Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dobbelt immunfluorescens af γH2AX og 53BP1 i humane perifere lymfocytter

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65472
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Summary

Denne protokol præsenterer en metode til vurdering af dannelsen og reparationen af DNA-dobbeltstrengsbrud gennem samtidig påvisning af γH2AX og 53BP1-foci i interfasekerner af bleomycinbehandlede humane perifere lymfocytter.

Abstract

Dobbeltstrengsbrud (DSB'er) er en af de mest alvorlige læsioner, der kan forekomme i cellekerner, og hvis de ikke repareres, kan de føre til alvorlige resultater, herunder kræft. Cellen er derfor forsynet med komplekse mekanismer til reparation af DSB'er, og disse veje involverer histon H2AX i sin fosforylerede form ved Ser-139 (nemlig γH2AX) og p53-bindende protein 1 (53BP1). Da begge proteiner kan danne foci på DSB'ernes steder, betragtes identifikation af disse markører som en passende metode til at studere både DSB'er og deres reparationskinetik. Ifølge de molekylære processer, der fører til dannelsen af γH2AX og 53BP1 foci, kan det være mere nyttigt at undersøge deres co-lokalisering nær DSB'erne for at etablere en alternativ tilgang, der gør det muligt at kvantificere DSB'er ved samtidig påvisning af to DNA-skademarkører. Denne protokol sigter således mod at vurdere den genomiske skade induceret i humane lymfocytter af det radiomimetiske middel bleomycin gennem tilstedeværelsen af γH2AX og 53BP1 foci i en dobbelt immunofluorescens. Ved hjælp af denne metode afgrænsede vi også variationen i antallet af γH2AX og 53BP1 foci over tid som et indledende forsøg på at studere reparationskinetikken for bleomycin-inducerede DSB'er.

Introduction

DNA-skader induceres kontinuerligt af midler, der kan være endogene, såsom ROS genereret af cellulær oxidativ metabolisme eller eksogen, både kemikalier og fysiske1. Blandt de mest skadelige læsioner spiller dobbeltstrengsbrud (DSB'er) en grundlæggende rolle i at bidrage til genomisk ustabilitet, da de forårsager kromosomafvigelser, som igen kan initiere kræftfremkaldende proces. Således er celler forsynet med komplekse og effektive mekanismer til DSB'er, der reparerer2.

Når en DSB opstår, udløser cellen DNA-skaderespons (DDR), hvor der sammen med MRE11/RAD50/NBS1-komplekset rekrutteres ATM- eller ATR-kinaser for at aktivere andre proteiner, der bremser eller stopper cellecyklussen3. Et væsentligt mål for disse kinaser er histon H2AX, som fosforyleres på Ser-139 inden for få megabaser fra DSB'erne (nemlig γH2AX), hvilket muliggør rekruttering af flere reparationsfaktorer såsom blandt andet BRCA1 og p53-bindende protein 1 (53BP1)3. Senere udløses en vej mellem homolog rekombination (HR), ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ) eller enkeltstrenget udglødning (SSA) for at reparere DSB'erne 4,5. Derfor er 53BP1 involveret i at diktere valget mellem HR eller NHEJ, primært fremme aktiveringen af NHEJ snarere end HR6. Desuden kan både den fosforylerede form af H2AX-histon og 53BP1 danne foci på DSB'ernes steder. Da disse foci vedvarer, indtil integriteten af dobbeltstrengen er genoprettet, betragtes vurdering af udseendet / forsvinden af γH2AX eller 53BP1 foci inden for et tidsinterval som en nyttig metode til at evaluere forekomsten og reparationen af DSB'er i et cellesystem 6,7. I henhold til de ovenfor beskrevne molekylære processer, da γH2AX og 53BP1-foci forventes at lokalisere sammen nær DSB'erne under DDR8,9, kan det imidlertid være nyttigt samtidig at detektere tilstedeværelsen af disse markører i en dobbelt immunofluorescens.

Formålet med dette manuskript var således at evaluere egnetheden af den samtidige kvantificering af γH2AX og 53BP1 foci til vurdering af den genomiske skade induceret i humane perifere lymfocytter af det radiomimetiske middel bleomycin. Ved hjælp af samme metode forsøgte vi også at afgrænse reparationskinetikken for bleomycin-inducerede DSB'er i henhold til en tidligere oprettet eksperimentel procedure10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt af det etiske udvalg ved Pisa Universitet, og informeret og underskrevet samtykke blev indhentet fra hver donor.

