Summary
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch den gleichzeitigen Nachweis von γH2AX- und 53BP1-Foci in Interphasenkernen von Bleomycin-behandelten humanen peripheren Lymphozyten dar.
Abstract
Doppelstrangbrüche (DSBs) sind eine der schwersten Läsionen, die in Zellkernen auftreten können, und wenn sie nicht repariert werden, können sie zu schweren Folgen, einschließlich Krebs, führen. Die Zelle ist daher mit komplexen Mechanismen zur Reparatur von DSBs ausgestattet, und diese Signalwege beinhalten Histon H2AX in seiner phosphorylierten Form an Ser-139 (nämlich γH2AX) und das p53-bindende Protein 1 (53BP1). Da beide Proteine an den Stellen von DSBs Herde bilden können, wird die Identifizierung dieser Marker als geeignete Methode angesehen, um beide DSBs und ihre Reparaturkinetik zu untersuchen. Entsprechend den molekularen Prozessen, die zur Bildung von γH2AX- und 53BP1-Foci führen, könnte es sinnvoller sein, ihre Kolokalisation in der Nähe der DSBs zu untersuchen, um einen alternativen Ansatz zu etablieren, der die Quantifizierung von DSBs durch die gleichzeitige Detektion von zwei DNA-Schadensmarkern ermöglicht. Daher zielt dieses Protokoll darauf ab, die genomische Schädigung in humanen Lymphozyten durch den radiomimetischen Wirkstoff Bleomycin durch die Anwesenheit von γH2AX- und 53BP1-Foci in einer dualen Immunfluoreszenz zu untersuchen. Mit dieser Methodik haben wir auch die Variation in der Anzahl der γH2AX- und 53BP1-Foci im Laufe der Zeit beschrieben, als vorläufigen Versuch, die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs zu untersuchen.
Introduction
DNA-Schäden werden kontinuierlich durch Substanzen induziert, die endogen sein können, wie z. B. ROS, die durch den zellulären oxidativen Stoffwechsel erzeugt werden, oder durch exogene, sowohl chemische als auch physikalische Stoffe1. Zu den schädlichsten Läsionen gehören Doppelstrangbrüche (DSBs), die eine grundlegende Rolle bei der genomischen Instabilität spielen, da sie Chromosomenaberrationen verursachen, die wiederum den Prozess der Krebsentstehung in Gang setzen können. Auf diese Weise werden Zellen mit komplexen und effizienten Mechanismen der Reparatur von DSBs ausgestattet2.
Wenn ein DSB auftritt, löst die Zelle die DNA-Schadensantwort (DDR) aus, bei der zusammen mit dem MRE11/RAD50/NBS1-Komplex ATM- oder ATR-Kinasen rekrutiert werden, um andere Proteine zu aktivieren, die den Zellzyklus verlangsamen oder stoppen3. Ein wesentliches Ziel dieser Kinasen ist das Histon H2AX, das auf Ser-139 innerhalb weniger Megabasen aus den DSBs phosphoryliert ist (nämlich γH2AX), wodurch die Rekrutierung verschiedener Reparaturfaktoren wie u.a. BRCA1 und p53-bindendes Protein 1 (53BP1)3 ermöglicht wird. Später wird ein Weg zwischen homologer Rekombination (HR), nicht-homologem Endverknüpfen (NHEJ) oder Single-Strang-Annealing (SSA) ausgelöst, um die DSBs zu reparieren 4,5. Daher ist 53BP1 an der Wahl zwischen HR und NHEJ beteiligt und fördert hauptsächlich die Aktivierung von NHEJ anstelle von HR6. Darüber hinaus können sowohl die phosphorylierte Form des H2AX-Histons als auch von 53BP1 Foci an den Stellen von DSBs bilden. Da diese Foci so lange bestehen bleiben, bis die Integrität des Doppelstrangs wiederhergestellt ist, wird die Beurteilung des Auftretens/Verschwindens von γH2AX- oder 53BP1-Foci innerhalb eines Zeitintervalls als nützliche Methode angesehen, um das Auftreten und die Reparatur von DSBs in einem Zellsystem zu beurteilen 6,7. Da jedoch nach den oben beschriebenen molekularen Prozessen davon auszugehen ist, dass γH2AX- und 53BP1-Foci während DDR 8,9 in der Nähe der DSBs kolokalisiert werden, kann es sinnvoll sein, gleichzeitig das Vorhandensein dieser Marker in einer dualen Immunfluoreszenz nachzuweisen.
