Summary
Dit protocol presenteert een methode om de vorming en reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.
Abstract
Dubbele strengsbreuken (DSB's) zijn een van de ernstigste laesies die kunnen optreden in celkernen, en als ze niet worden gerepareerd, kunnen ze leiden tot ernstige resultaten, waaronder kanker. De cel is daarom voorzien van complexe mechanismen om DSB's te repareren, en deze routes omvatten histon H2AX in zijn gefosforyleerde vorm bij Ser-139 (namelijk γH2AX) en p53-bindend eiwit 1 (53BP1). Aangezien beide eiwitten foci kunnen vormen op de plaatsen van DSB's, wordt identificatie van deze markers beschouwd als een geschikte methode om zowel DSB's als hun kinetiek van reparatie te bestuderen. Volgens de moleculaire processen die leiden tot de vorming van γH2AX- en 53BP1-foci, zou het nuttiger kunnen zijn om hun co-lokalisatie in de buurt van de DSB's te onderzoeken om een alternatieve aanpak op te zetten die het mogelijk maakt DSB's te kwantificeren door de gelijktijdige detectie van twee DNA-schademarkers. Dit protocol heeft dus tot doel de genomische schade te beoordelen die in menselijke lymfocyten wordt veroorzaakt door het radiomimetische agens bleomycine door de aanwezigheid van γH2AX en 53BP1-foci in een dubbele immunofluorescentie. Met behulp van deze methodologie hebben we ook de variatie in het aantal γH2AX- en 53BP1-foci in de loop van de tijd afgebakend, als een voorlopige poging om de reparatiekinetiek van door bleomycine geïnduceerde DSB's te bestuderen.
Introduction
DNA-schade wordt continu geïnduceerd door agentia die endogeen kunnen zijn, zoals ROS gegenereerd door cellulair oxidatief metabolisme, of exogene, zowel chemicaliën als fysisch1. Een van de meest schadelijke laesies spelen dubbelstrengsbreuken (DSB's) een fundamentele rol bij het bijdragen aan genomische instabiliteit, omdat ze chromosoomafwijkingen veroorzaken die op hun beurt het carcinogeneseproces kunnen initiëren. Zo worden cellen voorzien van complexe en efficiënte mechanismen van DSB's die repareren2.
Wanneer een DSB optreedt, activeert de cel de DNA-schaderespons (DDR) waarbij, samen met het MRE11 / RAD50 / NBS1-complex, ATM- of ATR-kinasen worden gerekruteerd om andere eiwitten te activeren die de celcyclus vertragen of stoppen3. Een essentieel doelwit van deze kinasen is histon H2AX, dat wordt gefosforyleerd op Ser-139 binnen enkele megabases van de DSB's (namelijk γH2AX), waardoor de rekrutering van verschillende reparatiefactoren mogelijk is, zoals onder andere BRCA1 en p53-bindend eiwit 1 (53BP1)3. Later wordt één route tussen homologe recombinatie (HR), niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of enkelstrengsgloeiing (SSA) geactiveerd om de DSB's 4,5 te repareren. Daarom is 53BP1 betrokken bij het dicteren van de keuze tussen HR of NHEJ, voornamelijk het bevorderen van de activering van NHEJ in plaats van HR6. Bovendien kunnen zowel de gefosforyleerde vorm van H2AX-histon als 53BP1 foci vormen op de plaatsen van DSB's. Aangezien deze foci blijven bestaan totdat de integriteit van de dubbele streng is hersteld, wordt het beoordelen van het verschijnen/verdwijnen van γH2AX of 53BP1 foci binnen een tijdsinterval beschouwd als een nuttige methode om het optreden en herstel van DSB's in een celsysteemte evalueren 6,7. Volgens de hierboven beschreven moleculaire processen kan het echter nuttig zijn om, aangezien γH2AX en 53BP1-foci naar verwachting samen in de buurt van de DSB's zullen lokaliseren tijdens DDR8,9, tegelijkertijd de aanwezigheid van deze markers in een dubbele immunofluorescentie te detecteren.
