Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65472
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרות ותיקון של פריצות דו-גדילי DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעינים בין-פאזיים של לימפוציטים היקפיים אנושיים שטופלו בבלומיצין.

Abstract

שברי גדיל כפול (DSB) הם אחד הנגעים החמורים ביותר שיכולים להתרחש בגרעין התא, ואם לא יתוקנו, הם יכולים להוביל לתוצאות חמורות, כולל סרטן. התא, אם כן, מסופק עם מנגנונים מורכבים לתיקון DSBs, ומסלולים אלה כוללים היסטון H2AX בצורתו הזרחנית ב- Ser-139 (כלומר γH2AX) וחלבון קושר p53 1 (53BP1). מכיוון ששני החלבונים יכולים ליצור מוקדים באתרי DSBs, זיהוי סמנים אלה נחשב לשיטה מתאימה לחקור הן את DSB והן את קינטיקה התיקון שלהם. על פי התהליכים המולקולריים המובילים להיווצרות מוקדי γH2AX ו-53BP1, זה יכול להיות שימושי יותר לחקור את הלוקליזציה המשותפת שלהם ליד ה-DSB על מנת להקים גישה חלופית המאפשרת לכמת DSB על ידי זיהוי סימולטני של שני סמני נזק לדנ"א. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הנזק הגנומי הנגרם בלימפוציטים אנושיים על ידי הסוכן הרדיומימטי בלומיצין באמצעות נוכחות של מוקדי γH2AX ו- 53BP1 באימונופלואורסנציה כפולה. באמצעות מתודולוגיה זו, תיארנו גם את השונות במספר מוקדי γH2AX ו-53BP1 לאורך זמן, כניסיון ראשוני לחקור את קינטיקה התיקון של DSB המושרה על ידי בלומיצין.

Introduction

נזק לדנ"א נגרם באופן מתמשך על ידי חומרים שיכולים להיות אנדוגניים, כגון ROS שנוצר על ידי מטבוליזם חמצוני תאי, או אקסוגני, הן כימיקלים והן פיזיים1. בין הנגעים המזיקים ביותר, שברים דו-גדיליים (DSB) ממלאים תפקיד בסיסי בתרומה לאי יציבות גנומית, שכן הם גורמים לסטיות כרומוזומים שבתורן יכולות להתחיל את תהליך הקרצינוגנזה. לפיכך, תאים מסופקים עם מנגנונים מורכבים ויעילים של DSB תיקון2.

כאשר DSB מתרחש, התא מפעיל את תגובת הנזק לדנ"א (DDR) שבה, יחד עם קומפלקס MRE11/RAD50/NBS1, קינאזות ATM או ATR מגויסות כדי להפעיל חלבונים אחרים שמאטים או עוצרים את מחזור התא3. מטרה חיונית של קינאזות אלה היא היסטון H2AX, אשר פוספורילציה על Ser-139 בתוך כמה מגה-בסיסים מן DSB (כלומר γH2AX), ובכך מאפשר גיוס של מספר גורמי תיקון כגון, בין היתר, BRCA1 ו p53 קושר חלבון 1 (53BP1)3. מאוחר יותר, מסלול אחד בין רקומבינציה הומולוגית (HR), חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ), או חישול חד-גדילי (SSA) מופעל כדי לתקן את DSBs 4,5. לכן, 53BP1 מעורב בהכתבת הבחירה בין HR או NHEJ, בעיקר קידום ההפעלה של NHEJ ולא HR6. יתר על כן, הן הצורה הזרחנית של היסטון H2AX והן 53BP1 יכולות ליצור מוקדים באתרי DSB. מכיוון שמוקדים אלה נמשכים עד לשחזור שלמות הגדיל הכפול, הערכת המראה / היעלמות של מוקדי γH2AX או 53BP1 במרווח זמן נחשבת לשיטה שימושית להערכת המופע והתיקון של DSB במערכת התא 6,7. עם זאת, על פי התהליכים המולקולריים שתוארו לעיל, מכיוון שמוקדי γH2AX ו- 53BP1 צפויים להתמקם יחד ליד ה- DSB במהלך DDR8,9, זה יכול להיות שימושי לזהות בו זמנית את נוכחותם של סמנים אלה באימונופלואורסנציה כפולה.

