Summary
Denne protokol præsenterer en transpupillær visionsstyret trans-scleral tilgang til sikkert og præcist at levere subretinale cellulære transplantater med en lav grad af kirurgiske komplikationer hos musemodtagere med eller uden retinal degeneration.
Abstract
Transplantation af fotoreceptorceller og retinale pigmentepitelceller (RPE) giver en potentiel terapi for retinale degenerationssygdomme. Subretinal transplantation af terapeutiske donorceller til musemodtagere er udfordrende på grund af den begrænsede kirurgiske plads, der tillades af det lille volumen af museøjet. Vi udviklede en trans-scleral kirurgisk transplantationsplatform med direkte transpupillær vision vejledning for at lette subretinal levering af eksogene celler hos musemodtagere. Platformen blev testet ved hjælp af retinale cellesuspensioner og tredimensionelle retinale plader indsamlet fra stangrige Rho:: EGFP-mus og keglerige OPN1LW-EGFP; NRL-/- mus, henholdsvis. Levende/død analyse viste lav celledødelighed for begge former for donorceller. Retinale transplantater blev med succes leveret ind i det subretinale rum i en musemodel af retinal degeneration, Rd1 / NS, med minimale kirurgiske komplikationer som påvist ved multimodal konfokal scanning laser oftalmoskop (cSLO) billeddannelse. To måneder efter transplantation viste histologisk farvning tegn på avanceret modning af retinale transplantater i 'voksne' stænger og kegler (ved henholdsvis robust Rho::EGFP, S-opsin og OPN1LW:EGFP-ekspression) i det subretinale rum. Her leverer vi en kirurgisk platform, der kan muliggøre meget nøjagtig subretinal levering med en lav grad af komplikationer hos musemodtagere. Denne teknik giver præcision og relativ let erhvervelse af færdigheder. Desuden kan teknikken ikke kun anvendes til undersøgelser af subretinal celletransplantation, men også til andre intraokulære terapeutiske undersøgelser, herunder genterapier.
Introduction
Transplantation af fotoreceptor og retinale pigmenterede epitelceller (RPE) giver potentiel terapi for retinale degenerative sygdomme såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD), Stargardt sygdom og retinitis pigmentosa (RP) 1,2,3,4,5,6,7 . For at genopbygge eller erstatte de syge fotoreceptorer og RPE-celler i degenereret nethinden er det subretinale rum særligt velegnet som transplantationsmål i betragtning af den laminære anatomi af værtsfotoreceptorer og RPE-celler. Mens kirurgiske procedurer for subretinal transplantation af RPE-celler er veletablerede hos store dyr 8,9,10 og kliniske forsøg11,12,13, omfatter udfordringer for fotoreceptortransplantationsforskning manglen på transgene store dyremodeller og den begrænsede forståelse af dybtgående synaptogenesemekanismer involveret i neuronal transplantation, blandt andre bekymringer. Genetisk modificerede murinmodeller med forskellige typer retinale degenerationsmutanter giver nyttige værktøjer til at studere molekylære mekanismer i forbindelse med transplantation og styre udviklingen af effektive celleerstatningsterapier på det prækliniske stadium 14,15,16,17,18.
I modsætning til det relativt store øje og den lille krystallinske linse hos store dyr (f.eks. Svin, abe) gør museøjnens lille størrelse og store krystallinske linse dem til vanskelige kirurgiske mål, især til subretinal transplantation, hvor fysiske pladsbegrænsninger og begrænset direkte visualisering er kerneudfordringerne.
Nuværende tilgange kan klassificeres i tre hovedtyper baseret på injektionsvejen. For det første, i tilfælde af den trans-hornhinde tilgang, føres nålen gennem hornhinden ind i glaslegemet og derefter ind i det subretinale rum19,20. Vellykket subretinal levering kan opnås ved hjælp af denne metode, men skaden på forreste segmentstrukturer (dvs. hornhinde, iris, linse) er en stor risiko, der alvorligt kan hæmme nedstrøms in vivo-analyse. For det andet, i tilfælde af den transglasagtige tilgang, kommer nålen ind i glaslegemet gennem pars plana og derefter ind i det subretinale rum21. Denne tilgang anvendes i vid udstrækning hos mennesker og store dyr. Der er dog en potentiel risiko for linseskader hos gnavere, da linsen optager et større relativt volumen af glaslegemet. Især kræver både transhornhinde og transglasagtige protokoller penetration af den neurale nethinden for at nå frem til det subretinale rum, hvilket forårsager skade på værtsnethinden og øger risikoen for donorcelle tilbagesvaling gennem penetrationshullet. For det tredje, i tilfælde af den trans-scleral tilgang22,23, trænger nålen gennem scleral-choroid-RPE-komplekset og kommer direkte ind i det subretinale rum. Denne tilgang reducerer det potentielle traume af forreste segmentstrukturer og glaslegemet. Uden direkte visualisering af værtsfundus opdages kirurgiske fejl forårsaget af transretinale punkteringer, RPE-løsrivelse og choroidblødning almindeligvis.
Her udviklede vi en trans-scleral kirurgisk platform med direkte transpupillær vision vejledning til subretinal transplantation hos musemodtagere. Validering af levedygtigheden af donor retinale ark og cellesuspensioner før transplantation blev udført. Vellykket levering af donorcellerne i det subretinale rum i en retina degeneration musemodel blev bekræftet. Kun sjældne kirurgiske komplikationer blev påvist. Derudover overlevede transplanterede fotoreceptorer i retinale transplantater og viste tegn på avanceret modning i "voksne" stænger og kegler to måneder efter transplantation.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, revideret 1978) og ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Alle procedurer blev godkendt af Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee (godkendelse M021M459).
1. Dyr
- Brug Rho:: EGFP-mus (i alderen P3-P6) som donorer af retinale cellesuspensioner.
BEMÆRK: Denne stamme var en venlig gave fra Dr. T. Wensel, Baylor College of Medicine. - Brug OPN1LW-EGFP/NRL-/- mus14 (P3 år) som donorer af retinale lagner.
- Brug voksne retinal degeneration Rd1 / NS-mus med immundefekt (begge køn) som modtagere.
- Opstald alle mus i bure under en 12:12 timers lys-mørk cyklus med adgang til vand og mad efter behov.
2. Saml neurale nethinden (figur 1)
BEMÆRK: Alle følgende trin blev udført under sterile forhold. Leverandøroplysninger om forskningsværktøjer og produkter findes i materialetabellen.
- Forberedelse af donormus: Aflive donormus med en overdosis kuldioxid og bekræft eutanasi med cervikal dislokation.
- Isoler mus øjenkugler. For at gøre det skal du følge nedenstående trin.
- Åbn forsigtigt hvalpenes øjenlåg ved hjælp af mikrosaks for at udsætte øjeæblet.
- Brug glatte tang til at få fat i synsnerven og træk øjeæblet ud med et par tang.
- Isoler neurale nethinden
BEMÆRK: Dette trin udføres under et dissektionsmikroskop.- Skær et hul i midten af hornhinden ved hjælp af en 25 G steril nål.
- Skær hornhinden gennem hullet i halve og forstør snittet til sclera og RPE, fjern derefter sclera og RPE.
- Brug mikrotandede tang til forsigtigt at fjerne linsen og glaslegemet til at isolere neuralhinden.
- Fortsæt med punkt 3 for at forberede donor retinal suspension eller sektion 4 for at forberede donor retinal ark, efter behov.
3. Forbered donor retinal suspension (figur 1)
- Inkuber neuralnethinden i Papain-opløsning ved 37 °C i 20-30 minutter, indtil der ikke opdages celleklumper.
BEMÆRK: Rør forsigtigt celleblandingen 15x hvert 10. minut. - Følg producentens anvisninger i Papain Dissociation Kit for at indsamle enkeltceller.
4. Forbered donornethindeark (figur 1)
BEMÆRK: Dette trin følger afsnit 2 og udføres under et dissektionsmikroskop.
- Kom den isolerede neurale nethindebop i en 35 mm petriskål med forkølet steril PBS.
- Brug mikrosaks til at skære den neurale nethindekop i flere retinale ark (ca. 1 mm x 2 mm).
5. Forbered modtagermus
- Bedøv modtagermus med intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg/kg legemsvægt) og xylazinhydrochlorid (20 mg/kg legemsvægt).
- Bekræft anæstesiens kirurgiske plan ved at sikre tab af blink- og smertereflekser, regelmæssig vejrtrækning og åndedræt.
- Vurder bedøvelsesdybden ved manglende respons på tilbagetrækning af haleklemme eller pedalreflekser.
- Kontroller altid bedøvelsesdybden under den operative procedure og juster bedøvelsesdybden, hvis dyret reagerer på smerte. Hold musene på det forvarmede operationsbord for at forhindre hypotermi.
- Spile recipientpupiller med 1% (vægt/vol) tropicamid øjendråber 5 min før operationen. En veludvidet elev kan lette transpupillær visualisering under operationsmikroskopet.
- Desinficer musens operative øje og omgivende okulært væv med povidon-jod, vask med steriliseret PBS.
- Påfør 0,5% Proparacainhydrochlorid på museøjet for analgesi.
6. Subretinal transplantation af retinale transplantater (figur 2)
BEMÆRK: Alle følgende trin blev udført under aseptiske forhold. Kirurgiske værktøjer blev autoklaveret (brug instrumentbakker til at beskytte værktøjsspidserne og tag stemplet ud af mikrosprøjterne for at forhindre, at de sidder fast i lumen). Leverandøroplysninger om forskningsværktøjer og produkter findes i materialetabellen.
- Forreste kammerparacentese: Penetrer perifer hornhinde ind i det forreste kammer med en insulinnål for at tillade vandig humor passivt at komme ud for at forhindre det intraokulære tryk (IOP) pigge under transplantationen.
BEMÆRK: En vellykket paracentese indikeres ved udstrømning af vandig humor gennem hornhindehullet. - Sæt en dråbe natriumhyaluronat og et glasdæksel (5 mm diameter) oven på hornhinden for at muliggøre transpupillær visualisering af fundus under det kirurgiske omfang.
- Brug tandtang til at udsætte injektionsstedet (1 mm post-hornhindelimbus) ved at trykke enten den overlegne eller ringere øjenvæg, som krævet af eksperimentet, mod midten af transpupilærsyn.
- Brug en mikroinjektionsnål til vinkelret at trænge ind i scleraen.
- Drej forsigtigt nåleretningen tangentielt for at tillade fuldstændig indtrængning af sclera-choroid-RPE-komplekset i det subretinale rum.
- Indsæt nålen tangentielt for at få adgang til det terminale injektionssted.
BEMÆRK: Kontroller den fuldstændige placering af nålens skråning ved hjælp af transpupillær synsvejledning. Brug de overfladiske retinale kar som en anatomisk reference til nøjagtig nålepositionering i det subretinale rum. - Injicer retinale transplantater
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af små bobler, der er forudindlæst i sprøjten, kan lette valideringen af den nøjagtige subretinale positionering af donorceller. Forhøjet IOP som følge af subretinal injektion øger risikoen for donorcellerefluks.- Hvis hornhinden bliver uklar24,25, en indikator for høj IOP, skal nålen holdes i det subretinale rum i mindst 3 minutter, indtil hornhinden rydder, en indikator for, at IOP er reduceret tilstrækkeligt.
BEMÆRK: I sjældne tilfælde kan IOP tage længere tid at normalisere, og det anbefales at holde nålen på plads, indtil hornhindens klarhed er genoprettet, selvom dette ville tage 8-10 minutter. Overhold under et kirurgisk mikroskop for at forhindre skade på retinale strukturer.
- Hvis hornhinden bliver uklar24,25, en indikator for høj IOP, skal nålen holdes i det subretinale rum i mindst 3 minutter, indtil hornhinden rydder, en indikator for, at IOP er reduceret tilstrækkeligt.
- Tag fat i kanten af injektionshullet med mikrotandede pincet, og træk hurtigt nålen ud.
BEMÆRK: Kriterierne for vellykket subretinal levering af en retinal cellesuspension og ark er henholdsvis en konstant bleb og et synligt hvidt ark i det subretinale rum. - Rengør det kirurgiske område af øjet med kunstige tårer og påfør salve om nødvendigt.