Het doel van dit manuscript was dus om de geschiktheid te evalueren van de gelijktijdige kwantificering van γH2AX en 53BP1 foci om de genomische schade geïnduceerd in menselijke perifere lymfocyten door het radiomimetische middel bleomycine te beoordelen. Met behulp van dezelfde methodologie probeerden we ook de reparatiekinetiek van door bleomycine geïnduceerde DSB's af te bakenen volgens een eerder opgezette experimentele procedure10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Pisa en geïnformeerde en ondertekende toestemming werd verkregen van elke donor.
1. Vorming van γH2AX en 53BP1 foci
- Bereiding van monsters en mutagene behandeling
- Verzamel volbloedmonsters door venapunctie van gezonde volwassen personen in bloedafnamebuizen (bijv. Vacutainer) die lithiumheparine als anticoagulans bevatten.
- Om een goede bewaring van het bloedmonster te garanderen, start u de procedure binnen 24 uur na de bemonstering.
- Voeg 300 μL van het monster toe aan een buis met 4,7 ml volledig medium (0,5% penicilline-streptomycine, 0,75% fytohemagglutinine, 10% FBS eerder geïnactiveerd, 88,75% RPMI 1640).
- Voeg vervolgens bleomycinesulfaat toe tot een uiteindelijke concentratie van 5 μg / ml.
LET OP: Bleomycinesulfaat is een mutageen. Vermijd huidcontact en inademing. Bereid de oplossing en voeg het monster toe onder een kap. - Stel voor elk monster een negatieve controle in (afwezigheid van mutageen).
- Plaats de buis in een thermostaat op 37 °C gedurende 2 uur.
- Fixatie
- Centrifugemonsters bij 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet met vortex.
- Voeg 5 ml hypotone oplossing (2,87 g KCl opgelost in 500 ml gedeïoniseerd water) en 400 μl prefixatieve oplossing (5:3 azijnzuur: methanol) toe om hemolyse van rode bloedcellen te veroorzaken.
- Centrifugemonsters bij 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 5 ml methanol bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten om de cellen te fixeren.
- U kunt de cellen ook bewaren bij -20 °C tot gebruik.
- Dia's voorbereiding
- Centrifugemonsters bij 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 5 ml van een 3:1 methanol: azijnzuuroplossing. Herhaal deze stappen nog een keer.
- Centrifugeer de oplossing aan het einde opnieuw op 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant opnieuw op en laat voldoende oplossing (0,5 ml) achter om de pellet te resuspenderen, pipetteer krachtig, laat de geresuspendeerde celpellet op de dia's vallen en droog aan de lucht. Bewaar de dia's bij 4 °C.
- Immunofluorescentie
OPMERKING: Immunofluorescentie is een immunologische methode voor het identificeren van specifieke celdoelen met behulp van een primair antilichaam dat het doelwit zelf bindt en een fluorescerend secundair antilichaam dat het primaire bindt en waarmee het doelwit11 kan worden gelokaliseerd. In dit geval worden een muis monoklonale anti-53BP1 (1:50) en een konijn polyklonale anti-γH2AX (1:50) gebruikt als primaire antilichamen, terwijl AlexaFluor568 anti-muis (1:400) en DyLight488 anti-konijn (1:200) worden gebruikt als secundaire antilichamen, respectievelijk.- Was de dia's twee keer in 50 ml 1x PBS gedurende 5 minuten in een couplin pot (16 dia's rug-aan-rug).
- Bewaar ze vervolgens gedurende 30 minuten in een blokkerende oplossing (10 ml FBS, 10 ml 10x PBS, 80 ml gedeïoniseerd water, 300 μl Triton-X).
- Voeg aan elke dia 10 μL van elk van de twee oplossingen toe die de primaire antilichamen bevatten die in de blokkerende oplossing zijn opgelost. Bedek de dia's met paraffinetape en incubeer een nacht bij 4 °C.
- Voer na incubatie drie wasbeurten uit in 1x PBS gedurende 5 minuten.
- Voeg aan elke dia 10 μL van elk van de twee oplossingen toe die de secundaire antilichamen bevatten die in de blokkerende oplossing zijn opgelost. Bedek de dia's met paraffinetape en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Voer drie wasbeurten uit in 1x PBS gedurende 5 min.
- Voeg vóór de montage 2,5 μL antifade-oplossing met DAPI toe aan de dekletters om de kernen tegen te gaan.
