Summary
Ce protocole présente une méthode pour évaluer la formation et la réparation des cassures double brin d’ADN par la détection simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 dans les noyaux interphasiques des lymphocytes périphériques humains traités à la bléomycine.
Abstract
Les cassures double brin (DSB) sont l’une des lésions les plus graves qui peuvent survenir dans les noyaux cellulaires et, si elles ne sont pas réparées, elles peuvent entraîner des conséquences graves, y compris le cancer. La cellule est donc dotée de mécanismes complexes pour réparer les DSB, et ces voies impliquent l’histone H2AX sous sa forme phosphorylée à Ser-139 (à savoir γH2AX) et la protéine de liaison p53 1 (53BP1). Comme les deux protéines peuvent former des foyers sur les sites des DSB, l’identification de ces marqueurs est considérée comme une méthode appropriée pour étudier à la fois les DSB et leur cinétique de réparation. Selon les processus moléculaires qui conduisent à la formation des foyers γH2AX et 53BP1, il pourrait être plus utile d’étudier leur co-localisation à proximité des DSB afin de mettre en place une approche alternative permettant de quantifier les DSB par la détection simultanée de deux marqueurs de dommages à l’ADN. Ainsi, ce protocole vise à évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes humains par l’agent radiomimétique bléomycine par la présence de foyers γH2AX et 53BP1 dans une double immunofluorescence. En utilisant cette méthodologie, nous avons également délimité la variation du nombre de foyers γH2AX et 53BP1 au fil du temps, comme tentative préliminaire d’étudier la cinétique de réparation des DSB induits par la bléomycine.
Introduction
Les dommages à l’ADN sont continuellement induits par des agents qui peuvent être endogènes, tels que les ROS générés par le métabolisme oxydatif cellulaire, ou exogènes, à la fois chimiques et physiques1. Parmi les lésions les plus nocives, les cassures double brin (DSB) jouent un rôle fondamental en contribuant à l’instabilité génomique, car elles provoquent des aberrations chromosomiques qui peuvent à leur tour initier le processus de cancérogenèse. Ainsi, les cellules sont pourvues de mécanismes complexes et efficaces de réparationDSBs 2.
Lorsqu’un DSB se produit, la cellule déclenche la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) où, avec le complexe MRE11 / RAD50 / NBS1, les kinases ATM ou ATR sont recrutées pour activer d’autres protéines qui ralentissent ou arrêtent le cycle cellulaire3. Une cible essentielle de ces kinases est l’histone H2AX, qui est phosphorylée sur Ser-139 au sein de quelques mégabases issues des DSB (à savoir γH2AX), permettant ainsi le recrutement de plusieurs facteurs de réparation tels que, entre autres, BRCA1 et p53 binding protein 1 (53BP1)3. Plus tard, une voie entre la recombinaison homologue (HR), l’assemblage d’extrémité non homologue (NHEJ) ou le recuit simple brin (SSA) est déclenchée pour réparer les DSB 4,5. Par conséquent, 53BP1 est impliqué dans la dictée du choix entre HR ou NHEJ, favorisant principalement l’activation de NHEJ plutôt que HR6. De plus, la forme phosphorylée de l’histone H2AX et du 53BP1 peut former des foyers sur les sites des DSB. Comme ces foyers persistent jusqu’à ce que l’intégrité du double brin soit restaurée, l’évaluation de l’apparition/disparition des foyers γH2AX ou 53BP1 dans un intervalle de temps est considérée comme une méthode utile pour évaluer l’apparition et la réparation des DSB dans un système cellulaire 6,7. Cependant, selon les processus moléculaires décrits ci-dessus, étant donné que les foyers γH2AX et 53BP1 devraient co-localiser près des DSB au cours de la DDR8,9, il peut être utile de détecter simultanément la présence de ces marqueurs dans une double immunofluorescence.
Ainsi, le but de ce manuscrit était d’évaluer la pertinence de la quantification simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 pour évaluer les dommages génomiques induits dans les lymphocytes périphériques humains par l’agent radiomimétique bléomycine. En utilisant la même méthodologie, nous avons également tenté de délimiter la cinétique de réparation des DSB induites par la bléomycine selon une procédure expérimentale précédemment mise en place10.