Ziel dieses Manuskripts war es daher, die Eignung der simultanen Quantifizierung von γH2AX- und 53BP1-Foci zu evaluieren, um die genomische Schädigung zu untersuchen, die in humanen peripheren Lymphozyten durch den radiomimetischen Wirkstoff Bleomycin induziert wird. Mit der gleichen Methodik versuchten wir auch, die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs gemäß einem zuvor aufgebauten experimentellen Verfahren10 zu beschreiben.
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Protocol
Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Pisa genehmigt, und von jedem Spender wurde eine informierte und unterschriebene Zustimmung eingeholt.
1. Bildung von γH2AX- und 53BP1-Foci
- Probenvorbereitung und erbgutverändernde Behandlung
- Entnahme von Vollblutproben durch Venenpunktion von gesunden erwachsenen Personen in Blutentnahmeröhrchen (z. B. Vacutainer), die Lithiumheparin als Antikoagulans enthalten.
- Um eine ordnungsgemäße Konservierung der Blutprobe zu gewährleisten, müssen Sie innerhalb von 24 Stunden nach der Probenahme mit dem Verfahren beginnen.
- 300 μl der Probe werden in ein Röhrchen gegeben, das 4,7 ml komplettes Medium enthält (0,5 % Penicillin-Streptomycin, 0,75 % Phytohämagglutinin, 10 % FBS zuvor inaktiviert, 88,75 % RPMI 1640).
- Anschließend wird Bleomycinsulfat bis zu einer Endkonzentration von 5 μg/ml zugegeben.
ACHTUNG: Bleomycinsulfat ist ein Mutagen. Vermeiden Sie Hautkontakt und Einatmen. Bereiten Sie die Lösung vor und geben Sie die Probe unter eine Haube. - Richten Sie für jede Probe eine Negativkontrolle (keine Mutagene) ein.
- Legen Sie das Röhrchen für 2 h in einen Thermostat bei 37 °C.
- Fixierung
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 540 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Saugen Sie den Überstand an und suspendieren Sie das Pellet mit Wirbel.
- Fügen Sie 5 ml hypotone Lösung (2,87 g KCl, gelöst in 500 ml deionisiertem Wasser) und 400 μl präfixative Lösung (5:3 Essigsäure: Methanol) hinzu, um eine Hämolyse der roten Blutkörperchen zu bewirken.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 540 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml Methanol bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten, um die Zellen zu fixieren.
- Alternativ können Sie die Zellen bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
- Vorbereitung der Objektträger
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 540 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml einer 3:1-Methanol-Essigsäure-Lösung. Wiederholen Sie diese Schritte noch einmal.
- Zum Schluss zentrifugieren Sie die Lösung erneut bei 540 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Saugen Sie den Überstand wieder an und lassen Sie genügend Lösung (0,5 ml) übrig, um das Pellet zu resuspendieren, pipettieren Sie kräftig, lassen Sie das resuspendierte Zellpellet auf die Objektträger fallen und lassen Sie es an der Luft trocknen. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C.