OPMERKING: Om de focikinetiek te beoordelen, is de procedure dezelfde als beschreven van 1,1 tot 1,4, waarbij wordt opgemerkt dat celoogst en de dubbele immunofluorescentie worden uitgevoerd op 0 h, na 2 uur na de behandeling met bleomycine en vervolgens, na het verwijderen van de mutagene stof, op 4 h, 6 h en 24 h na de behandeling.
2. Analyse door een fluorescentiemicroscoop
OPMERKING: "Fluorescentiemicroscoop" verwijst naar elke microscoop die fluorescentie gebruikt om een afbeelding te genereren. Het monster wordt verlicht met licht van een specifieke golflengte (of golflengten) dat wordt geabsorbeerd door de fluoroforen, waardoor ze licht van langere golflengtenuitzenden 12. AlexaFluor568 en DyLight 488 absorberen licht van ongeveer 568 en 488 nm en zenden licht uit van respectievelijk 603 en 520 nm. Ze zijn dus zichtbaar als rode of groene fluorescentie met behulp van respectievelijk een TRITC- of een FITC-filter.
- Scoor de aanwezigheid van foci in elke dia onder een 100x onderdompelingsdoel (figuur 1).
- Scoor 200 kernen per dia en tel het aantal γH2AX/53BP1 foci in elke kern.
- Express-resultaten in termen van het gemiddelde aantal foci per totaal gescoorde kernen. Deze omvatten zowel γH2AX/53BP1 positieve (met ten minste één fluorescentiesignaal) als negatieve (geen fluorescentiesignaal) kernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gegevens verkregen door de fluorescentiemicroscoopanalyse van perifere lymfocyten stellen ons in staat om drie hoofdaspecten te evalueren: de effectiviteit van bleomycinebehandeling bij het verhogen van het aantal γH2AX- en 53BP1-foci (en dus van DSB's) vanwege het mutagene effect, in welke mate beide foci co-gelokaliseerd zijn op de plaats van DSB's, en het tijdsverloop van γH2AX en 53BP1-foci om de reparatiekinetiek van bleomycine-geïnduceerde DSB's af te bakenen. Zoals verwacht werd een zeer hogere frequentie van zowel γH2AX als 53BP1 foci waargenomen tussen onbehandelde en behandelde cellen, wat bevestigt dat bleomycine de vorming van DSB's in perifere lymfocyten induceert (figuur 2).
Er werd een groot verschil waargenomen in het aantal foci van de twee markers; in het bijzonder waren γH2AX-foci talrijker dan 53BP1-foci, wat aangeeft dat co-lokalisatie niet altijd optreedt en afhankelijk kan zijn van meerdere factoren (figuur 3).
Met betrekking tot de reparatiekinetiek van DSB's is het allereerst belangrijk om te benadrukken hoe de daadwerkelijke reparatie van foci kan beginnen vóór het eerste geselecteerde tijdstip, dat 2 uur is, en dat we op verschillende tijdstippen nieuw gevormde foci en foci kunnen waarnemen die eerder zijn gevormd en die nog niet zijn gerepareerd.
Rekening houdend met wat eerder werd gezegd, vertoonde het tijdsverloop van γH2AX en 53BP1 foci in de loop van de tijd een ander gedrag, hoewel ze bijdragen aan dezelfde functie. γH2AX-foci namen toe na 2 uur na de behandeling en vervolgens begonnen ze met een progressieve reductie, zonder echter de controlewaarde 24 uur na de behandeling te bereiken. Bij variantie nam de frequentie van 53BP1-foci toe tot 4 uur na de behandeling, daalde vervolgens na 6 uur en keerde 24 uur na de behandeling terug naar de hoogste waarde (figuur 4).
Figuur 1: Dubbele immunofluorescentie in menselijke perifere lymfocyten voor γH2AX en 53BP1: (A) kernen zonder γH2AX en 53BP1 foci vóór behandeling met bleomycine, (B) en (C) kernen met verschillende hoeveelheden γH2AX en 53BP1 foci als gevolg van behandeling met bleomycine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking tussen onbehandelde en met bleomycine behandelde (5 μg/ml) lymfocyten voor de twee DSB-markers. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking tussen de totale hoeveelheid (zowel spontaan als mutageen geïnduceerd) van γH2AX en 53BP1 foci. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: γH2AX en 53BP1 foci kinetiek. 0 h, 2 h, 4h, 6 h en 24 h vertegenwoordigen de verschillende tijdstippen waarop lymfocyten werden geoogst; foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunofluorescentieanalyse van γH2AX en 53BP1 foci is een geschikte methode voor het beoordelen van genomische schade in interfasekernen van een celsysteem. Deze procedure heeft verschillende kritieke punten die de uitkomst van de experimenten kunnen beïnvloeden, voornamelijk de middelen die worden gebruikt bij fixatie en permeabilisatie, het type antilichamen en hun verdunningsfactoren en de concentratie van het mutagene beeld.
