Summary
Этот протокол представляет собой транспупиллярный транссклеральный подход под контролем зрения для безопасной и точной доставки субретинальных клеточных трансплантатов с низкой частотой хирургических осложнений у мышей-реципиентов с дегенерацией сетчатки или без нее.
Abstract
Трансплантация фоторецепторных клеток и клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) обеспечивает потенциальную терапию заболеваний дегенерации сетчатки. Субретинальная трансплантация терапевтических донорских клеток мышам-реципиентам является сложной задачей из-за ограниченного хирургического пространства, допускаемого небольшим объемом мышиного глаза. Мы разработали платформу транссклеральной хирургической трансплантации с прямым транспупиллярным зрением для облегчения субретинальной доставки экзогенных клеток мышам-реципиентам. Платформа была протестирована с использованием суспензий клеток сетчатки и трехмерных листов сетчатки, собранных у богатых палочками мышей Rho::EGFP и богатых колбочками OPN1LW-EGFP; NRL-/- мышей соответственно. Анализ живых/мертвых клеток показал низкую смертность клеток для обеих форм донорских клеток. Трансплантаты сетчатки были успешно доставлены в субретинальное пространство мышиной модели дегенерации сетчатки, Rd1/NS, с минимальными хирургическими осложнениями, выявленными с помощью мультимодальной конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскической визуализации (cSLO). Через два месяца после трансплантации гистологическое окрашивание продемонстрировало признаки прогрессирующего созревания трансплантатов сетчатки во «взрослые» палочки и колбочки (по устойчивой экспрессии Rho::EGFP, S-opsin и OPN1LW:EGFP соответственно) в субретинальном пространстве. Здесь мы предоставляем хирургическую платформу, которая может обеспечить высокоточную субретинальную доставку с низким уровнем осложнений у мышей-реципиентов. Этот метод обеспечивает точность и относительную простоту приобретения навыков. Кроме того, этот метод может быть использован не только для исследований субретинальной трансплантации клеток, но и для других внутриглазных терапевтических исследований, включая генную терапию.
Introduction
Трансплантация фоторецепторов и клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) обеспечивает потенциальную терапию дегенеративных заболеваний сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД), болезнь Штаргардта и пигментный ретинит (РП)1,2,3,4,5,6,7 . Для восполнения или замены пораженных фоторецепторов и клеток RPE в дегенеративной сетчатке субретинальное пространство особенно хорошо подходит в качестве мишени для трансплантации, учитывая ламинарную анатомию фоторецепторов хозяина и клеток RPE. В то время как хирургические процедуры субретинальной трансплантации клеток RPE хорошо зарекомендовали себя на крупных животных 8,9,10 и клинических испытаниях11,12,13, проблемы, стоящие перед исследованиями в области трансплантации фоторецепторов, включают, среди прочего, нехватку трансгенных моделей крупных животных и ограниченное понимание глубинных механизмов синаптогенеза, участвующих в трансплантации нейронов. Генетически модифицированные мышиные модели с различными типами мутантов дегенерации сетчатки предоставляют полезные инструменты для изучения молекулярных механизмов в контексте трансплантации и управления разработкой эффективных методов клеточной заместительной терапии на доклинической стадии 14,15,16,17,18.
В отличие от относительно большого глаза и маленького хрусталика у крупных животных (например, свиньи, обезьяны), небольшой размер и большой хрусталик мышиного глаза делают их сложными хирургическими мишенями, особенно для субретинальной трансплантации, в которой ограничения физического пространства и ограниченная прямая визуализация являются основными проблемами.