- Immunfluoreszenz
HINWEIS: Immunfluoreszenz ist eine immunologische Methode zur Identifizierung spezifischer Zellziele, bei der ein primärer Antikörper, der das Ziel selbst bindet, und ein fluoreszierender sekundärer Antikörper, der den primären Antikörper bindet, verwendet wird, der die Lokalisierung des Zielsermöglicht 11. In diesem Fall werden ein monoklonaler Maus-Anti-53BP1 (1:50) und ein polyklonaler Kaninchen-Anti-γH2AX (1:50) als Primärantikörper verwendet, während AlexaFluor568 Anti-Maus (1:400) bzw. DyLight488 Anti-Kaninchen (1:200) als Sekundärantikörper verwendet werden.- Waschen Sie die Objektträger zweimal in 50 ml 1x PBS für 5 Minuten im Coupur-Glas (16 Objektträger hintereinander).
- Bewahren Sie sie dann 30 Minuten lang in Blockierlösung auf (10 ml FBS, 10 ml 10x PBS, 80 ml deionisiertes Wasser, 300 μl Triton-X).
- Geben Sie zu jedem Objektträger 10 μl jeder der beiden Lösungen, die die in der Blockierungslösung gelösten primären Antikörper enthalten. Die Objektträger mit Paraffinband abdecken und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Nach der Inkubation dreimal 5 Minuten lang in 1x PBS waschen.
- Fügen Sie jedem Objektträger 10 μl jeder der beiden Lösungen hinzu, die die in der Blockierungslösung gelösten sekundären Antikörper enthalten. Die Objektträger mit Paraffinband abdecken und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Führen Sie drei Wäschen in 1x PBS für 5 Minuten durch.
- Geben Sie vor dem Zusammenbau 2,5 μl Antifade-Lösung mit DAPI auf die Deckgläser, um die Kerne gegenzufärben.
ANMERKUNG: Um die Herdkinetik zu beurteilen, ist das Verfahren das gleiche wie in 1.1 bis 1.4 beschrieben, wobei zu beachten ist, dass die Zellernte und die duale Immunfluoreszenz um 0 h, nach 2 h nach der Bleomycin-Behandlung und dann, nach der Entfernung des Mutagens, nach 4 h, 6 h und 24 h nach der Behandlung durchgeführt werden.
2. Analyse durch ein Fluoreszenzmikroskop
HINWEIS: "Fluoreszenzmikroskop" bezieht sich auf jedes Mikroskop, das Fluoreszenz verwendet, um ein Bild zu erzeugen. Die Probe wird mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (oder Wellenlängen) beleuchtet, das von den Fluorophoren absorbiert wird, wodurch sie Licht längerer Wellenlängen emittieren12. AlexaFluor568 und DyLight 488 absorbieren Licht von ca. 568 bzw. 488 nm und emittieren Licht von 603 bzw. 520 nm. So sind sie als rote oder grüne Fluoreszenz mit einem TRITC- bzw. FITC-Filter sichtbar.
- Bewerten Sie das Vorhandensein von Brennpunkten in jeder Objektträger unter einem 100-fachen Immersionsobjektiv (Abbildung 1).
- Bewerten Sie 200 Kerne pro Objektträger und zählen Sie die Anzahl der γH2AX/53BP1-Foci in jedem Kern.
- Express-Ergebnisse in Bezug auf die durchschnittliche Anzahl von Foci pro Gesamtkern bewertet. Dazu gehören sowohl γH2AX/53BP1-positive (mit mindestens einem Fluoreszenzsignal) als auch negative (ohne Fluoreszenzsignal) Kerne.
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Representative Results
Die durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse peripherer Lymphozyten gewonnenen Daten ermöglichen es uns, drei Hauptaspekte zu bewerten: die Wirksamkeit der Bleomycin-Behandlung bei der Erhöhung der Anzahl der γH2AX- und 53BP1-Foci (und damit der DSBs) aufgrund ihrer mutagenen Wirkung, das Ausmaß, in dem beide Foci am Ort der DSBs kolokalisiert sind, und der zeitliche Verlauf von γH2AX- und 53BP1-Foci, um die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs abzugrenzen. Erwartungsgemäß wurde eine sehr höhere Häufigkeit sowohl von γH2AX- als auch von 53BP1-Foci zwischen unbehandelten und behandelten Zellen beobachtet, was bestätigt, dass Bleomycin die Bildung von DSBs in peripheren Lymphozyten induziert (Abbildung 2).