1. Dannelse af γH2AX og 53BP1 foci

  1. Forberedelse af prøver og mutagen behandling
    1. Indsamle fuldblodsprøver ved venipunktur fra raske voksne individer i blodindsamling (f.eks. Vacutainer) rør, der indeholder lithiumheparin som antikoagulant.
    2. For at sikre korrekt opbevaring af blodprøver skal proceduren påbegyndes inden for 24 timer efter prøveudtagningen.
    3. Der tilsættes 300 μL af prøven til et glas indeholdende 4,7 ml komplet medium (0,5% penicillin-streptomycin, 0,75% phytohemagglutinin, 10% FBS tidligere inaktiveret, 88,75% RPMI 1640).
    4. Derefter tilsættes bleomycinsulfat til en slutkoncentration på 5 μg/ml.
      FORSIGTIG: Bleomycinsulfat er et mutagen. Undgå hudkontakt og indånding. Forbered opløsningen og tilsæt prøven under en hætte.
    5. For hver prøve opstilles en negativ kontrol (ingen mutagen).
    6. Røret anbringes i en termostat ved 37 °C i 2 timer.
  2. Fiksation
    1. Centrifugeringsprøver ved 540 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Supernatanten suges op, og pelletsen opslæmmes igen med hvirvelstrøm.
    3. Tilsæt 5 ml hypotonisk opløsning (2,87 g KCl opløst i 500 ml deioniseret vand) og 400 μL præfikseringsopløsning (5: 3 eddikesyre: methanol) for at forårsage hæmolyse af røde blodlegemer.
    4. Centrifugeringsprøver ved 540 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    5. Supernatanten suges til og pelletsen resuspenderes i 5 ml methanol ved stuetemperatur i mindst 30 minutter for at fiksere cellerne.
    6. Alternativt opbevares cellerne ved -20 °C indtil brug.
  3. Forberedelse af dias
    1. Centrifugeringsprøver ved 540 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Supernatanten suges op, og pelletpen resuspenderes i 5 ml 3:1 methanol: eddikesyreopløsning. Gentag disse trin en gang til.
    3. Til sidst centrifugeres opløsningen igen ved 540 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    4. Supernatanten suges igen, så opløsningen (0,5 ml) efterlades tilstrækkelig opløsning (0,5 ml) til at resuspendere pelleten, pipetten kraftigt, den opslæmmede cellepille dryppes på objektglassene og lufttørres. Opbevar diasene ved 4 °C.
  4. Immunofluorescens
    BEMÆRK: Immunofluorescens er en immunologisk metode til identifikation af specifikke cellemål ved hjælp af et primært antistof, der binder selve målet og et fluorescerende sekundært antistof, der binder det primære, der muliggør lokalisering af målet11. I dette tilfælde anvendes en musemonoklonal anti-53BP1 (1:50) og en kanin polyklonal anti-γH2AX (1:50) som primære antistoffer, mens AlexaFluor568 anti-mus (1:400) og DyLight488 anti-kanin (1:200) anvendes som sekundære antistoffer, henholdsvis.
    1. Vask lysbillederne to gange i 50 ml 1x PBS i 5 minutter i couplinglas (16 dias ryg mod ryg).
    2. Opbevar dem derefter i 30 minutter i blokeringsopløsning (10 ml FBS, 10 ml 10x PBS, 80 ml deioniseret vand, 300 μL Triton-X).
    3. Til hvert objektglas tilsættes 10 μL af hver af de to opløsninger, der indeholder de primære antistoffer, der er opløst i blokeringsopløsningen. Objektglassene dækkes med paraffintape og inkuberes ved 4 °C natten over.
    4. Efter inkubation udføres tre vask i 1x PBS i 5 min.
    5. Til hvert objektglas tilsættes 10 μL af hver af de to opløsninger, der indeholder de sekundære antistoffer, der er opløst i blokeringsopløsningen. Dæk diasene med paraffintape og inkuber ved stuetemperatur i 2 timer.
    6. Udfør tre vask i 1x PBS i 5 min.
    7. Tilsæt 2,5 μL antifadeopløsning med DAPI på dækslerne før samlingen for at modvirke pletterne på kernerne.
      BEMÆRK: For at vurdere focikinetik er proceduren den samme som beskrevet fra 1,1 til 1,4, idet det bemærkes, at cellehøstning og dobbelt immunfluorescens udføres ved 0 timer, efter 2 timers post-bleomycinbehandling og derefter, efter at mutagenet er fjernet, ved 4 timer, 6 timer og 24 timer efter behandling.