Современные подходы можно разделить на три основных типа в зависимости от пути впрыска. Во-первых, в случае трансроговичного доступа, игла вводится через роговицу в полость стекловидного тела, а затем в субретинальное пространство19,20. С помощью этого метода можно добиться успешной субретинальной доставки, но повреждение структур переднего сегмента (т.е. роговицы, радужной оболочки, хрусталика) является основным риском, который может серьезно затруднить последующий анализ in vivo. Во-вторых, в случае трансстекловидного доступа игла входит в полость стекловидного тела через pars plana, а затем в субретинальное пространство21. Такой подход широко используется у человека и крупных животных. Однако существует потенциальный риск повреждения хрусталика у грызунов, так как хрусталик занимает больший относительный объем полости стекловидного тела. Примечательно, что как транскорнеальный, так и трансстекловидный протоколы требуют проникновения через нервную сетчатку для достижения субретинального пространства, что вызывает повреждение сетчатки хозяина и увеличивает риск рефлюкса донорских клеток через отверстие для проникновения. В-третьих, в случае транссклерального доступа22,23 игла проникает через склерально-сосудисто-сосудисто-RPE комплекс и непосредственно попадает в субретинальное пространство. Такой подход снижает потенциальную травматизацию структур переднего сегмента и полости стекловидного тела. Однако без прямой визуализации глазного дна хозяина часто обнаруживаются хирургические неудачи, вызванные трансретинальными пункциями, отслойкой РПЭ и кровоизлиянием в сосудистую оболочку.
Здесь мы разработали транссклеральную хирургическую платформу с прямым транспупиллярным зрением для субретинальной трансплантации у мышей-реципиентов. Проведена валидация жизнеспособности донорских листов сетчатки и клеточных суспензий перед трансплантацией. Подтверждена успешная доставка донорских клеток в субретинальное пространство мышиной модели дегенерации сетчатки. Были выявлены лишь редкие хирургические осложнения. Кроме того, трансплантированные фоторецепторы в трансплантатах сетчатки выжили и показали признаки продвинутого созревания во «взрослые» палочки и колбочки через два месяца после трансплантации.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию (публикации NIH No 8023, пересмотрено в 1978 году) и Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Джонса Хопкинса (одобрение M021M459).
1. Животные
- Используйте мышей Rho::EGFP (в возрасте P3-P6) в качестве доноров суспензий клеток сетчатки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот сорт был любезным подарком от доктора Т. Венселя из Медицинского колледжа Бэйлора. - Используйте мышей OPN1LW-EGFP/NRL-/- 14 (в возрасте P3) в качестве доноров листов сетчатки.
- Используйте взрослых мышей с дегенерацией сетчатки Rd1/NS с иммунодефицитом (любого пола) в качестве реципиентов.
- Содержате всех мышей в клетках в соответствии с циклом света и темноты 12:12 ч с доступом к воде и пище по мере необходимости.
2. Соберите нервную сетчатку (рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы выполнялись в стерильных условиях. Информация о поставщиках исследовательских инструментов и продуктов представлена в Таблице материалов.
- Подготовка донорских мышей: Усыпляйте мышей-доноров при передозировке углекислого газа и подтверждайте эвтаназию при вывихе шейки матки.
- Изолируйте глазные яблоки мышей. Для этого выполните следующие действия.
- Осторожно откройте веки щенка с помощью микроножниц, чтобы обнажить глазное яблоко.
- Используйте гладкие щипцы, чтобы захватить зрительный нерв и вытащить глазное яблоко с помощью щипцов.
- Изолировать нервную сетчатку
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется под микроскопом препарирования.- Сделайте надрез отверстия в центре роговицы стерильной иглой 25 G.
- Разрежьте роговицу через отверстие пополам и увеличьте разрез до склеры и РПЭ, затем удалите склеру и РПЭ.
- Используйте щипцы с микрозубьями, чтобы аккуратно удалить хрусталик и стекловидное тело, чтобы изолировать нервную сетчатку.
- При необходимости перейдите к разделу 3 для приготовления донорской суспензии сетчатки или к разделу 4 для подготовки донорского листа сетчатки.
3. Приготовьте донорскую суспензию сетчатки (рисунок 1)
- Инкубируют нервную сетчатку в растворе Папаина при температуре 37 °C в течение 20-30 мин до тех пор, пока не будут обнаружены скопления клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно пипетируйте клеточную смесь 15 раз каждые 10 минут. - Следуйте инструкциям производителя набора для диссоциации папаина, чтобы собрать отдельные клетки.
4. Подготовьте донорские листы сетчатки (рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует за разделом 2 и выполняется под микроскопом для препарирования.
- Поместите изолированную нервную чашку сетчатки в чашку Петри диаметром 35 мм с предварительно охлажденным стерильным PBS.
- С помощью микроножниц разрежьте нервную чашечку сетчатки на несколько листов сетчатки (примерно 1 мм х 2 мм).
5. Подготовьте мышей-реципиентов
- Обезболивайте мышей-реципиентов внутрибрюшинными инъекциями кетамина (100 мг/кг массы тела) и ксилазина гидрохлорида (20 мг/кг массы тела).
- Подтвердите хирургическую плоскость анестезии, обеспечив потерю мигательного и болевого рефлексов, нормальное дыхание и дыхание.
- Оценивают глубину анестезии по отсутствию реакции на защемление хвоста или снятие педальных рефлексов.
- Всегда проверяйте глубину анестетика во время операции и регулируйте глубину анестезии, если животное реагирует на боль. Держите мышей на предварительно разогретом операционном столе, чтобы предотвратить переохлаждение.
- Расширьте зрачки реципиента с помощью 1% (масс./об.) тропикамидных глазных капель за 5 мин до операции. Хорошо расширенный зрачок может облегчить трансзрачковую визуализацию под операционным микроскопом.
- Продезинфицировать оперирующий глаз мыши и окружающие глазные ткани повидон-йодом, промыть стерилизованным ПБС.
- Нанесите 0,5% пропаракаина гидрохлорид на глаз мыши для обезболивания.
6. Субретинальная трансплантация трансплантатов сетчатки (рис. 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие этапы выполнялись в асептических условиях. Хирургические инструменты были автоклавированы (используйте лотки для инструментов для защиты наконечников инструментов и выньте поршень из микрошприцев, чтобы предотвратить их застревание в просвете). Информация о поставщиках исследовательских инструментов и продуктов представлена в Таблице материалов.
- Парацентез передней камеры: проникновение периферической роговицы в переднюю камеру с помощью инсулиновой иглы, чтобы обеспечить пассивный выход водянистой влаги, чтобы предотвратить скачки внутриглазного давления (ВГД) во время трансплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Об успешном парацентезе свидетельствует отток водянистой влаги через отверстие роговицы. - Нанесите каплю гиалуроната натрия и стеклянный покровный листок (диаметр 5 мм) поверх роговицы, чтобы обеспечить транспупиллярную визуализацию глазного дна под хирургическим эндоскопом.
- Используйте зубчатые щипцы, чтобы обнажить место инъекции (1 мм построговичного лимба), надавливая либо на верхнюю, либо на нижнюю стенку глаза, как того требует эксперимент, к центру транспупиллярного зрения.
- Используйте иглу для микроинъекций для перпендикулярного проникновения в склеру.
- Осторожно поверните направление иглы по касательной, чтобы обеспечить полное проникновение комплекса склера-скуроид-РПЭ в субретинальное пространство.
- Введите иглу по касательной, чтобы получить доступ к месту впрыска на терминале.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте полное положение скоса иглы с помощью трансзрапиллярного зрения. Используйте поверхностные сосуды сетчатки в качестве анатомического ориентира для точного позиционирования иглы в субретинальном пространстве. - Инъекция трансплантатов сетчатки
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие небольших пузырьков, предварительно загруженных в шприц, может облегчить проверку точного субретинального позиционирования донорских клеток. Повышенное ВГД в результате субретинальной инъекции увеличивает риск рефлюкса донорских клеток.- Если роговица помутнела24,25, что является признаком высокого ВГД, держите иглу в субретинальном пространстве не менее 3 мин, пока роговица не очистится, показатель того, что ВГД достаточно снизился.
ПРИМЕЧАНИЕ: В редких случаях нормализация ВГД может занять больше времени, и рекомендуется держать иглу на месте до тех пор, пока чистота роговицы не восстановится, даже если это займет 8-10 минут. Наблюдайте под операционным микроскопом, чтобы не допустить повреждения структур сетчатки.
- Если роговица помутнела24,25, что является признаком высокого ВГД, держите иглу в субретинальном пространстве не менее 3 мин, пока роговица не очистится, показатель того, что ВГД достаточно снизился.
- Возьмитесь за край инъекционного отверстия щипцами с микрозубьями и быстро извлеките иглу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критериями успешной субретинальной доставки суспензии и пластины клеток сетчатки являются постоянный пузырь и видимый белый лист в субретинальном пространстве соответственно. - Промойте прооперированную область глаза искусственными слезами и при необходимости нанесите мазь.
- Послеоперационное введение
- Поместите пересаженных мышей в предварительно нагретую (37 °C) чистую клетку для восстановления и внимательно следите за тем, нет ли стресса.
- Нанесите каплю местного применения 0,5% пропаракаина гидрохлорида на хирургический глаз 2-3 раза, если возникает дистресс.
- Возвращайте мышей в клетку после того, как мыши полностью насторожятся и подвижны. Поместите в клетку небольшое количество гранул корма и стаканчик с гелем, если мышам трудно добраться до бункера для корма.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите поверхность глаза влажной до тех пор, пока не закончится действие анестезии, чтобы предотвратить образование катаракты.
7. Мультимодальная конфокальная сканирующая лазерная офтальмоскопия (cSLO)
- Через два месяца после трансплантации обезболивайте реципиентных мышей Rd1/NS (n=5) путем внутрибрюшинного введения кетамина (100 мг/кг массы тела) и ксилазина гидрохлорида (20 мг/кг массы тела) для визуализации.
- Расширьте зрачки с помощью 1% (масс./об.) тропикамидных глазных капель.
- Выполнение стандартной мультимодальной визуализации под углом 55° с помощью системы конфокального сканирующего лазерного офтальмоскопа cSLO22.
- Получение изображений МРТ и SD-ОКТ с использованием 30 кадров усреднения АРТ.
8. Гистологическое окрашивание
- Подготовьте замороженные предметные стекла трансплантированных глаз мышей Rd1/NS , как сообщалось ранее 14.
- Блокируйте и проникайте в замороженные предметные стекла трансплантированной сетчатки, используя смесь 5% козьей сыворотки и 1% Triton X100 в PBS.
- Инкубируют образцы с первичными антителами в течение ночи при 4 °C и промывают в PBS (5 мин, 3 раза). Первичные антитела включают козий анти-GFP-FITC (1:200), кроличий антирекремен (1:1000) и кроличий анти-S-опсин (1:500).
- Инкубируют образцы со вторичными антителами (козьи антикроличьи Cy3, 1:500) и окрашивают DAPI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поставщики первичных и вторичных антител перечислены в таблице материалов.
Representative Results
Трансплантаты сетчатки успешно доставляются в субретинальное пространство и выживают in vivo.
Эффективность нашей субретинальной трансплантационной платформы была оценена на мышах-реципиентах Rd1/NS в возрасте 6-8 недель, когда их остаточные сетчатки были сильно истончены из-за почти полной дегенерации внешнего ядерного слоя (ОНЛ). Учитывая хрупкость сетчатки, нехватку фоторецепторов колбочек и относительно низкую жизнеспособность клеток в суспензии по сравнению с листовыми донорами, мыши, богатые колбочками (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14 использовали в качестве источников донорских листов сетчатки и богатых палочками мышей (Rho::EGFP) в качестве донора клеточных суспензий. Богатый колбочками лист сетчатки и богатые палочками клеточные суспензии были успешно доставлены в субретинальное пространство всех мышей-реципиентов с помощью нашей хирургической платформы, что подтверждается субретинальным пузырем и белым листом, полученным с помощью транспупиллярной визуализации сразу после инъекции. Через два месяца после трансплантации была проведена мультимодальная cSLO визуализация для отслеживания состояния трансплантатов сетчатки in vivo. Поперечное ОКТ-сканирование показало, что трансплантаты сетчатки прижились в субретинальном пространстве и восстановили ONL у всех мышей-реципиентов (рис. 3A). Инфракрасная визуализация не обнаружила явной катаракты во всех пересаженных глазах (рис. 3B). Другие хирургические осложнения, включая кровоизлияние, редко выявлялись в трансплантированных сетчатках (n = 1/10 глаза) при многоцветной отражательной визуализации через два месяца после трансплантации (рис. 3C). Мы провели гистологическое окрашивание для дальнейшей оценки выживаемости и степени созревания фоторецепторов в трансплантатах сетчатки. В трансплантированных листах сетчатки наблюдалось большое количество фоторецепторов, экспрессирующих OPN1LW:EGFP и S-opsin. Аналогичным образом, трансплантированные клеточные суспензии сетчатки показали большую долю фоторецепторов Rec+ in vivo, включая многочисленные палочки Rho::EGFP+ (рис. 3D). У нетрансплантированных контрольных мышей наблюдалась тяжелая дегенерация ОНЛ с разреженными остаточными фоторецепторами колбочек (Rec+). Сигнал EGFP не был обнаружен в нетрансплантированной сетчатке Rd1/NS (рис. 3D).
Рисунок 1: Схема сбора донорского листа сетчатки и клеточных суспензий. Схемы, показывающие основные этапы сбора суспензий и листов клеток сетчатки у мышей-доноров Rho::EGFP . Светлопольная и флуоресцентная визуализация показала репрезентативные изображения диссоциированных клеток и рассеченного листа, выделенного от мышей Rho::EGFP . Желтая пунктирная линия: режущий край. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процедуры субретинальной трансплантации листов сетчатки и клеточной суспензии у мышей Rd1/NS . (А) Схематические изображения подготовки мышей-реципиентов. (B) Основные хирургические процедуры и соответствующие схемы, показывающие субретинальную трансплантацию суспензий и листов клеток сетчатки. Хирургические этапы включают: 1. проникновение в переднюю камеру; 2. Капните гиалуронат натрия на роговицу, затем установите покровное стекло поверх гиалуроната натрия, чтобы облегчить трансзрачковую визуализацию; 3. проникают в наружные слои глазной стенки (комплекс склера-схориоид-РПЭ). Углы проникновения иглы указаны на правой верхней панели иллюстрации; 4. Вставьте инъекционную иглу; 5. Вводите графты. Репрезентативные изображения показывают успешную доставку суспензий клеток сетчатки и листа у двух отдельных реципиентов соответственно. Звездочка: головка зрительного нерва; Красные наконечники стрел: кровеносный сосуд сетчатки; Белый наконечник стрелы: пробитый кончик иглы; Белые стрелки: привитые суспензии сетчатки или лист. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Успешная доставка трансплантатов сетчатки в субретинальное пространство и выживаемость in vivo. (A) Репрезентативные SD-ОКТ-изображения показали субретинальное распределение трансплантированных листов сетчатки и клеточных суспензий у двух отдельных мышей Rd1/NS , соответственно. В качестве контроля были собраны нетрансплантированные мыши Rd1/NS . Область интереса (ROI) обозначается желтыми пунктирными прямоугольниками на инфракрасных (ИК) изображениях глазного дна. Внутренняя часть сетчатки обозначается как пластинки ганглиозного клеточного слоя сетчатки (RGC), внутреннего плексиформного слоя (IPL) и внутреннего ядерного слоя (INL). (B) Репрезентативное инфракрасное (ИК) изображение трансплантированной мыши Rd1/NS показало отсутствие катаракты через расширенный зрачок. (C) Репрезентативные многоцветные изображения с коэффициентом отражения (МР) трансплантированных и нетрансплантированных глаз Rd1/NS . У пересаженных глаз не было явных хирургических осложнений, включая кровоизлияние. (D) Иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание трансплантированных (листовых и суспензионных) и нетрансплантированных (контрольных) мышей Rd1/NS . Данные показали многочисленные трансплантированные фоторецепторы, экспрессирующие специфические маркеры фоторецепторов (Rec), палочек (Rho::EGFP), колбочек L/M (OPN1LW:EGFP) и S-колбочек (S-opsin) через два месяца после трансплантации. Пластинки сетчатки-реципиента были идентифицированы с помощью окрашивания DAPI (синего цвета). Трансплантаты сетчатки были идентифицированы репортером EGFP (зеленый). У нетрансплантированных мышей наблюдалась тяжелая дегенерация ONL с разреженными остаточными фоторецепторами колбочек (Rec+). Сигнал EGFP не был обнаружен в нетрансплантированной сетчатке Rd1/NS . Увеличенные изображения были представлены на двух правых панелях. Сокращения: RGC: слой ганглиозных клеток сетчатки; INL: внутренний ядерный слой. ONL: внешний ядерный слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Субретинальная трансплантация у мышей технически сложна из-за небольшого размера мышиных глаз. В этом исследовании мы разработали простую и воспроизводимую платформу для субретинальной трансплантации у мышей-реципиентов. Платформа обеспечивает постоянство в защите жизнеспособности донора, успешную субретинальную доставку и обеспечивает низкую частоту осложнений.
Техника субретинальной трансплантации, представленная здесь, была разработана на основе транссклерального пути, при котором инъекционная игла проникает в наружные слои (комплекс склера-схориоид-RPE) глазной стенки. По сравнению с трансроговичнымподходом 19,20 и трансстекловидным21,26,27, транссклеральный доступ проникает непосредственно в субретинальное пространство, не проникая в структуры переднего сегмента и невральную сетчатку, что обеспечивает безвредную трансплантацию и снижает риск рефлюкса донорских клеток через проникающее отверстие. Сложность транссклерального подхода заключается в том, чтобы обеспечить распространение кончика иглы вдоль субретинального пространства до прибытия в терминальное место родоразрешения, избегая при этом потенциального нарушения соседних слоев РПЭ и сосудистой оболочки. Достичь этих целей с помощью традиционного транссклерального подхода28,29 без прямого визуального руководства сложно. В этом исследовании мы разработали транспупиллярную платформу с визуальным контролем с использованием хирургического микроскопа и внешнего освещения сетчатки для облегчения субретинальной трансплантации на мышиных моделях. Платформа позволяет оператору отслеживать хирургический процесс и состояние сетчатки реципиента, обеспечивая визуализацию глазного дна реципиента под операционным микроскопом в режиме реального времени. Например, успешное проникновение комплекса склера-склероидная оболочка-РПЭ может быть просто подтверждено относительно ярким отражением кончика иглы с помощью транспупиллярной визуализации. Важно отметить, что, руководствуясь транспупиллярной визуализацией, оператор может точно модулировать угол и глубину инъекции в соответствии с относительным положением иглы и анатомическими структурами в сетчатке реципиента (например, сосудами сетчатки и головкой зрительного нерва). Кроме того, точное введение материалов с помощью этой методики позволяет свести к минимуму РПЭ, травмы сосудистой оболочки и другие хирургические осложнения. Действительно, мы обнаружили, что кровоизлияния можно свести к минимуму, избегая маневров в непосредственной близости от кровеносных сосудов сетчатки с помощью транспупиллярной визуализации.
Рефлюкс донорских клеток является основной причиной послеинъекционной хирургической неудачи29,30. Существует множество факторов, способствующих рефлюксу донорских клеток. Высокое внутриглазное давление (ВГД) в глазах реципиента, вызванное введенными смесями донорских клеток, является важным фактором, способствующим рефлюксу клеток из глаза. Наш протокол снижает ВГД реципиента за счет проникновения в переднюю камеру в начале операции и позволяет ВГД самопроизвольно снижаться за счет выхода водянистой жидкости перед извлечением иглы стекловидного тела из полости стекловидного тела. Вторым фактором является негерметичный инъекционный туннель в глазах реципиента. Чтобы предотвратить рефлюкс трансплантата обратно через инъекционный туннель, мы используем иглу микроинъекций небольшого размера (34G) для создания самогерметизирующегося туннеля при проникновении в стенку глаза и зубчатые микрощипцы для удержания краев отверстия внешнего туннеля при извлечении иглы. При обычной трансплантации рефлюксные трансплантаты практически не обнаруживаются, потому что они могут быстро возникать или быстро рассасываться. Гиалуронат натрия при нанесении покровного стекла почти всегда соскальзывает с роговицы, покрывая большую часть лимба и склеры, включая место склеротомии. После введения клеток гиалуронат натрия в месте склеротомии может помочь замедлить основной поток рефлюксного содержимого, если таковой имеется, и сделать его визуально заметным под операционным микроскопом. Кроме того, отсутствие рефлюкса также может быть проверено путем отслеживания постоянства субретинального пузыря на предмет клеточных суспензий и внутриглазного расположения сетчатчатого листа с помощью нашего протокола, что может быть полезно для лабораторий, где оптическая когерентная томография (ОКТ) недоступна.
Несмотря на то, что значительное количество фоторецепторных клеток выжило в пересаженных листах сетчатки, не было обнаружено никакой различимой ориентации клеток или ориентации листа. Несмотря на то, что доставка 3D-листов сетчатки крупным животным была установлена 26,31,32, субретинальное пространство у мышей в сочетании с отсутствием возможности интраоперационной визуализации сетчатки делает очень сложным обеспечение поддержания ориентации листа во время операции, а также в ближайшем послеоперационном периоде, в течение которого трансплантированные клетки или листы могут стать нестабильными, когда мышь восстанавливает способность передвигаться.
Мы описываем транссклеральную хирургическую платформу с прямым транспупиллярным зрением для субретинальной трансплантации у мышей-реципиентов. Эта платформа обеспечивает высокую точность инъекций и низкий уровень хирургических осложнений. Эта платформа обеспечивает точную доставку известных доз клеток, относительно проста в освоении и облегчает субретинальную доставку в дополнение к интраретинальным или интравитреальным инъекциям для различных типов терапевтических агентов, включая генную терапию.
Disclosures
MSS является/была оплачиваемым консультантом Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, W. L. Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals и Acucela. MSS получает спонсорскую поддержку исследований от Bayer. Эти договоренности были рассмотрены и одобрены Университетом Джонса Хопкинса в соответствии с его политикой в отношении конфликта интересов. Компания KVL названа изобретателем в патентных заявках Университета Колорадо. MSS и YVL названы изобретателями в патентных заявках Университета Джонса Хопкинса.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет следующих средств: NEI R01EY033103 (MSS), Фонд борьбы со слепотой (MSS), Фонд Шульского (MSS), Фонд Джозефа Альберта Хекимяна (MSS), Фонд зрения Джульетт RP (YVL), Research to Prevention Blindness (неограниченный грант Институту глаз Уилмера при Университете Джонса Хопкинса и Институту глаз Каллена при Медицинском колледже Бэйлора). Мы благодарим д-ра Малию Эдвардс (Медицинский факультет Университета Джонса Хопкинса) за любезное обучение работе с микроскопом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears | CareAll | P31447-04 | |
| Coverslips (5mm in diameter) | Deckglaser | N/A | |
| Goat anti-GFP (FITC) | Abcam | Ab6662 | |
| Goat-anti-rabbit Cy3 | Invitrogen | A10520 | |
| Insulin syringe (30G) | Easy Touch | 08496-3015-11 | |
| Ketamine | VETone Zetamine | AH2017J | |
| Live Dead Viability Kit | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| Micro scissor | Harvard Apparatus | 72-8503 | |
| Micro smooth forceps | ASICO | AE-4360 | |
| Micro toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Microinjection needle (26G) | Hamilton | 7804-03 | |
| Microinjection needle (34G) | Hamilton | 207434 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Petri-dish (35 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB012920 | |
| Povidone-iodine (10%) | Betadine Solution | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride (0.5%) | Keeler | AX0500 | |
| Rabbit anti-recoverin | Millipore | Ab5585 | |
| Rabbit anti-S-opsin | Millipore | Ab5407 | |
| Sodium hyaluronate | Johnson & Johnson Vision | 10-2400-11 | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 2PC | |
| Sterile needle (25G) | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical materials/reagents | |||
| Tropicamide ophthalmic solution | Henry Schein | 112-7192 | |
| Xylazine | AnaSed Injection | N/A |
References
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Sci Transl Med. 10 (435), (2018).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Sci Transl Med. 11 (475), (2019).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).
- Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).
- Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
- Klassen, H., et al. Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients. Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).
- Das, T., et al. The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study. Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).
- Humayun, M. S., et al.
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209 (2017).
- Liu, Y. V., et al. Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line. Exp Eye Res. 210, 108715 (2021).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).
- Ortin-Martinez, A., et al. Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material. EMBO J. 40 (22), 107264 (2021).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Singh, M. S., et al. Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion. Nat Commun. 7, 13537 (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).
- Fang, Y., et al. Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).
- Liu, Y. V., et al. Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation. Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5 (2020).
- Liu, Y. V., et al. Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin. Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).
- Park, S., et al. Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies. Ann Transl Med. 9 (15), 1271 (2021).
- Li, X., et al. Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells. Sci Rep. 7 (1), 6951 (2017).
- Chao, J. R., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate. Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4 (2017).
- Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).
- Zhao, C., et al. Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J Vis Exp. (126), e55220 (2017).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), e4286 (2012).
- Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).
- Luo, Z., et al. Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors. Stem Cells Int. 2018, 9437041 (2018).
- Luo, Z., et al. Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates. Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).