Ein großer Unterschied wurde in der Anzahl der Brennpunkte der beiden Marker beobachtet; Insbesondere waren γH2AX-Foci zahlreicher als 53BP1-Foci, was darauf hindeutet, dass eine Kolokalisation nicht immer auftritt und von mehreren Faktoren abhängen kann (Abbildung 3).
In Bezug auf die Reparaturkinetik von DSBs ist es zunächst wichtig zu betonen, dass die eigentliche Reparatur von Brennpunkten vor dem ersten gewählten Zeitpunkt, also 2 h, beginnen kann und dass wir zu verschiedenen Zeitpunkten sowohl neu gebildete als auch zuvor gebildete und noch nicht reparierte Herde beobachten können.
Unter Berücksichtigung des zuvor Gesagten zeigte der zeitliche Verlauf der γH2AX- und 53BP1-Foci über die Zeit ein unterschiedliches Verhalten, obwohl sie zur gleichen Funktion beitragen. Die γH2AX-Foci stiegen nach 2 Stunden nach der Behandlung an und setzten dann mit einer progressiven Reduktion ein, ohne jedoch den Kontrollwert 24 h nach der Behandlung zu erreichen. Bei der Varianz stieg die Häufigkeit von 53BP1-Foci bis 4 h nach der Behandlung an, nahm dann nach 6 h ab und kehrte 24 h nach der Behandlung auf den höchsten Wert zurück (Abbildung 4).
Abbildung 1: Duale Immunfluoreszenz in humanen peripheren Lymphozyten für γH2AX und 53BP1: (A) Kerne ohne γH2AX- und 53BP1-Foci vor der Bleomycin-Behandlung, (B) und (C) Kerne mit unterschiedlichen Mengen an γH2AX- und 53BP1-Foci aufgrund der Bleomycin-Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vergleich zwischen unbehandelten und Bleomycin-behandelten (5 μg/ml) Lymphozyten für die beiden DSB-Marker. Fehlerbalken stellen SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Vergleich zwischen der Gesamtmenge (sowohl spontan als auch mutageninduziert) von γH2AX- und 53BP1-Foci. Fehlerbalken stellen SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: γH2AX- und 53BP1-Focikinetik. 0 h, 2 h, 4h, 6 h und 24 h stehen für die verschiedenen Zeitpunkte, zu denen Lymphozyten geerntet wurden; Fehlerbalken stellen SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Immunfluoreszenzanalyse von γH2AX- und 53BP1-Foci ist eine geeignete Methode zur Beurteilung genomischer Schäden in Interphasenkernen eines Zellsystems. Dieses Verfahren weist mehrere kritische Punkte auf, die das Ergebnis der Experimente beeinflussen können, vor allem die bei der Fixierung und Permeabilisierung verwendeten Wirkstoffe, die Art der Antikörper und ihre Verdünnungsfaktoren sowie die Konzentration des Mutagens.
Die Aufrechterhaltung der Proteinintegrität ist von grundlegender Bedeutung, da die Immunfluoreszenzmethode erwartet, Antigene zu identifizieren, bei denen es sich hauptsächlich um Proteine handelt. In diesem Protokoll wird Methanol verwendet, um Lymphozyten zu fixieren. Dieser Schritt ist besonders wichtig, da Alkohol wirkt, indem er Wasser verdrängt und die Ausfällung löslicher Proteine verursacht, während die anderen nicht fixierten Zellbestandteile durch Waschen in einer salzhaltigen Pufferlösung wie PBS13 entfernt werden können.