Het behoud van eiwitintegriteit is van fundamenteel belang, omdat de immunofluorescentiemethode antigenen verwacht te identificeren die voornamelijk eiwitten zijn. In dit protocol wordt methanol gebruikt om lymfocyten te fixeren. Deze stap is vooral belangrijk omdat alcohol werkt door water te verplaatsen en de neerslag van oplosbare eiwitten te veroorzaken, terwijl de andere niet-gefixeerde cellulaire componenten kunnen worden verwijderd door te wassen in een zoutoplossing, zoals PBS13.
Een andere belangrijke doorgang is permeabilisatie die wordt uitgevoerd door een blokkerende oplossing, die in dit geval zowel permeabilisatie als blokkering mogelijk maakt. Blokkering wordt uitgevoerd door FBS aan de oplossing toe te voegen: het bindt de eiwitten in het monster en voorkomt dat antilichamen het verkeerde doelwit binden, omdat de binding tussen FBS en het specifieke doelwit van het antilichaam later kan worden verbroken vanwege de hoge affiniteit tussen het antilichaam en het doelwit zelf. Permeabilisatie kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende oplosmiddelen, in dit geval wordt het niet-ionische reinigingsmiddel Triton X-100 gebruikt: het intercaliseert in een fosfolipide dubbellaag, lost het plasmamembraan op en verstoort het vervolgens14.
Aangezien de keuze van efficiënte γH2AX- en 53BP1-antilichamen cruciaal is voor het succes van de immunofluorescentie, wordt het gebruik van antilichamen met bewezen betrouwbaarheid sterk aanbevolen. Er wordt ook voorgesteld om verschillende verdunningen van de antilichamen te proberen om de best presterende concentratie te identificeren.
Als voorbereidende experimenten bestudeerden we verschillende controles om mogelijke achtergrondruis of autofluorescentie te beoordelen. Met name gebruikten we, in verschillende experimenten, alleen de primaire antilichamen, alleen de secundaire antilichamen, elke vlek afzonderlijk en geen kleuring. Zoals verwacht, alleen in de aanwezigheid van primaire / secundaire antilichamen, hebben we geen focus waargenomen, terwijl we groene of rode fluorescerende vlekken hebben waargenomen (wat wijst op de aanwezigheid van γH2AX of 53BP1-foci) wanneer we het protocol met elke vlek afzonderlijk uitvoerden. Met betrekking tot geen kleuringscontroles hebben we achtergrondgeluid/autofluorescentie waargenomen, wat zich manifesteert met diffuse kleuring. In plaats daarvan zijn na het uitvoeren van het immunofluorescentieprotocol γH2AX- of 53BP1-foci duidelijk zichtbaar in de bruin-donkere kernen als groene of rode signalen onder het juiste filter voor de gebruikte fluorchromen (FITC of TRITC). Achtergrondruis/autofluorescentie heeft dus geen significante invloed op de identificatie van foci, ook omdat we specifieke criteria hebben gebruikt om te beoordelen of één fluorescerende spot een juiste focus is (d.w.z. tijdens het scherpstellen van de microscoop mogen γ-H2AX- en 53BP1-foci zich niet op hetzelfde brandpuntsvlak bevinden van andere fluorescerende vlekken die mogelijk buiten de celkern aanwezig zijn). Deze criteria zijn gekozen omdat ze ons beide in staat stellen om subjectiviteit te verminderen en de impact van achtergrondruis / autofluorescentie verwaarloosbaar te maken.