2. Analyse gennem et fluorescensmikroskop

BEMÆRK: "Fluorescensmikroskop" henviser til ethvert mikroskop, der bruger fluorescens til at generere et billede. Prøven belyses med lys med en bestemt bølgelængde (eller bølgelængder), som absorberes af fluoroforerne, hvilket får dem til at udsende lys med længere bølgelængder12. AlexaFluor568 og DyLight 488 absorberer lys på ca. 568 og 488 nm og udsender lys på henholdsvis 603 og 520 nm. Således er de synlige som rød eller grøn fluorescens ved hjælp af henholdsvis et TRITC- eller et FITC-filter.

  1. Bedøm tilstedeværelsen af foci i hvert dias under et 100x nedsænkningsmål (figur 1).
  2. Scor 200 kerner pr. dias og tæl antallet af γH2AX/53BP1 foci i hver kerne.
  3. Ekspresresultater i form af det gennemsnitlige antal foci pr. Samlet scoret kerner. Disse omfatter både γH2AX/53BP1-positive (viser mindst ét fluorescenssignal) og negative (viser ikke noget fluorescenssignal) kerner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data opnået ved fluorescensmikroskopanalyse af perifere lymfocytter giver os mulighed for at evaluere tre hovedaspekter: effektiviteten af bleomycinbehandling til at øge antallet af γH2AX og 53BP1 foci (og dermed af DSB'er) på grund af dets mutagene virkning, i hvilket omfang begge foci co-lokaliserede på DSB's sted og tidsforløbet af γH2AX og 53BP1 foci for at afgrænse reparationskinetikken for bleomycin-inducerede DSB'er. Som forventet blev der observeret en meget højere frekvens af både γH2AX og 53BP1 foci mellem ubehandlede og behandlede celler, hvilket bekræfter, at bleomycin inducerer dannelsen af DSB'er i perifere lymfocytter (figur 2).

En stor forskel blev observeret i antallet af foci af de to markører; især γH2AX-foci var mere talrige end 53BP1-foci, hvilket indikerer, at co-lokalisering ikke altid forekommer og kan afhænge af flere faktorer (figur 3).

Med hensyn til DSB's reparationskinetik er det først og fremmest vigtigt at understrege, hvordan den faktiske reparation af foci kan starte før det første valgte tidspunkt, som er 2 timer, og at vi på forskellige tidspunkter kan observere nydannede foci såvel som foci, der er dannet tidligere, og som endnu ikke er blevet repareret.

Under hensyntagen til det, der tidligere blev sagt, viste tidsforløbet af γH2AX og 53BP1 foci over tid en anden adfærd, selvom de bidrager til den samme funktion. γH2AX foci steg efter 2 timer efter behandlingen, og derefter startede de en progressiv reduktion uden dog at nå kontrolværdien 24 timer efter behandlingen. Ved varians steg hyppigheden af 53BP1 foci indtil 4 timer efter behandling, faldt derefter efter 6 timer og vendte tilbage til den højeste værdi 24 timer efter behandling (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Dobbelt immunfluorescens i humane perifere lymfocytter for γH2AX og 53BP1: (A) kerner uden γH2AX og 53BP1 foci før bleomycinbehandling, (B) og (C) kerner med forskellige mængder γH2AX og 53BP1 foci på grund af bleomycinbehandling. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning mellem ubehandlede og bleomycinbehandlede (5 μg/ml) lymfocytter for de to DSB-markører. Fejlbjælker repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning mellem den samlede mængde (både spontan og mutagen-induceret) af γH2AX og 53BP1 foci. Fejlbjælker repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: γH2AX og 53BP1 foci kinetik. 0 h, 2 timer, 4h, 6 timer og 24 timer repræsenterer de forskellige tidspunkter, hvor lymfocytter blev høstet; fejlbjælker repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunofluorescensanalyse af γH2AX og 53BP1 foci er en egnet metode til vurdering af genomisk skade i interfasekerner i et cellesystem. Denne procedure har flere kritiske punkter, der kan påvirke resultatet af forsøgene, hovedsageligt de midler, der anvendes til fiksering og permeabilisering, typen af antistoffer og deres fortyndingsfaktorer og koncentrationen af mutagenet.