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Protocol
L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de Pise, et le consentement éclairé et signé a été obtenu de chaque donneur.
1. Formation des foyers γH2AX et 53BP1
- Préparation des échantillons et traitement mutagène
- Prélever des échantillons de sang total par ponction veineuse chez des adultes en bonne santé dans des tubes de prélèvement sanguin (p. ex. Vacutainer) contenant de l’héparine de lithium comme anticoagulant.
- Afin de garantir une bonne conservation des échantillons de sang, commencez la procédure dans les 24 heures suivant le prélèvement.
- Ajouter 300 μL de l’échantillon dans un tube contenant 4,7 mL de milieu complet (0,5 % pénicilline-streptomycine, 0,75 % phytohémagglutinine, 10 % FBS précédemment inactivé, 88,75 % RPMI 1640).
- Ajouter ensuite le sulfate de bléomycine à une concentration finale de 5 μg/mL.
ATTENTION : Le sulfate de bléomycine est un mutagène. Éviter le contact cutané et l’inhalation. Préparer la solution et ajouter l’échantillon sous une hotte. - Pour chaque échantillon, mettre en place un contrôle négatif (absence de mutagène).
- Placer le tube dans un thermostat à 37 °C pendant 2 h.
- Fixation
- Centrifuger les échantillons à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec du vortex.
- Ajouter 5 mL de solution hypotonique (2,87 g de KCl dissous dans 500 mL d’eau désionisée) et 400 μL de solution préfixatrice (acide acétique 5:3 : méthanol) pour provoquer l’hémolyse des globules rouges.
- Centrifuger les échantillons à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 5 mL de méthanol à température ambiante pendant au moins 30 minutes pour fixer les cellules.
- Vous pouvez également conserver les cellules à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Préparation des diapositives
- Centrifuger les échantillons à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 5 mL d’une solution d’acide acétique de méthanol 3:1. Répétez ces étapes une fois de plus.
- À la fin, centrifuger à nouveau la solution à 540 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer à nouveau le surnageant en laissant suffisamment de solution (0,5 mL) pour remettre en suspension la pastille, pipeter vigoureusement, laisser tomber la pastille de cellule remise en suspension sur les lames et sécher à l’air. Conserver les lames à 4 °C.
- Immunofluorescence
NOTE: L’immunofluorescence est une méthode immunologique d’identification de cibles cellulaires spécifiques à l’aide d’un anticorps primaire liant la cible elle-même et d’un anticorps secondaire fluorescent liant la cible primaire qui permet de localiser la cible11. Dans ce cas, un anti-53BP1 monoclonal de souris (1:50) et un anti-γH2AX polyclonal de lapin (1:50) sont utilisés comme anticorps primaires, tandis que l’anti-souris AlexaFluor568 (1:400) et l’anti-lapin DyLight488 (1:200) sont utilisés comme anticorps secondaires, respectivement.- Lavez les lames deux fois dans 50 ml de 1x PBS pendant 5 min dans un pot de couplin (16 lames dos à dos).
- Ensuite, conservez-les pendant 30 min dans une solution de blocage (10 mL de FBS, 10 mL de PBS 10x, 80 mL d’eau désionisée, 300 μL de Triton-X).
- Ajouter à chaque lame 10 μL de chacune des deux solutions contenant les anticorps primaires dissous dans la solution bloquante. Couvrir les lames avec du ruban de paraffine et incuber à 4 °C pendant la nuit.
- Après l’incubation, effectuer trois lavages en 1x PBS pendant 5 min.
- Ajouter à chaque lame 10 μL de chacune des deux solutions contenant les anticorps secondaires dissous dans la solution bloquante. Couvrir les lames avec du ruban de paraffine et incuber à température ambiante pendant 2 h.
- Effectuer trois lavages en 1x PBS pendant 5 min.
- Ajouter 2,5 μL de solution antidécoloration avec DAPI sur les lamelles de couverture avant l’assemblage pour contre-colorer les noyaux.