Eine weitere wichtige Passage ist die Permeabilisierung, die durch eine Blockierungslösung durchgeführt wird, die in diesem Fall sowohl eine Permeabilisierung als auch eine Blockierung ermöglicht. Die Blockierung erfolgt durch Zugabe von FBS zur Lösung: Es bindet die Proteine in der Probe und verhindert, dass Antikörper an das falsche Ziel binden, da die Bindung zwischen FBS und dem spezifischen Ziel des Antikörpers später aufgrund der hohen Affinität zwischen dem Antikörper und dem Ziel selbst gebrochen werden kann. Die Permeabilisierung kann mit mehreren Lösungsmitteln durchgeführt werden, in diesem Fall wird das nichtionische Detergens Triton X-100 verwendet: Es interkaliert in eine Phospholipid-Doppelschicht, löst die Plasmamembran auf und bricht sie dannauf 14.
Da die Wahl effizienter γH2AX- und 53BP1-Antikörper entscheidend für den Erfolg der Immunfluoreszenz ist, wird die Verwendung von Antikörpern mit nachgewiesener Zuverlässigkeit dringend empfohlen. Es wird auch empfohlen, mehrere Verdünnungen der Antikörper auszuprobieren, um die leistungsstärkste Konzentration zu ermitteln.
Als Vorversuche untersuchten wir verschiedene Kontrollen, um mögliches Hintergrundrauschen oder Autofluoreszenz zu beurteilen. Bemerkenswert ist, dass wir in verschiedenen Experimenten nur die primären Antikörper, nur die sekundären Antikörper, jede Färbung einzeln und keine Färbung verwendet haben. Wie erwartet, beobachteten wir nur in Gegenwart von primären/sekundären Antikörpern keinen Fokus, während wir entweder grüne oder rote fluoreszierende Flecken beobachteten (was auf das Vorhandensein von γH2AX- oder 53BP1-Foci hindeutet), als wir das Protokoll mit jeder Färbung einzeln durchführten. In Bezug auf keine Färbekontrollen beobachteten wir Hintergrundrauschen/Autofluoreszenz, das sich durch diffuse Färbung manifestiert. Stattdessen sind nach Durchführung des Immunfluoreszenzprotokolls γH2AX- oder 53BP1-Foci in den braun-dunklen Kernen als grüne oder rote Signale unter dem entsprechenden Filter für die verwendeten Fluorochrome (FITC oder TRITC) deutlich sichtbar. Daher hat Hintergrundrauschen/Autofluoreszenz keinen signifikanten Einfluss auf die Identifizierung von Brennpunkten, auch weil wir bestimmte Kriterien verwendet haben, um zu beurteilen, ob ein fluoreszierender Punkt ein geeigneter Fokus ist (d.h. während der Fokussierung des Mikroskops sollten sich γ-H2AX- und 53BP1-Brennpunkte nicht auf derselben Fokusebene wie andere Fluoreszenzflecken befinden, die möglicherweise außerhalb des Zellkerns vorhanden sind). Diese Kriterien wurden gewählt, da sie es uns ermöglichen, die Subjektivität zu reduzieren und die Auswirkungen von Hintergrundrauschen/Autofluoreszenz zu vernachlässigen.
Bleomycin ist ein radikalbasiertes Mutagen, das DSBs durch den hochspezifischen Angriff der freien Radikale auf Desoxyribose induziert, ähnlich wie die ionisierende Strahlung (IR) mit niedrigem LET wirkt. Somit ist Bleomycin als radiomimetisches Mittel15 definiert. Da eine große Menge von Bleomycin-induzierten DSBs die Proliferation von Lymphozyten stark beeinträchtigen und im schlimmsten Fall die Aktivierung der Apoptose auslösen könnte, wird empfohlen, mehrere Konzentrationen des Mutagens zu testen, um eine Dosis zu identifizieren, die zur Bildung von DSBs führen kann, ohne dass es zu einer Zytotoxizität kommt.
