Summary
该协议提出了一种通过同时检测博来霉素处理的人外周淋巴细胞的间期核中的γH 2AX和53BP1病灶来评估DNA双链断裂的形成和修复的方法。
Abstract
双链断裂（DSB）是细胞核中可能发生的最严重的病变之一，如果不修复，它们可能导致严重的后果，包括癌症。因此，该细胞具有修复DSB的复杂机制，并且这些途径涉及组蛋白H2AX在Ser-139（即γH2AX）和p53结合蛋白1（53BP1）处磷酸化形式。由于这两种蛋白质都可以在DSB的位点形成病灶，因此鉴定这些标志物被认为是研究DSB及其修复动力学的合适方法。根据导致γH2AX和53BP1病灶形成的分子过程，研究它们在DSB附近的共定位可能更有用，以便建立一种替代方法，允许通过同时检测两个DNA损伤标记来量化DSB。因此，该协议旨在评估放射性模拟剂博来霉素通过在双重免疫荧光中存在γH 2AX和53BP1病灶诱导的人淋巴细胞中的基因组损伤。使用这种方法，我们还描绘了γH2AX和53BP1病灶数量随时间的变化，作为研究博来霉素诱导的DSB的修复动力学的初步尝试。
Introduction
DNA损伤由内源性物质持续诱导，例如细胞氧化代谢产生的ROS，或外源性，包括化学物质和物理1。在最有害的病变中，双链断裂（DSBs）在导致基因组不稳定方面起着重要作用，因为它们会导致染色体畸变，进而引发致癌过程。因此，细胞被赋予了复杂而有效的DSB修复机制2。
当DSB发生时，细胞触发DNA损伤反应（DDR），其中与MRE11 / RAD50 / NBS1复合物一起招募ATM或ATR激酶以激活减缓或停止细胞周期的其他蛋白质3。这些激酶的一个重要靶标是组蛋白H2AX，它在DSB的几个兆碱基（即γH2AX）内的Ser-139上磷酸化，从而允许募集几种修复因子，例如BRCA1和p53结合蛋白1（53BP1）3。之后，触发同源重组（HR），非同源末端连接（NHEJ）或单链退火（SSA）之间的一种途径来修复DSB4，5。因此，53BP1参与决定HR或NHEJ之间的选择，主要促进NHEJ的激活而不是HR6。此外，H2AX组蛋白和53BP1的磷酸化形式都可以在DSB的位点形成病灶。由于这些病灶持续到双链的完整性恢复，因此在时间间隔内评估γH2AX或53BP1病灶的出现/消失被认为是评估细胞系统中DSB发生和修复的有用方法6，7。然而，根据上述分子过程，由于γH2AX和53BP1病灶预计在DDR8，9期间在DSB附近共定位，因此在双重免疫荧光中同时检测这些标志物的存在是有用的。
因此，本手稿的目的是评估同时定量γH2AX和53BP1病灶的适用性，以评估放射性模拟剂博来霉素诱导的人外周淋巴细胞的基因组损伤。使用相同的方法，我们还尝试根据先前设置的实验程序10描绘博来霉素诱导的DSB的修复动力学。
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Protocol
该研究得到了比萨大学伦理委员会的批准，并获得了每个捐赠者的知情和签署同意。
1. γH2AX和53BP1病灶的形成
- 样品制备和诱变处理
- 通过静脉穿刺从含有肝素锂作为抗凝剂的采血管（例如真空管）中收集健康成年人的全血样本。
- 为了保证适当的血液样本保存，请在采样后24小时内开始该程序。
- 将 300 μL 样品加入含有 4.7 mL 完全培养基（0.5% 青霉素-链霉素、0.75% 植物血凝素、10% 先前灭活的 FBS、88.75% RPMI 1640）的管中。
- 然后加入硫酸博来霉素至终浓度为 5 μg/mL。
注意：硫酸博来霉素是一种诱变剂。避免皮肤接触和吸入。准备溶液并将样品添加到引擎盖下。 - 对于每个样品，设置阴性对照（无诱变剂）。
- 将管子置于37°C的恒温器中2小时。
- 固定
- 在室温下以540× g 离心样品5分钟。
- 吸出上清液并用涡旋重悬沉淀。
- 加入 5 mL 低渗溶液（2.87 g KCl 溶于 500 mL 去离子水中）和 400 μL 固定前溶液（5：3 乙酸：甲醇）以引起红细胞溶血。
- 在室温下以540× g 离心样品5分钟。
- 吸出上清液并将沉淀在室温下重悬于5mL甲醇中至少30分钟以固定细胞。
- 或者，将细胞储存在-20°C直至使用。
- 载玻片准备
- 在室温下以540× g 离心样品5分钟。
- 吸出上清液并将沉淀重悬于5mL的3：1甲醇：乙酸溶液中。再次重复这些步骤。
- 最后，在室温下再次以540× g 离心溶液5分钟。
- 再次吸出上清液，留下足够的溶液（0.5mL）以重悬沉淀，大力移液，将重悬的细胞沉淀滴在载玻片上，然后风干。将载玻片储存在4°C。
- 免疫荧光
注意：免疫荧光是一种免疫学方法，用于识别特定细胞靶标，使用结合靶标本身的一抗和结合一抗的荧光二抗，允许定位靶标11。在这种情况下，小鼠单克隆抗-53BP1（1：50）和兔多克隆抗γH2AX（1：50）用作一抗，而AlexaFluor568抗小鼠（1：400）和DyLight488抗兔（1：200）分别用作二抗。- 在 50 mL 的 1x PBS 中在耦合罐中洗涤载玻片 5 分钟（背靠背 16 张载玻片）。
- 然后将它们在封闭溶液（10 mL FBS、10 mL 10x PBS、80 mL 去离子水、300 μL Triton-X）中保持 30 分钟。
- 向每张载片中加入 10 μL 含有溶解在封闭溶液中的一抗的两种溶液中的一种。用石蜡带覆盖载玻片并在4°C孵育过夜。
- 孵育后，在1x PBS中进行三次洗涤5分钟。
- 向每张载片中加入 10 μL 含有溶解在封闭溶液中的二抗的两种溶液中的一种。用石蜡带覆盖载玻片，并在室温下孵育2小时。
- 在1x PBS中进行三次洗涤5分钟。
- 在组装前在盖玻片上加入 2.5 μL 带有 DAPI 的抗淬灭溶液，以复染细胞核。
注意：为了评估病灶动力学，该过程与1.1至1.4中所述相同，注意细胞收获和双重免疫荧光在博来霉素治疗后2小时后0小时进行，然后在去除诱变剂后4小时，6小时和24小时处理后。
2. 通过荧光显微镜进行分析
注意：“荧光显微镜”是指使用荧光生成图像的任何显微镜。用特定波长（或多个波长）的光照射样品，该光被荧光团吸收，使它们发出更长波长的光12。AlexaFluor568和DyLight 488分别吸收约568和488 nm的光，并发射603和520 nm的光。因此，它们分别使用TRITC或FITC滤光片可见为红色或绿色荧光。
- 在100倍浸没物镜下对每张载玻片中焦点的存在进行评分（图1）。
- 对每张载玻片 200 个细胞核进行评分，并计算每个细胞核中 γH2AX/53BP1 病灶的数量。
- 根据每个总核评分的平均病灶数来表达结果。这些包括γH2AX / 53BP1阳性（显示至少一个荧光信号）和阴性（未显示任何荧光信号）细胞核。
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Representative Results
通过荧光显微镜分析外周淋巴细胞获得的数据使我们能够评估三个主要方面：博来霉素治疗在增加γH2AX和53BP1病灶（以及DSB）数量方面的有效性，由于其诱变作用，两个病灶在DSB位点共定位的程度，以及γH2AX和53BP1病灶的时间过程，以描绘博来霉素诱导的DSB的修复动力学。正如预期的那样，在未处理和处理的细胞之间观察到γH2AX和53BP1病灶的频率非常高，从而证实了博来霉素诱导外周淋巴细胞中DSB的形成（图2）。
观察到两个标志物的病灶数量存在较大差异;特别是，γH2AX病灶比53BP1病灶多，因此表明共定位并不总是发生，并且可能取决于多种因素（图3）。
关于DSBs的修复动力学，首先，重要的是要强调如何在第一个选定的时间点（即2 h）之前开始实际的病灶修复，并且在不同的时间点，我们可以观察到新形成的病灶以及先前形成但尚未修复的病灶。
考虑到前面所说的，γH2AX和53BP1病灶随时间推移的时间过程显示出不同的行为，尽管它们有助于相同的功能。γH2AX病灶在处理后2h后增加，然后开始逐渐减少，但在治疗后24 h未达到对照值。在方差时，53BP1病灶的频率增加直到治疗后4小时，然后在6小时降低，并在处理后24小时恢复到最大值（图4）。
图 1：人外周淋巴细胞中γH2AX和53BP1的双重免疫荧光：（A）博来霉素治疗前没有γH2AX和53BP1病灶的细胞核，（B）和（C）由于博来霉素治疗而具有不同量的γH2AX和53BP1病灶的细胞核。请点击此处查看此图的大图。
图 2：两种 DSB 标志物的未处理和博来霉素处理的 （5 μg/mL） 淋巴细胞之间的比较。 误差线代表 SEM。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：γH2AX 和 53BP1 病灶的总量（自发和诱变剂诱导）之间的比较。 误差线代表 SEM。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：γH2AX 和 53BP1 病灶动力学。 0 小时、2 小时、4 小时、6 小时和 24 小时代表收获淋巴细胞的不同时间;误差线代表 SEM。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
γH2AX和53BP1病灶的免疫荧光分析是评估细胞系统间期核中基因组损伤的合适方法。该程序有几个关键点可以影响实验的结果，主要是用于固定和透化的试剂，抗体的类型及其稀释因子以及诱变剂的浓度。