Bleomycine is een op radicalen gebaseerd mutageen dat DSB's induceert door de zeer specifieke aanval van vrije radicalen op deoxyribose, op een zeer vergelijkbare manier als hoe lage LET ioniserende straling (IR) werkt. Bleomycine wordt dus gedefinieerd als een radiomimetisch middel15. Aangezien een grote hoeveelheid door bleomycine geïnduceerde DSB's de proliferatie van lymfocyten ernstig kan beïnvloeden en in het ergste geval de activering van apoptose kan veroorzaken, wordt voorgesteld om verschillende concentraties van het mutagene stof te testen om een dosis te identificeren die kan leiden tot de vorming van DSB's zonder te resulteren in cytotoxiciteit.
Verschillende studies tonen aan dat de belangrijkste route om IR-geïnduceerde DSB's te repareren NHEJ is, die wordt bevorderd door de aanwezigheid van 53BP1 in de buurt van de laesie16,17. Hoewel een grotere hoeveelheid 53BP1-foci kan worden verwacht na behandeling met bleomycine, die op dezelfde manier werkt als IR, zagen we in onze studie een hogere frequentie van γH2AX dan 53BP1-foci. Het belangrijkste voordeel van de γH2AX- en 53BP1-focianalyse is gebaseerd op het vermogen om de cellulaire respons te evalueren in blootstelling of pathologische contexten. In feite is het algemeen bekend dat γH2AX en 53BP1 foci betrouwbare en gevestigde markers van IR-effecten18 zijn, evenals de aanwezigheid van γH2AX-foci vertegenwoordigen een belangrijke prognostische factor in verschillende vormen van kanker19, of, meer in het algemeen, ze stemmen ermee in om het vermogen van middelen of chemicaliën te bepalen om het voorkomen van DSB's te verhogen. Bovendien kunnen γH2AX en 53BP1 foci worden geëvalueerd om een mogelijke relatie vast te stellen tussen de toename van DSB's en een bepaalde ziekte 20,21, om een therapie te verifiëren in termen van respons op de behandeling 22,23, of om tumorradiosensitiviteit 24 te schatten.
γH2AX en 53BP1 foci assays worden veel gebruikt om DSB's te kwantificeren, maar de auteurs moeten benadrukken dat beide methoden beperkingen hebben: de grootste zorg bestaat uit het feit dat ze geen DSB's zelf detecteren, maar twee specifieke factoren die betrokken zijn bij reparatieprocessen. Aangezien de reparatiekinetiek zeer variabel is25, kan de interpretatie van de resultaten dubbelzinnig zijn.
De huidige studie geeft echter aan dat het gebruik van dubbele immunofluorescentie om tegelijkertijd γH2AX en 53BP1 foci te kwantificeren tot verschillende problemen bij de interpretatie van de resultaten kan leiden. Dit is voornamelijk te wijten aan zowel de hogere aanwezigheid van γH2AX dan 53BP1 op DSB-locaties als de lage niveaus van co-gelokaliseerde fluorescentiesignalen voor de twee markers die we hebben waargenomen na behandeling met bleomycine. Aan de andere kant blijft histon H2AX gefosforyleerd op Ser-139 vanaf het moment dat een DSB verschijnt totdat het wordt gerepareerd, terwijl 53BP1 een eiwit is dat onder meer specifieke omstandigheden wordt gerekruteerd, bijvoorbeeld wanneer alleen NHEJ kan worden geactiveerd, ook is 53BP1 sterk dominant tijdens de G1-fase van celcyclus25. Bovendien kan 53BP1 inderdaad zijn gerekruteerd wanneer een DSB samen met γH2AX is opgetreden, maar korter aanhoudt, en daarom is dubbele immunofluorescentie niet in staat om het en γH2AX tegelijkertijd te lokaliseren. Als de onderzoeker het echter passender acht om een dubbele immunofluorescentie uit te voeren, waarvoor we een gedetailleerd en betrouwbaar protocol hebben verstrekt, is het belangrijk om te overwegen dat deze methode inherent kan leiden tot onderschatting van de ware frequentie van de gebeurtenis, zoals hierboven beschreven. Tegelijkertijd, om de gebeurtenis niet te overschatten, moet het tellen van de co-gelokaliseerde γH2AX- en 53BP1-foci als twee verschillende vlekken worden vermeden, omdat dit inderdaad de aanwezigheid van slechts één DSB aangeeft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn de volbloeddonoren en al het gezondheidspersoneel dat de bloedmonsters heeft genomen dankbaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
References
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S.
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