Vedligeholdelsen af proteinintegritet er grundlæggende, da immunofluorescensmetoden forventer at identificere antigener, der hovedsageligt er proteiner. I denne protokol bruges methanol til at fiksere lymfocytter. Dette trin er især vigtigt, da alkohol virker ved at fortrænge vand og forårsage udfældning af opløselige proteiner, mens de andre ikke-faste cellulære komponenter kan fjernes ved vask i en saltvandsbufferopløsning, såsom PBS13.

En anden vigtig passage er permeabilisering, som udføres gennem en blokerende opløsning, som i dette tilfælde tillader både permeabilisering og blokering. Blokering udføres ved at tilføje FBS til opløsningen: det binder proteinerne i prøven og forhindrer antistoffer i at binde det forkerte mål, da bindingen mellem FBS og det specifikke mål for antistoffet senere kan brydes på grund af den høje affinitet mellem antistoffet og selve målet. Permeabilisering kan udføres ved anvendelse af flere opløsningsmidler, i dette tilfælde anvendes det ikke-ioniske vaskemiddel Triton X-100: det interkalerer i et phospholipid-dobbeltlag, opløser plasmamembranen og forstyrrer denderefter 14.

Da valget af effektive γH2AX- og 53BP1-antistoffer er afgørende for immunofluorescensens succes, anbefales det kraftigt at anvende antistoffer med dokumenteret pålidelighed. Det foreslås også at prøve flere fortyndinger af antistofferne for at identificere den bedst ydende koncentration.

Som indledende eksperimenter studerede vi forskellige kontroller for at vurdere mulig baggrundsstøj eller autofluorescens. Især brugte vi i forskellige eksperimenter kun de primære antistoffer, kun de sekundære antistoffer, hver plet individuelt og ingen farvning. Som forventet observerede vi ikke noget fokus kun ved tilstedeværelse af primære/sekundære antistoffer, mens vi observerede enten grønne eller røde fluorescerende pletter (hvilket indikerer tilstedeværelsen af enten γH2AX eller 53BP1 foci), da vi udførte protokollen med hver plet individuelt. Med hensyn til ingen farvningskontrol observerede vi baggrundsstøj / autofluorescens, som manifesterer sig med diffus farvning. I stedet er γH2AX eller 53BP1 foci efter udførelse af immunofluorescensprotokollen tydeligt synlige i de brun-mørke kerner som grønne eller røde signaler under det passende filter til de anvendte fluorkromer (FITC eller TRITC). Således påvirker baggrundsstøj / autofluorescens ikke på en væsentlig måde identifikationen af foci, også fordi vi brugte specifikke kriterier for at vurdere, om et fluorescerende sted er et korrekt fokus (dvs. under fokusering af mikroskopet bør γ-H2AX og 53BP1 foci ikke være på samme brændplan som andre fluorescerende pletter, der potentielt er til stede uden for cellekernen). Disse kriterier er valgt, da de både giver os mulighed for at reducere subjektiviteten og gøre virkningen af baggrundsstøj/autofluorescens ubetydelig.

Bleomycin er et radikalbaseret mutagen, der inducerer DSB'er ved det meget specifikke frie radikalangreb på deoxyribose, på en meget lignende måde som hvordan lav LET ioniserende stråling (IR) virker. Således defineres bleomycin som et radiomimetisk middel15. Da en stor mængde bleomycin-inducerede DSB'er alvorligt kan påvirke spredningen af lymfocytter, der i værste fald udløser aktivering af apoptose, foreslås det at teste flere koncentrationer af mutagenet for at identificere en dosis, der kan føre til DSB-dannelse uden at resultere i cytotoksicitet.