维持蛋白质完整性至关重要，因为免疫荧光方法期望识别主要是蛋白质的抗原。在该协议中，甲醇用于固定淋巴细胞。此步骤特别重要，因为酒精通过置换水并导致可溶性蛋白质沉淀而起作用，而其他未固定的细胞成分可以通过在盐水缓冲溶液（例如PBS13）中洗涤来去除。
另一个关键通道是通过封闭溶液进行的透化，在这种情况下，它允许透化和封闭。通过将FBS添加到溶液中进行封闭：它结合样品中的蛋白质并防止抗体结合错误的靶标，因为FBS与抗体的特定靶标之间的键可能会由于抗体和靶标本身之间的高亲和力而断裂。透化可以使用多种溶剂进行，在这种情况下，使用非离子洗涤剂Triton X-100：它嵌入磷脂双层，溶解质膜，然后破坏它14。
由于选择有效的γH2AX和53BP1抗体对于免疫荧光的成功至关重要，因此强烈建议使用经过验证的可靠性抗体。还建议尝试几种稀释的抗体，以确定性能最佳的浓度。
作为初步实验，我们研究了不同的对照，以评估可能的背景噪声或自发荧光。值得注意的是，我们在不同的实验中仅使用一抗，仅使用二抗，每种染色单独，并且没有染色。正如预期的那样，仅存在一抗/二抗的情况下，我们没有观察到任何焦点，而当我们单独执行每个染色的方案时，我们观察到绿色或红色荧光斑点（表明存在γH2AX或53BP1病灶）。关于无染色对照，我们观察到背景噪声/自发荧光，表现为弥漫染色。相反，在执行免疫荧光方案后，γH2AX或53BP1病灶在棕深色细胞核中清晰可见，在所用荧光染料（FITC或TRITC）的适当滤光片下作为绿色或红色信号。因此，背景噪声/自发荧光不会显着影响病灶的识别，也是因为我们使用了特定的标准来评估一个荧光点是否是适当的焦点（即，在显微镜聚焦期间，γ-H2AX和53BP1病灶不应与细胞核外可能存在的其他荧光斑点位于同一焦平面上）。之所以选择这些标准，是因为它们都可以让我们减少主观性，并使背景噪声/自发荧光的影响可以忽略不计。
博来霉素是一种基于自由基的诱变剂，通过对脱氧核糖的高度特异性自由基攻击诱导DSB，其方式与低LET电离辐射（IR）的作用方式非常相似。因此，博来霉素被定义为放射性模拟剂15。由于大量博来霉素诱导的DSB可能会严重影响淋巴细胞的增殖，在最坏的情况下触发细胞凋亡的激活，因此建议测试几种浓度的诱变剂，以确定可能导致DSB形成而不导致细胞毒性的剂量。
多项研究表明，修复IR诱导的DSB的主要途径是NHEJ，其通过病变16，17附近存在53BP1来促进。然而，尽管用博来霉素治疗后可能会出现更多的53BP1病灶，其作用类似于IR，但在我们的研究中，我们观察到γH2AX的频率高于53BP1病灶。γH2AX和53BP1病灶分析的主要优点在于能够在暴露或病理环境中评估细胞反应。事实上，众所周知，γH2AX和53BP1病灶是IR效应的可靠和既定标志物18，γH2AX病灶的存在代表了几种癌症的重要预后因素19，或者，更一般地说，他们同意确定试剂或化学物质增加DSB发生的能力。此外，可以评估γH2AX和53BP1病灶以建立DSB增加与某种疾病20，21之间的可能关系，根据对治疗的反应22，23验证治疗，或估计肿瘤放射敏感性24。
γH2AX和53BP1病灶测定被广泛用于量化DSB，但是，作者必须强调这两种方法都有局限性：主要关注点在于它们不检测DSB本身，而是修复过程中涉及的两个特定因素。因此，考虑到修复动力学是高度可变的25，对结果的解释可能是模棱两可的。
然而，本研究表明，使用双重免疫荧光同时量化γH2AX和53BP1病灶可能会导致结果解释中的几个问题。这主要是由于在DSBs位点中γH2AX的存在高于53BP1，以及我们在博来霉素治疗后观察到的两个标志物的共定位荧光信号水平较低。另一方面，组蛋白H2AX从DSB出现到修复时一直保持在Ser-139上的磷酸化，而53BP1是一种在更特定的条件下招募的蛋白质，例如当只有NHEJ可以被激活时，此外，53BP1在细胞周期25的G1期中具有很强的主导地位。此外，53BP1可能确实被招募到DSB与γH2AX一起发生的地方，但持续时间较短，因此双重免疫荧光无法同时定位它和γH2AX。但是，如果研究人员认为进行双重免疫荧光更合适，我们已经为此提供了详细可靠的方案，那么重要的是要考虑到这种方法本质上会导致低估事件的真实频率，如上所述。同时，为了不高估事件，应避免将共定位的γH2AX和53BP1焦点计为两个不同的点，因为它确实表明确实只存在一个DSB。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢全血献血者和所有采集血液样本的卫生人员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
References
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S.
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