- Administration efter operationen
- Anbring transplanterede mus i et forvarmet (37 °C) rent restitutionsbur, og overvåg omhyggeligt for nød.
- Påfør en dråbe topisk 0,5% Proparacainhydrochlorid på det kirurgiske øje 2-3 gange, hvis der opstår nød.
- Returner mus til husburet, når musene er helt opmærksomme og mobile. Placer et lille antal madpiller og en gelkop i buret, hvis musene har problemer med at nå madbeholderen.
BEMÆRK: Hold øjenoverfladen fugtig, indtil anæstesi slides af for at forhindre dannelse af grå stær.
7. Multimodal konfokal scanning laser oftalmoskopi (cSLO) billeddannelse
- To måneder efter transplantation bedøves modtager Rd1 / NS-mus (n = 5) ved intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg / kg legemsvægt) og xylazinhydrochlorid (20 mg / kg legemsvægt) til billeddannelse.
- Spile pupiller med 1% (vægt / vol) tropicamid øjendråber.
- Udfør standard 55° multimodal billeddannelse ved hjælp af det konfokale scanningslaseroftalmoskop cSLO-system22.
- Hent MR- og SD-OCT-billeder ved hjælp af 30 billeder med ART-gennemsnit.
8. Histologisk farvning
- Forbered frosne dias af transplanterede Rd1 / NS-musøjne som tidligere rapporteret 14.
- Bloker og træng ind i de frosne dias af transplanteret nethinden ved hjælp af en blanding af 5% gedeserum og 1% Triton X100 i PBS.
- Prøver med primære antistoffer inkuberes natten over ved 4 °C og skylles i PBS (5 min, 3x). De primære antistoffer omfatter gedeanti-GFP-FITC (1:200), kanin-anti-recoverin (1:1000) og kanin-anti-S-opsin (1:500).
- Inkuber prøverne med sekundært antistof (ged anti-kanin Cy3, 1:500) og modfarvet med DAPI.
BEMÆRK: Leverandørerne af primære og sekundære antistoffer er anført i materialetabellen.
Representative Results
Retinale transplantater leveres med succes ind i det subretinale rum og overlevede in vivo.
Ydeevnen af vores subretinale transplantationsplatform blev vurderet hos Rd1/NS-modtagermus i alderen 6-8 uger, da deres resterende nethinden blev alvorligt fortyndet på grund af den næsten komplette degeneration af det ydre kernelag (ONL). I betragtning af nethindens skrøbelighed, manglen på keglefotoreceptorer og den relativt dårlige levedygtighed af celler i suspension sammenlignet med arkdonorer, keglerige mus (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14 blev anvendt som kilder til donorretinale plader og stavrige mus (Rho::EGFP) som donor for cellesuspensioner. Keglerige retinale ark og stavrige cellesuspensioner blev med succes leveret ind i det subretinale rum hos alle modtagermus ved hjælp af vores kirurgiske platform, som bekræftet af det subretinale bleb og hvide ark set ved hjælp af transpupillær visualisering umiddelbart efter injektion. To måneder efter transplantation blev multimodal cSLO-billeddannelse udført for at spore tilstanden af retinale transplantater in vivo. Tværsnits-OCT-scanning viste, at retinale transplantater overlevede i det subretinale rum og rekonstituerede ONL i alle modtagermus (figur 3A). Infrarød billeddannelse påviste ingen åbenlys grå stær i alle transplanterede øjne (figur 3B). Andre kirurgiske komplikationer, herunder blødning, blev sjældent påvist i transplanteret nethinden (n = 1/10 øjne) ved flerfarvet reflektionsbilleddannelse to måneder efter transplantation (figur 3C). Vi udførte histologisk farvning for yderligere at vurdere overlevelsen og omfanget af modning af fotoreceptorer i retinale transplantater. Der blev observeret rigelige keglefotoreceptorer, der udtrykte OPN1LW:EGFP og S-opsin i transplanterede nethindeplader. Ligeledes viste transplanterede retinale cellesuspensioner en stor andel af Rec+ fotoreceptorer in vivo, herunder adskillige Rho::EGFP+ stænger (figur 3D). De ikke-transplanterede kontrolmus viste alvorlig ONL-degeneration med sparsomme resterende keglefotoreceptorer (Rec+). Der blev ikke påvist EGFP-signal i ikke-transplanteret Rd1/NS-nethinden (figur 3D).
Figur 1: Skematisk oversigt over indsamling af donorretinale ark- og cellesuspensioner. Skemaer, der viser de vigtigste trin i indsamling af retinale cellesuspensioner og lagner fra donor Rho:: EGFP-mus . Bright-field og fluorescerende billeddannelse viste repræsentative billeder af dissocierede celler og et dissekeret ark isoleret fra Rho::EGFP mus. Gul stiplet linje: snitmargen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Procedurer for subretinal transplantation af retinale plader og cellesuspension i Rd1 / NS-mus. (A) Skematiske billeder af tilberedning af modtagermus. B) Vigtige kirurgiske indgreb og tilsvarende diagrammer, der viser subretinal transplantation af retinale cellesuspensioner og -ark. Kirurgiske trin omfatter: 1. trænge ind i det forreste kammer; 2. Slip natriumhyaluronat på hornhinden, og monter derefter dækslet oven på natriumhyaluronatet for at lette transpupillær visualisering; 3. Penetrer ydre lag af øjenvæggen (sclera-choroid-RPE-kompleks). Nålens gennemtrængningsvinkler er øverst til højre på illustrationen; 4. Indsæt kanylen; 5. Injicer transplantater. Repræsentative billeder viser den vellykkede levering af retinale cellesuspensioner og ark i henholdsvis to individuelle modtagere. Stjerne: optisk nervehoved; Røde pilespidser: retinal blodkar; Hvid pilespids: gennemtrængt nålespids; Hvide pile: podede retinale suspensioner eller ark. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vellykket levering af retinale transplantater i det subretinale rum og overlevelse in vivo. (A) Repræsentative SD-OCT-billeder viste den subretinale fordeling af transplanterede retinale plader og cellesuspensioner i henholdsvis to individuelle Rd1/NS-mus . Ikke-transplanterede Rd1/NS-mus blev indsamlet som kontrol. Region of Interest (ROI) er angivet med gule stiplede bokse på infrarøde (IR) fundusbilleder. Indre nethinden er udpeget som laminae af retinal ganglion cellelag (RGC), indre plexiform lag (IPL) og indre nukleare lag (INL). (B) Repræsentativt infrarødt (IR) billede af en transplanteret Rd1/NS-mus viste ingen grå stær gennem den udvidede pupil. (C) Repræsentative flerfarvede reflektansbilleder (MR) af transplanterede og ikke-transplanterede Rd1/NS-øjne . De transplanterede øjne præsenterede ingen åbenlyse kirurgiske komplikationer, herunder blødning. (D) Immunohistokemi (IHC) farvning af transplanterede (ark og suspension) og ikke-transplanterede (kontrol) Rd1/NS-mus . Dataene viste adskillige podede fotoreceptorer, der udtrykte specifikke markører for fotoreceptorer (Rec), stænger (Rho::EGFP), L / M-kegler (OPN1LW: EGFP) og S-kegler (S-opsin) to måneder efter transplantation. Modtager retinale laminae blev identificeret ved DAPI-farvning (blå). Retinale transplantater blev identificeret af EGFP reporter (grøn). De ikke-transplanterede mus nethinden viste alvorlig ONL-degeneration med sparsomme resterende keglefotoreceptorer (Rec+). Der blev ikke påvist EGFP-signal i ikke-transplanteret Rd1/ NS-nethinden. Forstørrede billeder blev præsenteret på de to højre paneler. Forkortelser: RGC: retinal ganglion cellelag; INL: indre kernelag. ONL: ydre kernelag. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Subretinal transplantation i mus er teknisk udfordrende på grund af den lille størrelse af museøjne. I dette studie udviklede vi en enkel og reproducerbar platform til subretinal transplantation hos musemodtagere. Platformen tillader konsistens i beskyttelse af donorlevedygtighed, vellykket subretinal levering og sikrer en lav komplikationsrate.
Den subretinale transplantationsteknik, der er afbildet her, blev udviklet baseret på den trans-sclerale rute, hvor injektionsnålen trænger ind i de ydre lag (sclera-choroid-RPE-kompleks) i øjenvæggen. Sammenlignet med den trans-hornhinde19,20 og trans-vitreous21,26,27 tilgang, kommer den trans-scleral tilgang direkte ind i det subretinale rum uden at trænge ind i de forreste segmentstrukturer og neurale nethinden, hvilket muliggør en harmløs transplantation og reducerer risikoen for donorcelle refluks gennem det gennemtrængende hul. En udfordring ved den trans-sclerale tilgang er at sikre, at nålespidsen formerer sig langs det subretinale rum, inden den ankommer til terminalleveringsstedet, samtidig med at man undgår potentiel forstyrrelse af de tilstødende RPE- og choroidlag. Det er udfordrende at nå disse mål gennem en traditionel trans-scleral tilgang28,29 uden direkte visuel vejledning. I denne undersøgelse udviklede vi en transpupillær visionsstyret platform ved hjælp af et kirurgisk mikroskop og ekstern belysning af nethinden for at lette subretinal transplantation i musemodeller. Platformen giver operatøren mulighed for at spore den kirurgiske proces og modtagernes retinale tilstand ved at give realtidsvisualisering af modtagerens fundus under det kirurgiske mikroskop. For eksempel kan vellykket penetration af sclera-choroid-RPE-komplekset simpelthen valideres ved en relativt lys refleksion af nålespidsen via transpupillær visualisering. Det er vigtigt, at operatøren, når den styres af transpupillær visualisering, nøjagtigt kan modulere vinklen og injektionsdybden i henhold til den relative position mellem nålen og anatomiske strukturer i modtagernethinden (f.eks. Nethindekar og optisk nervehoved). Desuden kan nøjagtig administration af materialer ved hjælp af denne teknik minimere RPE, choroidtraumer og andre kirurgiske komplikationer. Faktisk fandt vi, at blødninger kan minimeres ved at undgå manøvrer i nærheden af retinale blodkar ved hjælp af transpupillær visualisering.
Refluks af donorceller er en væsentlig årsag til kirurgisk svigt efter injektion29,30. Der er flere faktorer involveret i at fremme donorcelle refluks. Det høje intraokulære tryk (IOP) i modtagerøjnene forårsaget af de injicerede donorcelleblandinger er en vigtig faktor, der fremmer tilbagesvaling af celler ud af øjet. Vores protokol reducerer modtagernes IOP ved indtrængning i det forreste kammer i begyndelsen af operationen og gør det muligt for IOP at sænke spontant ved vandig væskeudgang, før glaslegemet trækkes ud af glaslegemet. En anden faktor er den uforseglede injektionstunnel i modtagernes øjne. For at forhindre transplantattilbagesvaling tilbage gennem injektionstunnelen bruger vi en lille mikroinjektionsnål (34G) til at skabe en selvforseglende tunnel, når den trænger ind i øjenvæggen og tandede mikropincet til at holde kanterne af den udvendige tunnelåbning, når nålen trækkes ud. Ved konventionel transplantation opdages tilbagesvalingstransplantater næppe, fordi de kan forekomme hurtigt eller forsvinde hurtigt. Natriumhyaluronatet, ved påføring af dæksedlen, glider næsten altid af hornhinden for at dække det meste af limbus og sclera, herunder sclerotomistedet. Efter celleinjektion kan natriumhyaluronatet på sklerotomistedet bidrage til at bremse bulkstrømmen af tilbagesvalet indhold, hvis nogen, og bidrage til at gøre dem visuelt detekterbare under det kirurgiske mikroskop. Desuden kan fraværet af tilbagesvaling også verificeres ved at spore konstantiteten af den subretinale bleb for cellesuspensioner og den intraokulære placering af retinaladen ved hjælp af vores protokol, hvilket kan være nyttigt for laboratorier, hvor optisk kohærenstomografi (OCT) ikke er tilgængelig.
Mens et betydeligt antal fotoreceptorceller overlevede i de transplanterede retinale ark, kunne der ikke påvises nogen mærkbar cellulær orientering eller arkorientering. Selvom levering af 3D retinale ark til store dyr er blevet etableret 26,31,32, gør det subretinale rum hos mus kombineret med manglen på intraoperativ retinal billeddannelseskapacitet det meget udfordrende at sikre vedligeholdelse af arkorientering intraoperativt såvel som i den umiddelbare postoperative periode, hvor de transplanterede celler eller ark kan blive ustabile, når musen genvinder ambulation.
Vi beskriver en trans-scleral kirurgisk platform med direkte transpupillær vision vejledning til den subretinale transplantation hos musemodtagere. Denne platform muliggør høj injektionsnøjagtighed og en lav grad af kirurgiske komplikationer. Denne platform muliggør præcis levering af kendte doser af celler, er relativt let at lære og letter subretinal levering ud over intraretinale eller intravitreale injektioner til forskellige typer terapeutiske midler, herunder genterapi.
Disclosures
MSS er/var betalt rådgiver for Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, W. L. Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals og Acucela. MSS modtager sponsoreret forskningsstøtte fra Bayer. Disse ordninger er blevet gennemgået og godkendt af Johns Hopkins University i overensstemmelse med dets interessekonfliktpolitikker. KVL er navngivet som opfindere på patentansøgninger ved University of Colorado. MSS og YVL er navngivet som opfindere på patentansøgninger ved Johns Hopkins University.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af følgende finansiering: NEI R01EY033103 (MSS), Foundation Fighting Blindness (MSS), Shulsky Foundation (MSS), Joseph Albert Hekimian Fund (MSS), Juliette RP Vision Foundation (YVL), Research to Prevent Blindness (ubegrænset tilskud til Wilmer Eye Institute ved Johns Hopkins University og Cullen Eye Institute ved Baylor College of Medicine). Vi takker Dr. Malia Edwards (Johns Hopkins University School of Medicine) for venligt at give træning på mikroskopet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears | CareAll | P31447-04 | |
| Coverslips (5mm in diameter) | Deckglaser | N/A | |
| Goat anti-GFP (FITC) | Abcam | Ab6662 | |
| Goat-anti-rabbit Cy3 | Invitrogen | A10520 | |
| Insulin syringe (30G) | Easy Touch | 08496-3015-11 | |
| Ketamine | VETone Zetamine | AH2017J | |
| Live Dead Viability Kit | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| Micro scissor | Harvard Apparatus | 72-8503 | |
| Micro smooth forceps | ASICO | AE-4360 | |
| Micro toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Microinjection needle (26G) | Hamilton | 7804-03 | |
| Microinjection needle (34G) | Hamilton | 207434 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Petri-dish (35 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB012920 | |
| Povidone-iodine (10%) | Betadine Solution | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride (0.5%) | Keeler | AX0500 | |
| Rabbit anti-recoverin | Millipore | Ab5585 | |
| Rabbit anti-S-opsin | Millipore | Ab5407 | |
| Sodium hyaluronate | Johnson & Johnson Vision | 10-2400-11 | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 2PC | |
| Sterile needle (25G) | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical materials/reagents | |||
| Tropicamide ophthalmic solution | Henry Schein | 112-7192 | |
| Xylazine | AnaSed Injection | N/A |
References
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Sci Transl Med. 10 (435), (2018).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Sci Transl Med. 11 (475), (2019).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).
- Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).
- Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
- Klassen, H., et al. Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients. Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).
- Das, T., et al. The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study. Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).
- Humayun, M. S., et al.
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209 (2017).
- Liu, Y. V., et al. Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line. Exp Eye Res. 210, 108715 (2021).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).
- Ortin-Martinez, A., et al. Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material. EMBO J. 40 (22), 107264 (2021).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Singh, M. S., et al. Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion. Nat Commun. 7, 13537 (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).
- Fang, Y., et al. Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).
- Liu, Y. V., et al. Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation. Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5 (2020).
- Liu, Y. V., et al. Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin. Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).
- Park, S., et al. Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies. Ann Transl Med. 9 (15), 1271 (2021).
- Li, X., et al. Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells. Sci Rep. 7 (1), 6951 (2017).
- Chao, J. R., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate. Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4 (2017).
- Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).
- Zhao, C., et al. Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J Vis Exp. (126), e55220 (2017).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), e4286 (2012).
- Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).
- Luo, Z., et al. Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors. Stem Cells Int. 2018, 9437041 (2018).
- Luo, Z., et al. Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates. Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).