Flere undersøgelser viser, at den vigtigste vej til reparation af IR-inducerede DSB'er er NHEJ, hvilket fremmes af tilstedeværelsen af 53BP1 nær læsionen16,17. Men selvom en større mængde 53BP1 foci kan forventes at forekomme efter behandling med bleomycin, som virker på samme måde som IR, observerede vi i vores undersøgelse en højere frekvens af γH2AX end 53BP1 foci. Den største fordel ved γH2AX og 53BP1 foci-analysen er afhængig af evnen til at evaluere det cellulære respons i enten eksponering eller patologiske sammenhænge. Faktisk er det velkendt, at γH2AX og 53BP1 foci er pålidelige og etablerede markører for IR-effekter18, såvel som tilstedeværelsen af γH2AX-foci repræsenterer en vigtig prognostisk faktor i flere former for kræft19, eller mere generelt accepterer de at bestemme agenters eller kemikaliers evne til at øge DSB's forekomst. Desuden kan γH2AX og 53BP1 foci evalueres for at etablere et muligt forhold mellem DSB's stigning og en bestemt sygdom20,21, for at verificere en terapi med hensyn til respons på behandlingen 22,23 eller for at estimere tumorradiosensitivitet 24.

γH2AX og 53BP1 foci-assays anvendes i vid udstrækning til at kvantificere DSB'er, men forfatterne skal understrege, at begge metoder har begrænsninger: den største bekymring består i, at de ikke selv registrerer DSB'er, men to specifikke faktorer, der er involveret i reparationsprocesser. I betragtning af at reparationskinetikken er meget variabel25, kan fortolkningen af resultaterne således være tvetydig.

Den foreliggende undersøgelse indikerer imidlertid, at brugen af dobbelt immunfluorescens til samtidig kvantificering af γH2AX og 53BP1 foci kan føre til flere problemer i fortolkningen af resultaterne. Dette skyldes hovedsageligt både den højere tilstedeværelse af γH2AX end 53BP1 på DSB's lokaliteter og de lave niveauer af co-lokaliserede fluorescenssignaler for de to markører, som vi har observeret efter bleomycinbehandling. På den anden side forbliver histon H2AX fosforyleret på Ser-139 fra det tidspunkt, hvor en DSB vises, indtil den repareres, mens 53BP1 er et protein, der rekrutteres under mere specifikke forhold, for eksempel når kun NHEJ kan aktiveres, også 53BP1 er stærkt dominerende under G1-fasen af cellecyklus25. Desuden kan 53BP1 faktisk være blevet rekrutteret, hvor en DSB er forekommet sammen med γH2AX, men vedvarer i kortere tid, og derfor er dobbelt immunofluorescens ikke i stand til at lokalisere den og γH2AX samtidigt. Men hvis forskeren finder det mere hensigtsmæssigt at udføre en dobbelt immunofluorescens, for hvilken vi har leveret en detaljeret og pålidelig protokol, er det vigtigt at overveje, at denne metode i sagens natur kan føre til undervurdering af den sande frekvens af begivenheden som beskrevet ovenfor. På samme tid, for ikke at overvurdere begivenheden, bør det undgås at tælle de co-lokaliserede γH2AX og 53BP1 foci som to forskellige pletter, da det faktisk indikerer tilstedeværelsen af kun en DSB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige over for fuldblodsdonorerne og alt det sundhedspersonale, der tog blodprøverne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) Invitrogen A21124 53BP1 secondary antibody
Bleoprim Sanofi bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X Euroclone ECB3001D antibiotics for culture medium
PBS 10X Termofisher 14200075 Phosphate-buffered saline
FBS Euroclone EC20180L Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated Termofisher #35552 γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody Merck MAB 3802 53BP1 primary antibody
Labophot 2 Nikon Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody Cell Signaling #2577 γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin Termofisher R30852801 component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640 Euroclone ECB9006L Culture medium
Triton-X100 Sigma T9284 Nonionic detergent for permeabilization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 197
Dobbelt immunfluorescens af γH2AX og 53BP1 i humane perifere lymfocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Falaschi, A., Chiaramonte, A.,… More

Falaschi, A., Chiaramonte, A., Testi, S., Scarpato, R. Dual Immunofluorescence of γH2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes. J. Vis. Exp. (197), e65472, doi:10.3791/65472 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter