Summary
यह प्रोटोकॉल रेटिना अध: पतन के साथ या बिना माउस प्राप्तकर्ताओं में, सर्जिकल जटिलताओं की कम दर के साथ, सुरक्षित रूप से और ठीक से सबरेटिनल सेलुलर ग्राफ्ट वितरित करने के लिए एक ट्रांसप्यूपिलरी दृष्टि-निर्देशित ट्रांस-स्क्लरल दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है।
Abstract
फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं और रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) कोशिकाओं का प्रत्यारोपण रेटिना अध: पतन रोगों के लिए एक संभावित चिकित्सा प्रदान करता है। माउस प्राप्तकर्ताओं में चिकित्सीय दाता कोशिकाओं के Subretinal प्रत्यारोपण माउस आंख की छोटी मात्रा द्वारा अनुमति दी सीमित शल्य चिकित्सा अंतरिक्ष के कारण चुनौतीपूर्ण है. हमने माउस प्राप्तकर्ताओं में बहिर्जात कोशिकाओं के सबरेटिनल डिलीवरी की सुविधा के लिए प्रत्यक्ष ट्रांसप्यूपिलरी दृष्टि मार्गदर्शन के साथ एक ट्रांस-स्क्लरल सर्जिकल प्रत्यारोपण मंच विकसित किया। मंच रेटिना सेल निलंबन और तीन आयामी रेटिना चादरों रॉड अमीर Rho से एकत्र का उपयोग कर परीक्षण किया गया था :: EGFP चूहों और शंकु समृद्ध OPN1LW-EGFP; एनआरएल-/- चूहों, क्रमशः। जीवित / मृत परख ने दाता कोशिकाओं के दोनों रूपों के लिए कम कोशिका मृत्यु दर दिखाई। रेटिना ग्राफ्ट को रेटिना डिजनरेशन, आरडी 1 / एनएस के माउस मॉडल के सबरेटिनल स्पेस में सफलतापूर्वक वितरित किया गया था, जिसमें मल्टीमॉडल कॉन्फोकल स्कैनिंग लेजर ऑप्थाल्मोस्कोप (सीएसएलओ) इमेजिंग द्वारा पता लगाया गया न्यूनतम सर्जिकल जटिलताओं के साथ। प्रत्यारोपण के दो महीने बाद, हिस्टोलॉजिकल धुंधला ने सबरेटिनल स्पेस में 'वयस्क' छड़ और शंकु (क्रमशः मजबूत Rho:: EGFP, S-opsin, और OPN1LW: EGFP अभिव्यक्ति द्वारा) में रेटिना ग्राफ्ट की उन्नत परिपक्वता के प्रमाण का प्रदर्शन किया। यहां, हम एक सर्जिकल प्लेटफॉर्म प्रदान करते हैं जो माउस प्राप्तकर्ताओं में जटिलताओं की कम दर के साथ अत्यधिक सटीक सबरेटिनल डिलीवरी को सक्षम कर सकता है। यह तकनीक कौशल अधिग्रहण की सटीक और सापेक्ष आसानी प्रदान करती है। इसके अलावा, तकनीक का उपयोग न केवल सबरेटिनल सेल प्रत्यारोपण के अध्ययन के लिए बल्कि जीन थेरेपी सहित अन्य इंट्राओकुलर चिकित्सीय अध्ययनों के लिए भी किया जा सकता है।
Introduction
फोटोरिसेप्टर और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियल (आरपीई) कोशिकाओं का प्रत्यारोपण रेटिना अपक्षयी रोगों जैसे उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी), स्टर्गर्ड रोग और रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी) 1,2,3,4,5,6,7 के लिए संभावित चिकित्सा प्रदान करता है . पतित रेटिना में रोगग्रस्त फोटोरिसेप्टर और आरपीई कोशिकाओं को फिर से भरने या बदलने के लिए, सबरेटिनल स्पेस विशेष रूप से मेजबान फोटोरिसेप्टर और आरपीई कोशिकाओं के लामिना शरीर रचना को देखते हुए प्रत्यारोपण लक्ष्य के रूप में उपयुक्त है। जबकि आरपीई कोशिकाओं के उप-रेटिना प्रत्यारोपण की शल्य चिकित्सा प्रक्रियाएं बड़े जानवरों 8,9,10 और नैदानिक परीक्षणों11,12,13 में अच्छी तरह से स्थापित हैं, फोटोरिसेप्टर प्रत्यारोपण अनुसंधान का सामना करने वाली चुनौतियों में ट्रांसजेनिक बड़े पशु मॉडल की कमी और न्यूरोनल प्रत्यारोपण में शामिल गहराई से सिनैप्टोजेनेसिस तंत्र की सीमित समझ शामिल है, अन्य चिंताओं के बीच। आनुवंशिक रूप से संशोधित murine मॉडल, रेटिना अध: पतन म्यूटेंट के विभिन्न प्रकार के साथ, प्रत्यारोपण के संदर्भ में आणविक तंत्र का अध्ययन करने और पूर्व नैदानिक चरण 14,15,16,17,18 पर प्रभावी सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा के विकास स्टीयरिंग के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं.
बड़े जानवरों (जैसे, सुअर, बंदर) में अपेक्षाकृत बड़ी आंख और छोटे क्रिस्टलीय लेंस के विपरीत, माउस आंखों के छोटे आकार और बड़े क्रिस्टलीय लेंस उन्हें मुश्किल सर्जिकल लक्ष्य बनाते हैं, विशेष रूप से सबरेटिनल प्रत्यारोपण के लिए जिसमें भौतिक स्थान की कमी और सीमित प्रत्यक्ष दृश्य मुख्य चुनौतियां हैं।
वर्तमान दृष्टिकोण को इंजेक्शन मार्ग के आधार पर तीन प्रमुख प्रकारों में वर्गीकृत किया जा सकता है। सबसे पहले, ट्रांस कॉर्नियल दृष्टिकोण के मामले में, सुई कांच गुहा में और फिर subretinal अंतरिक्ष19,20 में कॉर्निया के माध्यम से पारित किया जाता है. इस पद्धति का उपयोग करके सफल सबरेटिनल डिलीवरी प्राप्त की जा सकती है लेकिन पूर्वकाल खंड संरचनाओं (यानी, कॉर्निया, आईरिस, लेंस) को नुकसान एक बड़ा जोखिम है जो विवो विश्लेषण में डाउनस्ट्रीम को गंभीर रूप से बाधित कर सकता है। दूसरा, ट्रांस-विट्रियस दृष्टिकोण के मामले में, सुई पार्स प्लाना के माध्यम से कांच की गुहा में प्रवेश करती है और फिर सबरेटिनल स्पेस21 में प्रवेश करती है। यह दृष्टिकोण मनुष्यों और बड़े जानवरों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, कृन्तकों में लेंस क्षति का एक संभावित जोखिम है क्योंकि लेंस कांच की गुहा की एक बड़ी सापेक्ष मात्रा पर कब्जा कर लेता है। विशेष रूप से, ट्रांस-कॉर्नियल और ट्रांस-विट्रियस प्रोटोकॉल दोनों को सबरेटिनल स्पेस पर पहुंचने के लिए तंत्रिका रेटिना के प्रवेश की आवश्यकता होती है, जो मेजबान रेटिना को नुकसान पहुंचाता है और प्रवेश छेद के माध्यम से दाता सेल भाटा का खतरा बढ़ जाता है। तीसरा, ट्रांस-स्क्लरल दृष्टिकोण22,23 के मामले में, सुई स्क्लरल-कोरॉइड-आरपीई कॉम्प्लेक्स के माध्यम से प्रवेश करती है और सीधे सबरेटिनल स्पेस में प्रवेश करती है। यह दृष्टिकोण पूर्वकाल खंड संरचनाओं और कांच की गुहा के संभावित आघात को कम करता है। हालांकि, मेजबान फंडस के प्रत्यक्ष दृश्य के बिना, ट्रांस-रेटिना पंचर, आरपीई टुकड़ी और कोरॉइड रक्तस्राव के कारण सर्जिकल विफलताओं का आमतौर पर पता लगाया जाता है।
यहां, हमने माउस प्राप्तकर्ताओं में सबरेटिनल प्रत्यारोपण के लिए प्रत्यक्ष ट्रांसप्यूपिलरी दृष्टि मार्गदर्शन के साथ एक ट्रांस-स्क्लरल सर्जिकल प्लेटफॉर्म विकसित किया है। प्रत्यारोपण से पहले दाता रेटिना शीट और सेल निलंबन की व्यवहार्यता का सत्यापन किया गया था. एक रेटिना अध: पतन माउस मॉडल के subretinal अंतरिक्ष में दाता कोशिकाओं के सफल वितरण की पुष्टि की गई थी. केवल दुर्लभ सर्जिकल जटिलताओं का पता चला था। इसके अलावा, रेटिना ग्राफ्ट में प्रत्यारोपित फोटोरिसेप्टर बच गए और प्रत्यारोपण के दो महीने बाद "वयस्क" छड़ और शंकु में उन्नत परिपक्वता के सबूत दिखाए।
Protocol
सभी पशु प्रयोगों को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान गाइड (एनआईएच प्रकाशन संख्या 8023, संशोधित 1978) और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एआरवीओ वक्तव्य के अनुसार किया गया था। सभी प्रक्रियाओं को जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति (अनुमोदन M021M459) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. जानवर
- Rho:: EGFP चूहों (वृद्ध P3-P6) का उपयोग रेटिना सेल निलंबन के दाताओं के रूप में करें।
नोट: यह तनाव डॉ टी वेन्सेल, बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन से एक तरह का उपहार था। - OPN1LW-EGFP/NRL-/- चूहों14 (वृद्ध P3) रेटिना शीट के दाताओं के रूप में प्रयोग करें.
- प्राप्तकर्ताओं के रूप में प्रतिरक्षा की कमी (या तो लिंग) के साथ वयस्क रेटिना अध: पतन आरडी 1 / एनएस चूहों का उपयोग करें।
- एक 12:12 घंटे प्रकाश-अंधेरे चक्र के तहत पिंजरों में सभी चूहों को आवश्यकतानुसार पानी और भोजन तक पहुंच के साथ रखें।
2. तंत्रिका रेटिना लीजिए (चित्र 1)
नोट: सभी निम्नलिखित चरणों बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन किया गया. अनुसंधान उपकरण और उत्पादों की आपूर्तिकर्ता जानकारी सामग्री की तालिका में प्रदान की जाती है।
- दाता चूहों की तैयारी: कार्बन डाइऑक्साइड की अधिक मात्रा के साथ दाता चूहों को इच्छामृत्यु दें और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ इच्छामृत्यु की पुष्टि करें।
- चूहों नेत्रगोलक को अलग करें। ऐसा करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
- नेत्रगोलक को उजागर करने के लिए सूक्ष्म कैंची का उपयोग करके पिल्ले की पलकें सावधानी से खोलें।
- ऑप्टिक तंत्रिका हड़पने और संदंश की एक जोड़ी के साथ नेत्रगोलक बाहर खींचने के लिए चिकनी संदंश का प्रयोग करें.
- तंत्रिका रेटिना को अलग करें
नोट: यह कदम एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है।- एक 25 जी बाँझ सुई का उपयोग करके कॉर्निया के केंद्र में एक छेद करें।
- कॉर्निया को छेद के माध्यम से, आधे में काटें और श्वेतपटल और आरपीई के लिए चीरा बढ़ाएं, फिर श्वेतपटल और आरपीई को हटा दें।
- धीरे तंत्रिका रेटिना को अलग करने के लिए लेंस और कांच को हटाने के लिए सूक्ष्म दांतेदार संदंश का प्रयोग करें.
- दाता रेटिना निलंबन या धारा 4 दाता रेटिना शीट तैयार करने के लिए तैयार करने के लिए धारा 3 के साथ आगे बढ़ें, आवश्यकतानुसार।
3. दाता रेटिना निलंबन (चित्रा 1) तैयार करें
- कोई सेल गुच्छों का पता चला रहे हैं जब तक 20-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पपैन समाधान में तंत्रिका रेटिना सेते हैं.
नोट: धीरे से सेल मिश्रण 15x हर 10 मिनट विंदुक - एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए Papain पृथक्करण किट के निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
4. दाता रेटिना चादरें (चित्रा 1) तैयार करें
नोट: यह कदम खंड 2 का अनुसरण करता है और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है।
- पृथक तंत्रिका रेटिना कप को प्रीचिल्ड बाँझ पीबीएस के साथ 35 मिमी पेट्री डिश में रखें।
- तंत्रिका रेटिना कप को कई रेटिना शीट (लगभग 1 मिमी x 2 मिमी) में काटने के लिए माइक्रो कैंची का उपयोग करें।
5. प्राप्तकर्ता चूहों को तैयार करें
- केटामाइन (100 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) और xylazine हाइड्रोक्लोराइड (20 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ प्राप्तकर्ता चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
- पलक और दर्द सजगता, नियमित रूप से साँस लेने और श्वसन के नुकसान को सुनिश्चित करके संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान की पुष्टि करें।
- पूंछ चुटकी या पेडल सजगता वापसी की प्रतिक्रिया की कमी से संवेदनाहारी गहराई का आकलन करें।
- हमेशा ऑपरेटिव प्रक्रिया के दौरान संवेदनाहारी गहराई recheck और संवेदनाहारी गहराई को समायोजित अगर जानवर दर्द के प्रति उत्तरदायी है. हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए चूहों को प्री-वार्म सर्जरी टेबल पर रखें।
- सर्जरी से 5 मिनट पहले 1% (wt/vol) tropicamide आई ड्रॉप के साथ प्राप्तकर्ता विद्यार्थियों को पतला करें। एक अच्छी तरह से फैली हुई पुतली ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत ट्रांसप्यूपिलरी विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान कर सकती है।
- ऑपरेटिंग माउस आंख और povidone-आयोडीन के साथ आसपास के नेत्र ऊतकों कीटाणुरहित, निष्फल पीबीएस के साथ धो लें.
- एनाल्जेसिया के लिए माउस आंख पर 0.5% प्रोपेराकाइन हाइड्रोक्लोराइड लागू करें।
6. रेटिना ग्राफ्ट के सबरेटिनल प्रत्यारोपण (चित्र 2)
नोट: सभी निम्नलिखित चरणों सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत प्रदर्शन किया गया. सर्जिकल उपकरण आटोक्लेव किए गए थे (टूल टिप्स की सुरक्षा के लिए इंस्ट्रूमेंट ट्रे का उपयोग करें और प्लंजर को माइक्रो सीरिंज से बाहर निकालें ताकि उन्हें लुमेन में फंसने से रोका जा सके)। अनुसंधान उपकरण और उत्पादों की आपूर्तिकर्ता जानकारी सामग्री की तालिका में प्रदान की जाती है।
- पूर्वकाल कक्ष paracentesis: प्रत्यारोपण के दौरान intraocular दबाव (IOP) spikes को रोकने के लिए, जलीय हास्य निष्क्रिय बाहर निकलने के लिए जलीय हास्य की अनुमति देने के लिए एक इंसुलिन सुई के साथ पूर्वकाल कक्ष में परिधीय कॉर्निया प्रवेश.
नोट: एक सफल पैरासेन्टेसिस कॉर्निया छेद के माध्यम से जलीय हास्य के प्रवाह द्वारा इंगित किया जाता है। - सर्जिकल स्कोप के तहत फंडस के ट्रांसप्यूपिलरी विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करने के लिए कॉर्निया के शीर्ष पर सोडियम हाइलूरोनेट और एक ग्लास कवरस्लिप (5 मिमी व्यास) की एक बूंद डालें।
- इंजेक्शन स्थान (1 मिमी के बाद कॉर्नियल लिंबस) को बेनकाब करने के लिए दांतेदार संदंश का उपयोग करें, जैसा कि प्रयोग द्वारा आवश्यक है, ट्रांसप्यूपिलरी दृष्टि के केंद्र की ओर।
- श्वेतपटल लंबवत घुसना करने के लिए एक microinjection सुई का प्रयोग करें.
- ध्यान से सुई दिशा स्पर्शरेखा बारी बारी से subretinal अंतरिक्ष में श्वेतपटल-रंजित-आरपीई परिसर के पूरा प्रवेश की अनुमति देने के लिए.
- टर्मिनल इंजेक्शन स्थान का उपयोग करने के लिए सुई स्पर्शरेखा डालें.
नोट: ट्रांसप्यूपिलरी दृष्टि मार्गदर्शन द्वारा सुई के बेवल की पूरी स्थिति को सत्यापित करें। सबरेटिनल स्पेस के भीतर सटीक सुई की स्थिति के लिए एक शारीरिक संदर्भ के रूप में सतही रेटिना वाहिकाओं का उपयोग करें। - रेटिना ग्राफ्ट इंजेक्ट करें
नोट: सिरिंज में पहले से लोड किए गए छोटे बुलबुले की उपस्थिति दाता कोशिकाओं की सटीक सबरेटिनल स्थिति के सत्यापन की सुविधा प्रदान कर सकती है। सबरेटिनल इंजेक्शन के परिणामस्वरूप ऊंचा आईओपी दाता सेल भाटा का खतरा बढ़ जाता है।- कॉर्निया24,25 बादल छाए रहते हैं, उच्च IOP का एक संकेतक, कम से कम 3 मिनट के लिए subretinal अंतरिक्ष में सुई रखने जब तक कॉर्निया साफ हो जाता है, IOP पर्याप्त रूप से कम हो गया है कि एक संकेतक.
नोट: दुर्लभ मामलों में, IOP को सामान्य होने में अधिक समय लग सकता है, और सुई को तब तक रखने की सिफारिश की जाती है जब तक कि कॉर्निया की स्पष्टता बहाल न हो जाए, भले ही इसमें 8-10 मिनट लगें। रेटिना संरचनाओं को नुकसान को रोकने के लिए एक शल्य माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।
- कॉर्निया24,25 बादल छाए रहते हैं, उच्च IOP का एक संकेतक, कम से कम 3 मिनट के लिए subretinal अंतरिक्ष में सुई रखने जब तक कॉर्निया साफ हो जाता है, IOP पर्याप्त रूप से कम हो गया है कि एक संकेतक.
- सूक्ष्म दांतेदार संदंश के साथ इंजेक्शन छेद बढ़त समझ और जल्दी से सुई वापस लेने.
नोट: एक रेटिना सेल निलंबन और शीट के सफल सबरेटिनल डिलीवरी के लिए मानदंड क्रमशः एक निरंतर ब्लीब और सबरेटिनल स्पेस में एक दृश्यमान सफेद शीट है। - कृत्रिम आँसू के साथ आंख के सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें और यदि आवश्यक हो तो मरहम लागू करें।
- सर्जरी के बाद प्रशासन
- प्रत्यारोपित चूहों को पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) स्वच्छ वसूली पिंजरे में रखें और संकट के लिए सावधानीपूर्वक निगरानी करें।
- संकट होने पर सर्जिकल आंख पर सामयिक 0.5% प्रोपेराकाइन हाइड्रोक्लोराइड की एक बूंद 2-3 बार लागू करें।
- चूहों को पूरी तरह से सतर्क और मोबाइल होने के बाद घर के पिंजरे में चूहों को लौटाएं। पिंजरे में खाद्य छर्रों और एक जेल कप की एक छोटी संख्या रखें अगर चूहों को भोजन हॉपर तक पहुंचने में परेशानी होती है।
नोट: मोतियाबिंद गठन को रोकने के लिए संज्ञाहरण बंद हो जाता है जब तक आंख की सतह नम रखें।
7. मल्टीमॉडल कॉन्फोकल स्कैनिंग लेजर ऑप्थाल्मोस्कोपी (सीएसएलओ) इमेजिंग
- प्रत्यारोपण के दो महीने बाद, इमेजिंग के लिए केटामाइन (100 मिलीग्राम/किग्रा शरीर के वजन) और xylazine हाइड्रोक्लोराइड (20 मिलीग्राम/किग्रा शरीर के वजन) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा प्राप्तकर्ता Rd1/NS चूहों (n=5) को एनेस्थेटाइज करें।
- 1% (wt/vol) tropicamide आई ड्रॉप के साथ विद्यार्थियों को पतला करें।
- कॉन्फोकल स्कैनिंग लेजर ऑप्थाल्मोस्कोप सीएसएलओ सिस्टम22 का उपयोग करके मानक 55 डिग्री मल्टीमॉडल इमेजिंग करें।
- एआरटी औसत के 30 फ्रेम का उपयोग करके एमआर और एसडी-ओसीटी छवियां प्राप्त करें।
8. हिस्टोलॉजिकल धुंधला हो जाना
- प्रत्यारोपित आरडी 1/एनएस चूहों की आंखों के जमे हुए स्लाइड तैयार के रूप में पहले 14 की सूचना दी.
- ब्लॉक और पीबीएस में 5% बकरी सीरम और 1% ट्राइटन X100 का एक मिश्रण का उपयोग प्रत्यारोपित रेटिना के जमे हुए स्लाइड घुसना.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूने सेते हैं और पीबीएस (5 मिनट, 3x) में कुल्ला. प्राथमिक एंटीबॉडी में बकरी एंटी-जीएफपी-एफआईटीसी (1:200), खरगोश एंटी-रिकवरिन (1:1000), और खरगोश एंटी-एस-ऑप्सिन (1:500) शामिल हैं।
- माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी खरगोश Cy3, 1:500) के साथ नमूने सेते हैं और DAPI के साथ counterstained.
नोट: प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के आपूर्तिकर्ताओं को सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किया गया है।
Representative Results
रेटिना ग्राफ्ट को सफलतापूर्वक सबरेटिनल स्पेस में पहुंचाया जाता है और विवो में बच जाता है।
हमारे सबरेटिनल ट्रांसप्लांटेशन प्लेटफॉर्म के प्रदर्शन का मूल्यांकन 6-8 सप्ताह की आयु के आरडी 1/एनएस प्राप्तकर्ता चूहों में किया गया था, जब लगभग पूर्ण बाहरी परमाणु परत (ओएनएल) अध: पतन के कारण उनके अवशिष्ट रेटिना गंभीर रूप से पतले हो गए थे। रेटिना की नाजुकता को देखते हुए, शंकु फोटोरिसेप्टर की कमी, और शीट दाताओं की तुलना में निलंबन में कोशिकाओं की अपेक्षाकृत खराब व्यवहार्यता, शंकु समृद्ध चूहों (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14 सेल निलंबन के लिए दाता के रूप में दाता रेटिना शीट और रॉड अमीर चूहों (Rho:: EGFP) के स्रोतों के रूप में इस्तेमाल किया गया. शंकु समृद्ध रेटिना शीट और रॉड समृद्ध सेल निलंबन सफलतापूर्वक हमारे शल्य चिकित्सा मंच का उपयोग कर सभी प्राप्तकर्ता चूहों के subretinal अंतरिक्ष में वितरित किया गया, के रूप में subretinal bleb और सफेद चादर इंजेक्शन के तुरंत बाद transpupillary दृश्य का उपयोग कर देखा द्वारा पुष्टि की. प्रत्यारोपण के दो महीने बाद, विवो में रेटिना ग्राफ्ट के राज्यों को ट्रैक करने के लिए मल्टीमॉडल सीएसएलओ इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया था। क्रॉस-अनुभागीय ओसीटी स्कैनिंग से पता चला है कि रेटिना ग्राफ्ट सबरेटिनल स्पेस में बच गए और सभी प्राप्तकर्ता चूहों (चित्रा 3ए) में ओएनएल का पुनर्गठन किया। इन्फ्रारेड इमेजिंग ने सभी प्रत्यारोपित आंखों (चित्रा 3 बी) में कोई स्पष्ट मोतियाबिंद नहीं पाया। रक्तस्राव सहित अन्य शल्य चिकित्सा जटिलताओं शायद ही कभी प्रत्यारोपित रेटिना (एन = 1/10 आंखों) में दो महीने के बाद प्रत्यारोपण (चित्रा 3 सी) में बहुरंगा परावर्तन इमेजिंग द्वारा पाया गया था। हमने रेटिना ग्राफ्ट में फोटोरिसेप्टर के अस्तित्व और परिपक्वता की सीमा का आकलन करने के लिए हिस्टोलॉजिकल धुंधला प्रदर्शन किया। OPN1LW व्यक्त प्रचुर मात्रा में शंकु फोटोरिसेप्टर्स: प्रत्यारोपित रेटिना शीट में EGFP और S-opsin मनाया गया. इसी तरह, प्रत्यारोपित रेटिना सेल निलंबन ने विवो में आरईसी + फोटोरिसेप्टर का एक बड़ा अनुपात दिखाया, जिसमें कई आरएच:: ईजीएफपी + छड़(चित्रा 3डी)शामिल हैं। गैर-प्रत्यारोपित नियंत्रण चूहों ने विरल अवशिष्ट शंकु फोटोरिसेप्टर (आरईसी +) के साथ गंभीर ओएनएल अध: पतन दिखाया। गैर-प्रत्यारोपित आरडी1/एनएस रेटिना(चित्रा 3डी)में कोई ईजीएफपी संकेत नहीं पाया गया।
चित्रा 1: दाता रेटिना शीट और सेल निलंबन इकट्ठा करने का योजनाबद्ध। योजनाबद्ध दाता Rho से रेटिना सेल निलंबन और चादरें इकट्ठा करने के महत्वपूर्ण कदम दिखा : : ईजीएफपी चूहों. उज्ज्वल-क्षेत्र और फ्लोरोसेंट इमेजिंग ने अलग-अलग कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां और Rho:: EGFP चूहों से अलग एक विच्छेदित शीट दिखाई। पीली बिंदीदार रेखा: आकस्मिक मार्जिन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: आरडी 1 / एनएस चूहों में रेटिना शीट और सेल निलंबन के सबरेटिनल प्रत्यारोपण की प्रक्रियाएं। (ए) प्राप्तकर्ता चूहों की तैयारी की योजनाबद्ध छवियां। (बी) प्रमुख शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और इसी आरेख रेटिना सेल निलंबन और चादरों के subretinal प्रत्यारोपण दिखा रहा है. सर्जिकल चरणों में शामिल हैं: 1. पूर्वकाल कक्ष में प्रवेश करना; 2. कॉर्निया पर सोडियम हाइलूरोनेट को छोड़ दें, फिर ट्रांसप्यूपिलरी विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा के लिए सोडियम हाइलूरोनेट के शीर्ष पर कवरस्लिप को माउंट करें; 3. आंख की दीवार (श्वेतपटल-रंजित-आरपीई परिसर) की बाहरी परतों में प्रवेश करें। सुई के प्रवेश कोण चित्रण के ऊपरी दाएं पैनल पर हैं; 4. इंजेक्शन सुई डालें; 5. ग्राफ्ट इंजेक्ट करें। प्रतिनिधि छवियां क्रमशः दो व्यक्तिगत प्राप्तकर्ताओं में रेटिना सेल निलंबन और शीट की सफल डिलीवरी दिखाती हैं। तारांकन: ऑप्टिक तंत्रिका सिर; लाल तीरहेड्स: रेटिना रक्त वाहिका; सफेद तीर: घुस सुई टिप; सफेद तीर: ग्राफ्टेड रेटिना निलंबन या शीट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: सबरेटिनल स्पेस में रेटिना ग्राफ्ट की सफल डिलीवरी और विवो में अस्तित्व। (ए) प्रतिनिधि एसडी-ओसीटी छवियों ने क्रमशः दो व्यक्तिगत आरडी 1 / एनएस चूहों में प्रत्यारोपित रेटिना शीट और सेल निलंबन के सबरेटिनल वितरण को दिखाया। गैर-प्रत्यारोपित आरडी 1 / एनएस चूहों को नियंत्रण के रूप में एकत्र किया गया था। ब्याज का क्षेत्र (आरओआई) अवरक्त (आईआर) फंडस छवियों पर पीले-बिंदीदार बक्से द्वारा इंगित किया गया है। आंतरिक रेटिना को रेटिना गैंग्लियन सेल लेयर (RGC), इनर प्लेक्सीफॉर्म लेयर (IPL), और इनर न्यूक्लियर लेयर (INL) के लैमिना के रूप में नामित किया गया है। (बी) एक प्रत्यारोपित आरडी 1 / एनएस माउस की प्रतिनिधि अवरक्त (आईआर) छवि ने पतला पुतली के माध्यम से कोई मोतियाबिंद नहीं दिखाया। (सी) प्रत्यारोपित और गैर-प्रत्यारोपित आरडी 1 / एनएस आंखों की प्रतिनिधि बहुरंगा प्रतिबिंब (एमआर) छवियां। प्रत्यारोपित आंखों ने रक्तस्राव सहित कोई स्पष्ट सर्जिकल जटिलताओं को प्रस्तुत नहीं किया। (डी) इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) प्रत्यारोपित- (शीट और निलंबन) और गैर-प्रत्यारोपित (नियंत्रण) आरडी 1 / एनएस चूहों का धुंधलापन। डेटा ने प्रत्यारोपण के दो महीने बाद फोटोरिसेप्टर (आरईसी), छड़ (आरएचओ::ईजीएफपी), एल/एम शंकु (ओपीएन 1 एलडब्ल्यू: ईजीएफपी), और एस-शंकु (एस-ऑप्सिन) के विशिष्ट मार्करों को व्यक्त करते हुए कई ग्राफ्टेड फोटोरिसेप्टर दिखाए। प्राप्तकर्ता रेटिना लैमिना की पहचान डीएपीआई धुंधला (नीला) द्वारा की गई थी। ईजीएफपी रिपोर्टर (ग्रीन) द्वारा रेटिना ग्राफ्ट की पहचान की गई थी। गैर-प्रत्यारोपित चूहों रेटिना ने विरल अवशिष्ट शंकु फोटोरिसेप्टर (आरईसी +) के साथ गंभीर ओएनएल अध: पतन दिखाया। गैर-प्रत्यारोपित Rd1/NS रेटिना में कोई EGFP सिग्नल नहीं पाया गया। आवर्धित चित्र सही दो पैनलों पर प्रस्तुत किए गए थे। संक्षिप्ताक्षर: आरजीसी: रेटिना गैंग्लियन सेल परत; INL: आंतरिक परमाणु परत। ओएनएल: बाहरी परमाणु परत। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
चूहों में सबरेटिनल प्रत्यारोपण माउस आंखों के छोटे आकार के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। इस अध्ययन में, हमने माउस प्राप्तकर्ताओं में सबरेटिनल प्रत्यारोपण के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मंच विकसित किया। मंच दाता व्यवहार्यता संरक्षण, सफल सबरेटिनल डिलीवरी में निरंतरता की अनुमति देता है, और कम जटिलता दर सुनिश्चित करता है।
यहां दर्शाई गई सबरेटिनल ट्रांसप्लांटेशन तकनीक ट्रांस-स्क्लरल मार्ग के आधार पर विकसित की गई थी, जहां इंजेक्शन सुई आईवॉल की बाहरी परतों (श्वेतपटल-कोरॉइड-आरपीई कॉम्प्लेक्स) में प्रवेश करती है। ट्रांस-कॉर्नियल19,20 और ट्रांस-विट्रियस21,26,27 दृष्टिकोण की तुलना में, ट्रांस-स्क्लरल दृष्टिकोण सीधे पूर्वकाल खंड संरचनाओं और तंत्रिका रेटिना में प्रवेश किए बिना सबरेटिनल स्पेस में प्रवेश करता है, इस प्रकार एक हानिरहित प्रत्यारोपण को सक्षम करता है और दाता सेल भाटा के जोखिम को कम करता है मर्मज्ञ छेद के माध्यम से। ट्रांस-स्क्लरल दृष्टिकोण की एक चुनौती यह सुनिश्चित करना है कि टर्मिनल डिलीवरी साइट पर पहुंचने से पहले सुई टिप सबरेटिनल स्पेस के साथ फैलती है, जबकि आसन्न आरपीई और रंजित परतों की संभावित गड़बड़ी से बचा जाता है। प्रत्यक्ष दृश्य मार्गदर्शन के बिना पारंपरिक ट्रांस-स्क्लरल दृष्टिकोण28,29 के माध्यम से इन लक्ष्यों को प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है। इस अध्ययन में, हम माउस मॉडल में subretinal प्रत्यारोपण की सुविधा के लिए एक शल्य चिकित्सा खुर्दबीन और रेटिना के बाहरी रोशनी का उपयोग कर एक transpupillary दृष्टि निर्देशित मंच विकसित. प्लेटफ़ॉर्म ऑपरेटर को सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत प्राप्तकर्ता फंडस के वास्तविक समय के दृश्य प्रदान करके सर्जिकल प्रक्रिया और प्राप्तकर्ताओं की रेटिना की स्थिति को ट्रैक करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, श्वेतपटल-रंजित-आरपीई परिसर के सफल प्रवेश को ट्रांसप्यूपिलरी विज़ुअलाइज़ेशन के माध्यम से सुई टिप के अपेक्षाकृत उज्ज्वल प्रतिबिंब द्वारा मान्य किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, जब ट्रांसप्यूपिलरी विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा निर्देशित किया जाता है, तो ऑपरेटर प्राप्तकर्ता रेटिना (जैसे, रेटिना वाहिकाओं और ऑप्टिक तंत्रिका सिर) में सुई और शारीरिक संरचनाओं के बीच सापेक्ष स्थिति के अनुसार कोण और इंजेक्शन की गहराई को सटीक रूप से संशोधित कर सकता है। इसके अलावा, इस तकनीक का उपयोग करने वाली सामग्रियों का सटीक प्रशासन आरपीई, कोरॉइड आघात और अन्य सर्जिकल जटिलताओं को कम कर सकता है। दरअसल, हमने पाया कि ट्रांसप्यूपिलरी विज़ुअलाइज़ेशन की मदद से रेटिना रक्त वाहिकाओं के करीब निकटता में युद्धाभ्यास से बचकर रक्तस्राव को कम किया जा सकता है।
दाता कोशिकाओं के भाटा शल्य चिकित्सा विफलता इंजेक्शन29,30 के बाद का एक प्रमुख कारण है. दाता सेल भाटा को बढ़ावा देने में कई कारक शामिल हैं। इंजेक्शन दाता सेल मिश्रण के कारण प्राप्तकर्ता आंखों का उच्च इंट्राओकुलर दबाव (आईओपी) एक महत्वपूर्ण कारक है जो आंखों से कोशिकाओं के भाटा को बढ़ावा देता है। हमारा प्रोटोकॉल सर्जरी की शुरुआत में पूर्वकाल कक्ष प्रवेश द्वारा प्राप्तकर्ताओं के आईओपी को कम करता है और आईओपी को कांच की गुहा से कांच की सुई को बाहर निकालने से पहले जलीय द्रव निकास द्वारा अनायास कम करने में सक्षम बनाता है। एक दूसरा कारक प्राप्तकर्ताओं की आंखों में बिना सील की गई इंजेक्शन सुरंग है। इंजेक्शन सुरंग के माध्यम से ग्राफ्ट भाटा को वापस रोकने के लिए, हम सुई को बाहर निकालते समय बाहरी सुरंग खोलने के किनारों को पकड़ने के लिए आईवॉल और दांतेदार सूक्ष्म संदंश को भेदते समय एक स्व-सीलिंग सुरंग बनाने के लिए एक छोटे आकार के माइक्रो-इंजेक्शन सुई (34G) का उपयोग करते हैं। पारंपरिक प्रत्यारोपण में, रिफ्लक्स किए गए ग्राफ्ट का शायद ही पता लगाया जाता है क्योंकि वे तेजी से हो सकते हैं या जल्दी से विलुप्त हो सकते हैं। सोडियम हाइलूरोनेट, कवरस्लिप के आवेदन पर, लगभग हमेशा स्क्लेरोटॉमी साइट सहित अधिकांश लिम्बस और श्वेतपटल को कवर करने के लिए कॉर्निया से स्लाइड करता है। सेल इंजेक्शन के बाद, स्क्लेरोटॉमी साइट पर सोडियम हाइलूरोनेट रिफ्लक्स सामग्री के थोक प्रवाह को धीमा करने में मदद कर सकता है, यदि कोई हो, और सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत उन्हें नेत्रहीन रूप से पता लगाने योग्य बनाने में मदद करता है। इसके अलावा, भाटा की अनुपस्थिति को सेल निलंबन के लिए सबरेटिनल ब्लीब की स्थिरता और हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके रेटिना शीट के इंट्राओकुलर स्थान का पता लगाकर भी सत्यापित किया जा सकता है, जो प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी हो सकता है जहां ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (ओसीटी) अनुपलब्ध है।
जबकि प्रत्यारोपित रेटिना शीट्स में पर्याप्त संख्या में फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं बच गईं, कोई स्पष्ट सेलुलर अभिविन्यास, या शीट अभिविन्यास का पता नहीं लगाया जा सका। हालांकि बड़े जानवरों के लिए 3 डी रेटिना चादरें की डिलीवरी 26,31,32 स्थापित किया गया है, चूहों में subretinal अंतरिक्ष, intraoperative रेटिना इमेजिंग क्षमता की कमी के साथ मिलकर, यह बहुत चुनौतीपूर्ण शीट अभिविन्यास intraoperatively के रूप में अच्छी तरह से के रूप में तत्काल पश्चात अवधि में सुनिश्चित करने के लिए बनाता है जिसके दौरान प्रत्यारोपित कोशिकाओं या चादरें अस्थिर हो सकता है के रूप में माउस एम्बुलेशन regain
हम माउस प्राप्तकर्ताओं में subretinal प्रत्यारोपण के लिए प्रत्यक्ष transpupillary दृष्टि मार्गदर्शन के साथ एक ट्रांस स्क्लरल शल्य चिकित्सा मंच का वर्णन. यह मंच इंजेक्शन की उच्च सटीकता और सर्जिकल जटिलताओं की कम दर को सक्षम बनाता है। यह मंच कोशिकाओं की ज्ञात खुराक की सटीक डिलीवरी को सक्षम बनाता है, सीखना अपेक्षाकृत आसान है, और जीन थेरेपी सहित विभिन्न प्रकार के चिकित्सीय एजेंटों के लिए इंट्रा-रेटिनल या इंट्राविट्रियल इंजेक्शन के अलावा सबरेटिनल डिलीवरी की सुविधा प्रदान करता है।
Disclosures
एमएसएस रिवीजन थेरेप्यूटिक्स, जॉनसन एंड जॉनसन, थर्ड रॉक वेंचर्स, बायर हेल्थकेयर, नोवार्टिस फार्मास्यूटिकल्स, डब्ल्यूएल गोर एंड एसोसिएट्स, डियरफील्ड, ट्रिनिटी पार्टनर्स, काला फार्मास्यूटिकल्स और एक्यूसेला का सशुल्क सलाहकार है/था। एमएसएस को बायर से प्रायोजित अनुसंधान सहायता प्राप्त होती है। इन व्यवस्थाओं की समीक्षा की गई है और जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय द्वारा अपनी हितों के टकराव की नीतियों के अनुसार अनुमोदित किया गया है। केवीएल को कोलोराडो विश्वविद्यालय में पेटेंट आवेदनों पर आविष्कारक के रूप में नामित किया गया है। एमएसएस और वाईवीएल को जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय में पेटेंट आवेदनों पर आविष्कारक के रूप में नामित किया गया है।
Acknowledgments
इस काम को निम्नलिखित वित्त पोषण द्वारा वित्त पोषित किया गया था: एनईआई R01EY033103 (एमएसएस), फाउंडेशन फाइटिंग ब्लाइंडनेस (एमएसएस), शुल्स्की फाउंडेशन (एमएसएस), जोसेफ अल्बर्ट हेकिमियन फंड (एमएसएस), जूलियट आरपी विजन फाउंडेशन (वाईवीएल), अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान (जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय में विल्मर आई इंस्टीट्यूट और बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में कुलेन आई इंस्टीट्यूट को अप्रतिबंधित अनुदान)। मालिया एडवर्ड्स (जॉन्स हॉपकिन्स यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन) को माइक्रोस्कोप पर प्रशिक्षण प्रदान करने के लिए धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears | CareAll | P31447-04 | |
| Coverslips (5mm in diameter) | Deckglaser | N/A | |
| Goat anti-GFP (FITC) | Abcam | Ab6662 | |
| Goat-anti-rabbit Cy3 | Invitrogen | A10520 | |
| Insulin syringe (30G) | Easy Touch | 08496-3015-11 | |
| Ketamine | VETone Zetamine | AH2017J | |
| Live Dead Viability Kit | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| Micro scissor | Harvard Apparatus | 72-8503 | |
| Micro smooth forceps | ASICO | AE-4360 | |
| Micro toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Microinjection needle (26G) | Hamilton | 7804-03 | |
| Microinjection needle (34G) | Hamilton | 207434 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Petri-dish (35 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB012920 | |
| Povidone-iodine (10%) | Betadine Solution | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride (0.5%) | Keeler | AX0500 | |
| Rabbit anti-recoverin | Millipore | Ab5585 | |
| Rabbit anti-S-opsin | Millipore | Ab5407 | |
| Sodium hyaluronate | Johnson & Johnson Vision | 10-2400-11 | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 2PC | |
| Sterile needle (25G) | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical materials/reagents | |||
| Tropicamide ophthalmic solution | Henry Schein | 112-7192 | |
| Xylazine | AnaSed Injection | N/A |
References
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Sci Transl Med. 10 (435), (2018).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Sci Transl Med. 11 (475), (2019).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).
- Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).
- Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
- Klassen, H., et al. Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients. Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).
- Das, T., et al. The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study. Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).
- Humayun, M. S., et al.
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209 (2017).
- Liu, Y. V., et al. Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line. Exp Eye Res. 210, 108715 (2021).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).
- Ortin-Martinez, A., et al. Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material. EMBO J. 40 (22), 107264 (2021).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Singh, M. S., et al. Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion. Nat Commun. 7, 13537 (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).
- Fang, Y., et al. Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).
- Liu, Y. V., et al. Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation. Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5 (2020).
- Liu, Y. V., et al. Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin. Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).
- Park, S., et al. Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies. Ann Transl Med. 9 (15), 1271 (2021).
- Li, X., et al. Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells. Sci Rep. 7 (1), 6951 (2017).
- Chao, J. R., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate. Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4 (2017).
- Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).
- Zhao, C., et al. Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J Vis Exp. (126), e55220 (2017).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), e4286 (2012).
- Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).
- Luo, Z., et al. Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors. Stem Cells Int. 2018, 9437041 (2018).
- Luo, Z., et al. Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates. Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).