Mehrere Studien zeigen, dass der Hauptweg zur Reparatur von IR-induzierten DSBs NHEJ ist, das durch das Vorhandensein von 53BP1 in der Nähe der Läsion gefördert wird16,17. Obwohl nach der Behandlung mit Bleomycin, das ähnlich wie IR wirkt, eine größere Menge an 53BP1-Foci zu erwarten ist, beobachteten wir in unserer Studie eine höhere Häufigkeit von γH2AX- als von 53BP1-Foci. Der Hauptvorteil der γH2AX- und 53BP1-Foci-Analyse liegt in der Fähigkeit, die zelluläre Antwort entweder in Expositions- oder pathologischen Kontexten zu bewerten. Tatsächlich ist bekannt, dass γH2AX- und 53BP1-Foci zuverlässige und etablierte Marker für IR-Effekte sind18, und das Vorhandensein von γH2AX-Foci stellt einen wichtigen prognostischen Faktor bei mehreren Krebsformendar 19, oder, allgemeiner, sie stimmen zu, die Fähigkeit von Wirkstoffen oder Chemikalien zu bestimmen, das Auftreten von DSBs zu erhöhen. Darüber hinaus können γH2AX- und 53BP1-Herde ausgewertet werden, um einen möglichen Zusammenhang zwischen DSB-Anstieg und einer bestimmten Erkrankung festzustellen20,21, eine Therapie in Bezug auf das Ansprechen auf die Behandlung zu verifizieren22,23 oder die Tumorstrahlenempfindlichkeitabzuschätzen 24.
γH2AX- und 53BP1-Foci-Assays werden häufig verwendet, um DSBs zu quantifizieren, die Autoren müssen jedoch betonen, dass beide Methoden Einschränkungen haben: Die Hauptsorge besteht in der Tatsache, dass sie nicht DSBs selbst nachweisen, sondern zwei spezifische Faktoren, die an Reparaturprozessen beteiligt sind. Wenn man also bedenkt, dass die Reparaturkinetik sehr variabel ist25, könnte die Interpretation der Ergebnisse mehrdeutig sein.
Die vorliegende Studie deutet jedoch darauf hin, dass die Verwendung von dualer Immunfluoreszenz zur gleichzeitigen Quantifizierung von γH2AX- und 53BP1-Foci zu mehreren Problemen bei der Interpretation der Ergebnisse führen könnte. Dies ist hauptsächlich auf die höhere Präsenz von γH2AX als 53BP1 an DSBs-Stellen und die geringen Mengen an kolokalisierten Fluoreszenzsignalen für die beiden Marker zurückzuführen, die wir nach der Behandlung mit Bleomycin beobachtet haben. Auf der anderen Seite bleibt Histon H2AX an Ser-139 phosphoryliert, von dem Zeitpunkt an, an dem ein DSB auftritt, bis es repariert wird, während 53BP1 ein Protein ist, das unter spezifischeren Bedingungen rekrutiert wird, z. B. wenn nur NHEJ aktiviert werden kann, außerdem ist 53BP1 während der G1-Phase des Zellzyklus25 stark dominant. Darüber hinaus könnte 53BP1 tatsächlich rekrutiert worden sein, wenn ein DSB zusammen mit γH2AX aufgetreten ist, aber für eine kürzere Zeit persistiert, so dass eine duale Immunfluoreszenz nicht in der Lage ist, es und γH2AX gleichzeitig zu lokalisieren. Wenn der Forscher es jedoch für angemessener hält, eine duale Immunfluoreszenz durchzuführen, für die wir ein detailliertes und zuverlässiges Protokoll zur Verfügung gestellt haben, ist es wichtig zu bedenken, dass diese Methode von Natur aus dazu führen kann, dass die wahre Häufigkeit des Ereignisses unterschätzt wird, wie oben beschrieben. Um das Ereignis nicht zu überschätzen, sollte es gleichzeitig vermieden werden, die kolokalisierten γH2AX- und 53BP1-Foci als zwei verschiedene Flecken zu zählen, da dies tatsächlich auf das Vorhandensein von nur einem DSB hinweist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken den Vollblutspendern und dem gesamten Gesundheitspersonal, das die Blutproben entnommen hat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
References
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S.
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
