi funzionali, i marcatori biochimici e la valutazione dell'attività metabolica.
Una buona conservazione è stata raggiunta dopo 12 ore di perfusione. Tuttavia, estendere ulteriormente il tempo di perfusione come possibilmente necessario per la riparazione degli organi richiede di affrontare alcuni problemi. In primo luogo, va notato che il raggiungimento di durate di perfusione a lungo termine superiori a 12 ore richiederebbe il mantenimento di condizioni sterili piuttosto che solo condizioni pulite. Tuttavia, in questi esperimenti iniziali, l'attenzione si è concentrata sul mantenimento di condizioni pulite piuttosto che sterili, poiché garantire la sterilità introdurrebbe ulteriori complessità alla procedura. In secondo luogo, una perfusione più lunga richiederebbe probabilmente l'aggiunta di un'unità di dialisi, come descritto da Herman Tolboom22, per rimuovere l'accumulo di prodotti di scarto metabolici tossici. Hanno usato un sistema con un volume totale di 55 - 60 ml per perfondere un fegato di ratto di 10 g per 4 ore. In questo studio, è stato utilizzato un serbatoio relativamente grande con un volume totale di 300 ml nonostante le piccole dimensioni del fegato di topo, che pesa circa 1 g. Questa configurazione ha comportato un fattore di diluizione aggiuntivo di 50 volte. Sorprendentemente, non sono stati osservati effetti dannosi durante il periodo di perfusione di 12 ore con questa configurazione. In terzo luogo, una perfusione più lunga richiederebbe anche l'aggiunta di vettori di ossigeno, nel migliore dei casi sotto forma di emoglobina artificiale per garantire un adeguato apporto di ossigeno, come descritto da Dondossola et al.47 e Jägers et al.48.
Lo sviluppo del trapianto di fegato "non ischemico" basato su NEVLP ha indubbiamente portato nuove idee e metodi per risolvere o addirittura prevenire il problema del danno da ischemia-riperfusione. Tuttavia, NEVLP è un concetto molto promettente per migliorare la conservazione degli organi e la sua potenziale applicazione per estendere la conservazione degli organi alla riparazione degli organi47.
Attualmente, tre diverse tecniche di perfusione della macchina sono utilizzate sperimentalmente e clinicamente. La differenza fondamentale è la temperatura di lavoro: perfusione della macchina ipotermica, perfusione della macchina subnomadremica e perfusione della macchina normotermica (Tabella 2). Altre differenze includono la scelta della soluzione di conservazione, la soluzione di perfuso e l'aggiunta di vettori di ossigeno (Tabella 5).
NEVLP è principalmente di vantaggio perché (1) l'organo viene mantenuto alla sua temperatura normale, (2) è ossigenato e (3) è metabolicamente completamente fornito. Il sistema fornisce una piattaforma eccellente per la valutazione diagnostica, la terapia di intervento e, infine, la riparazione degli organi49. Tuttavia, NEVLP rappresenta una grande sfida per la tecnologia di supporto degli organi ex vivo. La sfida per NEVLP è quella di rispecchiare la condizione quasi fisiologica. Fino a poco tempo fa, a causa delle piccole dimensioni e della mancanza di criteri di valutazione standard, solo un numero limitato di studi NEVLP sui roditori è stato eseguito 25,26,27,28,29,30,31.
È stato dimostrato qui che il modello murino è un modello valido che consente un tempo di conservazione di 12 ore. In confronto, la maggior parte degli studi sui ratti ha riportato tempi di perfusione di 6 ore o meno28,33. Inoltre, l'uso di piccoli animali è vantaggioso per gli studi molecolari rispetto agli animali di grandi dimensioni a causa della disponibilità di reagenti abbondanti e dei minori costi sperimentali. Ad esempio, i topi sono attualmente un'opzione preferibile per testare modelli knockout della famiglia di geni ATG, in particolare per studiare le vie di segnalazione del danno da ischemia-riperfusione nel fegato 8,50.
Esperimenti su fegati di ratto riguardanti NEVLP hanno rivelato che la conservazione della perfusione della macchina normotermica è associata a un ridotto danno epatocellulare e a una migliore sopravvivenza post-trapianto precoce rispetto alla conservazione a freddo 31,40,51,52,53,54. NEVLP utilizzando fegati di ratto è adatto anche per studiare le aggiunte di farmaci o cellule al perfuffato. Un esempio impressionante è lo studio di Xuan Tian26, che ha utilizzato cellule staminali mesenchimali modificate dell'eme ossigenasi-1 combinate con la perfusione della macchina normotermica per migliorare la qualità degli innesti di fegato attraverso la via di segnalazione Wnt. Haojie Wang39 ha confermato nel suo recente studio che l'aggiunta di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo al perfusato può migliorare notevolmente la qualità di NEVLP nei ratti per perfusione a breve termine. Nel loro studio su fegati DCD, le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo combinate con NEVLP hanno inibito la congestione sinusoidale epatica e il danno endoteliale. L'aggiunta di cellule staminali mesenchimali ha impedito l'attivazione intraepatica dei macrofagi e l'adesione intercellulare. Inoltre, l'aggiunta di cellule staminali mesenchimali ha regolato l'equilibrio endotelico-1 / ossido nitrico endoteliale per migliorare la perfusione epatica e la microcircolazione.
I topi offrono un netto vantaggio rispetto ai ratti quando si tratta di NEVLP, in particolare nel contesto di studi molecolari incentrati su fegati transgenici o geneticamente modificati. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni dell'animale, la procedura rappresenta una sfida maggiore ma gestibile per il microchirurgo37.
Sistema di classificazione per la valutazione istologica
La valutazione istologica è decisiva per determinare l'impatto delle condizioni di perfusione sull'integrità morfologica dell'innesto.
Mentre il punteggio Suzuki è comunemente utilizzato negli studi che valutano la patologia epatica, è stato notato che questo sistema di punteggio potrebbe non catturare adeguatamente i risultati specifici osservati nella conservazione del fegato ex-vivo. Per affrontare questa limitazione, sono stati introdotti quattro criteri aggiuntivi per migliorare la valutazione completa del tessuto epatico conservato (Tabella 4). In primo luogo, è stata implementata l'inclusione della valutazione della picnosi nucleare, in quanto funge da prezioso parametro indicativo del danno cellulare. In secondo luogo, la valutazione del distacco di vasi ed epatociti, che significa danni al lobulo epatico, è stata incorporata come criterio aggiuntivo. Infine, la classificazione della presenza di eritrociti nelle sinusoidi è stata utilizzata come indicatore di arrossamento eterogeneo e perfusione. Incorporando questi criteri supplementari, è stata ottenuta una valutazione più sfumata e accurata delle condizioni del tessuto epatico conservato, fornendo una comprensione più profonda degli effetti della conservazione del fegato ex-vivo.
La vacuolizzazione degli epatociti55 si verifica dopo alterazioni nell'uso del substrato, dispendio energetico, disintegrazione dei microtubuli e inibizione della sintesi proteica. Il nucleo dell'epatocita è costretto a spostarsi verso la periferia della cellula da grandi vacuoli. Questo processo è spesso accompagnato da picnosi nucleare. In questo studio, 12 ore di perfusione normotermica hanno portato a diversi gradi di vacuolizzazione degli epatociti rispetto al controllo che suggerisce una perfusione disomogenea.
La presenza di sinusoidi dilatati tra i cordoni degli epatociti è stata notevole in questo studio. Questo fenomeno deriva principalmente dall'ostruzione del deflusso venoso epatico, che porta alla stasi vascolare e alla congestione all'interno del parenchima epatico. In questo modello di fegato murino, le sfide associate al mantenimento di una pressione di perfusione portale costante a causa delle piccole dimensioni dell'organo possono contribuire alla dilatazione osservata delle sinusoidi epatiche.
I cambiamenti necrotici si manifestano tipicamente in cluster cellulari, aree regionali o zone specifiche. L'area periportale ben perfusa mostrava una conservazione relativamente migliore degli epatociti rispetto all'area pericentrale. La perfusione epatica a doppio vaso, come dimostrato nei fegati di ratto20, presenta una sfida maggiore nei fegati di topo a causa delle piccole dimensioni dell'arteria epatica. Di conseguenza, la perfusione disomogenea osservata del fegato di topo può essere attribuita, almeno in parte, a questa limitazione.
Queste osservazioni non sono esclusive dei fegati di topo sottoposti a NEVLP, ma possono anche essere visualizzate in immagini istologiche di altri studi NEVLP, sebbene non possano essere descritte esplicitamente.
Importanza e potenziali applicazioni del topo NEVLP
La NEVLP dei fegati di topo è una procedura impegnativa ma fattibile. Sono necessari ulteriori sforzi per utilizzare al meglio questa tecnologia per chiarire il meccanismo alla base dell'effetto benefico di NEVLP. Migliorare le nostre conoscenze faciliterà la progressiva evoluzione di questa tecnologia, spostandola oltre la conservazione degli organi verso il regno della "riparazione degli organi".
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse finanziari da divulgare.
Acknowledgments
Durante la stesura di questo documento, ho ricevuto un grande sostegno e assistenza. Vorrei ringraziare in particolare il mio compagno di squadra XinPei Chen per la sua meravigliosa collaborazione e il supporto paziente durante la mia operazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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