NOTE: Afin d’évaluer la cinétique des foyers, la procédure est la même que celle décrite de 1.1 à 1.4, notant que le prélèvement cellulaire et la double immunofluorescence sont effectués à 0 h, après 2 h de traitement post-bléomycine puis, après avoir retiré le mutagène, à 4 h, 6 h et 24 h après le traitement.
2. Analyse au microscope à fluorescence
REMARQUE: « Microscope à fluorescence » fait référence à tout microscope qui utilise la fluorescence pour générer une image. L’échantillon est éclairé par de la lumière d’une longueur d’onde spécifique (ou de longueurs d’onde) qui est absorbée par les fluorophores, ce qui les amène à émettre de la lumière de longueurs d’onde plus longues12. AlexaFluor568 et DyLight 488 absorbent une lumière d’environ 568 et 488 nm et émettent une lumière de 603 et 520 nm, respectivement. Ainsi, ils sont visibles sous forme de fluorescence rouge ou verte à l’aide d’un filtre TRITC ou FITC, respectivement.
- Noter la présence de foyers dans chaque diapositive sous un objectif d’immersion 100x (Figure 1).
- Marquez 200 noyaux par lame et comptez le nombre de foyers γH2AX/53BP1 dans chaque noyau.
- Exprimer les résultats en termes de nombre moyen de foyers par noyau total marqué. Ceux-ci incluent à la fois les noyaux γH2AX/53BP1 positifs (montrant au moins un signal de fluorescence) et négatifs (ne montrant aucun signal de fluorescence).
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Representative Results
Les données obtenues par l’analyse au microscope à fluorescence des lymphocytes périphériques nous permettent d’évaluer trois aspects principaux: l’efficacité du traitement à la bléomycine pour augmenter le nombre de foyers γH2AX et 53BP1 (et donc de DSB) en raison de son effet mutagénique, dans quelle mesure les deux foyers co-localisés sur le site des DSB, et l’évolution temporelle des foyers γH2AX et 53BP1 pour délimiter la cinétique de réparation des DSB induits par la bléomycine. Comme prévu, une fréquence très élevée des foyers γH2AX et 53BP1 a été observée entre les cellules non traitées et traitées, confirmant ainsi que la bléomycine induit la formation de DSB dans les lymphocytes périphériques (Figure 2).
Une grande différence a été observée dans le nombre de foyers des deux marqueurs; en particulier, les foyers γH2AX étaient plus nombreux que les foyers 53BP1, ce qui indique que la colocalisation ne se produit pas toujours et peut dépendre de plusieurs facteurs (Figure 3).
En ce qui concerne la cinétique de réparation des DSB, tout d’abord, il est important de souligner comment la réparation réelle des foyers peut commencer avant le premier point de temps sélectionné, qui est de 2 h, et qu’à différents points temporels, nous pouvons observer des foyers nouvellement formés ainsi que des foyers qui ont été formés précédemment et qui n’ont pas encore été réparés.
Compte tenu de ce qui a été dit précédemment, l’évolution temporelle des foyers γH2AX et 53BP1 au fil du temps a montré un comportement différent bien qu’ils contribuent à la même fonction. Les foyers γH2AX ont augmenté après 2h post-traitement, puis ils ont commencé une réduction progressive, sans toutefois atteindre la valeur de contrôle 24 h après le traitement. À la variance, la fréquence des foyers 53BP1 a augmenté jusqu’à 4 heures après le traitement, puis a diminué à 6 heures et est revenue à la valeur la plus élevée 24 heures après le traitement (figure 4).
Figure 1 : Double immunofluorescence dans les lymphocytes périphériques humains pour γH2AX et 53BP1 : (A) noyaux sans foyers γH2AX et 53BP1 avant traitement à la bléomycine, (B) et (C) noyaux avec différentes quantités de foyers γH2AX et 53BP1 dus au traitement à la bléomycine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Comparaison entre les lymphocytes non traités et les lymphocytes traités à la bléomycine (5 μg/mL) pour les deux marqueurs DSB. Les barres d’erreur représentent SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Comparaison entre la quantité totale (spontanée et induite par mutagène) de foyers γH2AX et 53BP1. Les barres d’erreur représentent SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : cinétiques des foyers γH2AX et 53BP1. 0 h, 2 h, 4h, 6 h et 24 h représentent les différents moments auxquels les lymphocytes ont été récoltés ; Les barres d’erreur représentent le MEB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’analyse par immunofluorescence des foyers γH2AX et 53BP1 est une méthode appropriée pour évaluer les dommages génomiques dans les noyaux interphasiques d’un système cellulaire. Cette procédure comporte plusieurs points critiques qui peuvent affecter le résultat des expériences, principalement les agents utilisés dans la fixation et la perméabilisation, le type d’anticorps et leurs facteurs de dilution, ainsi que la concentration du mutagène.
Le maintien de l’intégrité des protéines est fondamental puisque la méthode d’immunofluorescence permet d’identifier des antigènes qui sont principalement des protéines. Dans ce protocole, le méthanol est utilisé pour fixer les lymphocytes. Cette étape est particulièrement importante puisque l’alcool agit en déplaçant l’eau et en provoquant la précipitation des protéines solubles, tandis que les autres composants cellulaires non fixés peuvent être éliminés par lavage dans une solution tampon saline, telle que PBS13.
Un autre passage clé est la perméabilisation qui est effectuée à travers une solution de blocage, qui dans ce cas permet à la fois la perméabilisation et le blocage. Le blocage est effectué en ajoutant FBS à la solution: il lie les protéines dans l’échantillon et empêche les anticorps de se lier à la mauvaise cible puisque la liaison entre FBS et la cible spécifique de l’anticorps peut ensuite être rompue en raison de la forte affinité entre l’anticorps et la cible elle-même. La perméabilisation peut être réalisée à l’aide de plusieurs solvants, dans ce cas, le détergent non ionique Triton X-100 est utilisé : il s’intercale en une bicouche phospholipidique, solubilisant la membrane plasmique puis la perturbant14.
Le choix d’anticorps γH2AX et 53BP1 efficaces étant crucial pour le succès de l’immunofluorescence, l’utilisation d’anticorps dont la fiabilité a été prouvée est fortement recommandée. Il est également suggéré d’essayer plusieurs dilutions des anticorps pour identifier la concentration la plus performante.
Comme expériences préliminaires, nous avons étudié différents contrôles afin d’évaluer d’éventuels bruits de fond ou autofluorescences. Notamment, nous avons utilisé, dans différentes expériences, les anticorps primaires uniquement, les anticorps secondaires uniquement, chaque coloration individuellement, et aucune coloration. Comme prévu, en présence d’anticorps primaires/secondaires uniquement, nous n’avons observé aucun foyer, tandis que nous avons observé des taches fluorescentes vertes ou rouges (indiquant la présence de foyers γH2AX ou 53BP1) lorsque nous avons effectué le protocole avec chaque coloration individuellement. En ce qui concerne l’absence de contrôle de coloration, nous avons observé un bruit de fond/autofluorescence, qui se manifeste par une coloration diffuse. Au lieu de cela, après avoir effectué le protocole d’immunofluorescence, les foyers γH2AX ou 53BP1 sont clairement visibles dans les noyaux brun-foncé sous forme de signaux verts ou rouges sous le filtre approprié pour les fluorochromes utilisés (FITC ou TRITC). Ainsi, le bruit de fond/autofluorescence n’influence pas de manière significative l’identification des foyers, également parce que nous avons utilisé des critères spécifiques afin d’évaluer si une tache fluorescente est un foyer approprié (c’est-à-dire que pendant la focalisation du microscope, les foyers γ-H2AX et 53BP1 ne devraient pas être sur le même plan focal que d’autres taches fluorescentes potentiellement présentes à l’extérieur du noyau cellulaire). Ces critères ont été choisis car ils permettent à la fois de réduire la subjectivité et de rendre négligeable l’impact du bruit de fond/autofluorescence.
La bléomycine est un mutagène à base de radicaux qui induit des DSB par l’attaque très spécifique des radicaux libres sur le désoxyribose, d’une manière très similaire à la façon dont le faible rayonnement ionisant (IR) LET agit. Ainsi, la bléomycine est définie comme un agent radiomimétique15. Étant donné qu’une grande quantité de DSB induite par la bléomycine pourrait gravement affecter la prolifération des lymphocytes déclenchant, dans le pire des scénarios, l’activation de l’apoptose, il est suggéré de tester plusieurs concentrations de l’altagène pour identifier une dose pouvant conduire à la formation de DSB sans entraîner de cytotoxicité.
Plusieurs études montrent que la principale voie de réparation des DSB induites par IR est NHEJ, qui est favorisée par la présence de 53BP1 près de la lésion16,17. Cependant, bien qu’une plus grande quantité de foyers 53BP1 puisse se produire après le traitement à la bléomycine, qui agit de manière similaire à l’IR, dans notre étude, nous avons observé une fréquence plus élevée de γH2AX que de foyers 53BP1. Le principal avantage de l’analyse des foyers γH2AX et 53BP1 réside dans la capacité d’évaluer la réponse cellulaire dans des contextes d’exposition ou pathologiques. En effet, il est bien connu que les foyers γH2AX et 53BP1 sont des marqueurs fiables et établis des effets IR18, ainsi que la présence de foyers γH2AX représentent un facteur pronostique important dans plusieurs formes de cancer19, ou, plus généralement, ils consentent à déterminer la capacité des agents ou des produits chimiques à augmenter la présence de DSB. De plus, les foyers γH2AX et 53BP1 peuvent être évalués pour établir une relation possible entre l’augmentation des DSB et une certaine maladie 20,21, pour vérifier une thérapie en termes de réponse au traitement22,23, ou pour estimer la radiosensibilité tumorale 24.
Les dosages des foyers γH2AX et 53BP1 sont largement utilisés pour quantifier les DSB, mais les auteurs doivent souligner que les deux méthodes ont des limites: la principale préoccupation réside dans le fait qu’elles ne détectent pas les DSB elles-mêmes, mais deux facteurs spécifiques impliqués dans les processus de réparation. Ainsi, étant donné que la cinétique de réparation est très variable25, l’interprétation des résultats pourrait être ambiguë.
Cependant, la présente étude indique que l’utilisation de la double immunofluorescence pour quantifier simultanément les foyers γH2AX et 53BP1 pourrait entraîner plusieurs problèmes dans l’interprétation des résultats. Cela est principalement dû à la fois à la présence plus élevée de γH2AX que de 53BP1 sur les sites DSBs et aux faibles niveaux de signaux de fluorescence co-localisés pour les deux marqueurs que nous avons observés après le traitement à la bléomycine. D’autre part, l’histone H2AX reste phosphorylée sur Ser-139 à partir du moment où un DSB apparaît jusqu’à ce qu’il soit réparé, tandis que 53BP1 est une protéine qui est recrutée dans des conditions plus spécifiques, par exemple lorsque seul NHEJ peut être activé, aussi, 53BP1 est fortement dominant pendant la phase G1 du cycle cellulaire25. En outre, 53BP1 peut effectivement avoir été recruté lorsqu’un DSB s’est produit avec γH2AX, mais persiste pendant une période plus courte, et donc la double immunofluorescence est incapable de le localiser et γH2AX simultanément. Cependant, si le chercheur juge plus approprié d’effectuer une double immunofluorescence, pour laquelle nous avons fourni un protocole détaillé et fiable, il est important de considérer que cette méthode peut intrinsèquement conduire à sous-estimer la fréquence réelle de l’événement, comme décrit ci-dessus. Dans le même temps, afin de ne pas surestimer l’événement, il convient d’éviter de compter les foyers γH2AX et 53BP1 co-localisés comme deux points différents car cela indique en effet la présence d’un seul DSB.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants aux donneurs de sang total et à tout le personnel de santé qui a prélevé les échantillons de sang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
References
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S.
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