לפיכך, מטרת כתב היד הייתה להעריך את התאמתם של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בו זמנית כדי להעריך את הנזק הגנומי שנגרם בלימפוציטים היקפיים אנושיים על ידי הסוכן הרדיומימטי בלומיצין. באמצעות אותה מתודולוגיה, ניסינו גם להגדיר קינטיקה של תיקון של DSB המושרה על ידי בלומיצין על פי הליך ניסיוני10 שהוקם בעבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקר אושר על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת פיזה, והתקבלה הסכמה מדעת וחתומה מכל תורם.

1. היווצרות מוקדי γH2AX ו- 53BP1

  1. הכנת דגימות וטיפול מוטגני
    1. איסוף דגימות דם שלמות על ידי ניקור מאנשים בוגרים בריאים בצינורות איסוף דם (למשל, Vacutainer) המכילים ליתיום הפרין כנוגד קרישה.
    2. על מנת להבטיח שימור דגימת דם תקין, יש להתחיל את ההליך תוך 24 שעות מרגע הדגימה.
    3. הוסף 300 μL של הדגימה לצינור המכיל 4.7 מ"ל של מדיום מלא (0.5% פניצילין-סטרפטומיצין, 0.75% phytohemagglutinin, 10% FBS מושבת בעבר, 88.75% RPMI 1640).
    4. לאחר מכן הוסיפו בלומיצין סולפט לריכוז סופי של 5 מק"ג/מ"ל.
      זהירות: בלומיצין סולפט הוא מוטגן. יש להימנע ממגע עם העור ומשאיפה. הכינו את הפתרון והוסיפו את הדגימה מתחת למכסה המנוע.
    5. עבור כל דגימה, הגדר בקרה שלילית (היעדר mutagen).
    6. הניחו את הצינור בתרמוסטט בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים.
  2. קיבוע
    1. דגימות צנטריפוגות ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה עם מערבולת.
    3. הוסף 5 מ"ל של תמיסה היפוטונית (2.87 גרם של KCl מומס ב 500 מ"ל של מים deionized) ו 400 μL של תמיסה מראש קיבוע (5: 3 חומצה אצטית: מתנול) כדי לגרום המוליזה של כדוריות דם אדומות.
    4. דגימות צנטריפוגות ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל מתנול בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות כדי לתקן את התאים.
    6. לחלופין, אחסנו את התאים בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  3. הכנת שקופיות
    1. דגימות צנטריפוגות ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של מתנול 3:1: תמיסת חומצה אצטית. חזור על שלבים אלה פעם נוספת.
    3. בסוף, צנטריפוגה את התמיסה שוב ב 540 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. שאפו שוב את הסופרנאטנט והשאירו מספיק תמיסה (0.5 מ"ל) כדי להשעות מחדש את הכדורית, פיפטה במרץ, להפיל את גלולת התא המרחפת על המגלשות ולייבש באוויר. אחסן את השקופיות ב- 4 ° C.
  4. אימונופלואורסנציה
    הערה: אימונופלואורסנציה היא שיטה אימונולוגית לזיהוי מטרות תאים ספציפיות באמצעות נוגדן ראשוני הקושר את המטרה עצמה ונוגדן משני פלואורסצנטי הקושר את הראשוני המאפשר למקם את המטרה11. במקרה זה, עכבר חד שבטי anti-53BP1 (1:50) ו ארנב רב שבטי anti-γH2AX (1:50) משמשים נוגדנים ראשוניים, בעוד AlexaFluor568 נגד עכבר (1:400) ו DyLight488 נגד ארנב (1:200) משמשים נוגדנים משניים, בהתאמה.
    1. שטפו את המגלשות פעמיים ב-50 מ"ל של 1x PBS במשך 5 דקות בצנצנת קופלין (16 שקופיות גב אל גב).
    2. לאחר מכן שמור אותם למשך 30 דקות בתמיסת חסימה (10 מ"ל של FBS, 10 מ"ל של 10x PBS, 80 מ"ל של מים נטולי יונים, 300 מיקרוליטר של Triton-X).
    3. הוסף לכל שקופית 10 μL של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים הראשוניים המומסים בתמיסת החסימה. מכסים את המגלשות בסרט פרפין ודגרים בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
    4. לאחר הדגירה, יש לבצע שלוש שטיפות ב-1x PBS במשך 5 דקות.
    5. הוסף לכל שקופית 10 μL של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים המשניים המומסים בתמיסת החסימה. מכסים את המגלשות בסרט פרפין ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
    6. בצעו שלוש שטיפות ב-1x PBS במשך 5 דקות.
    7. הוסף 2.5 μL של תמיסת אנטי-דהייה עם DAPI על הכיסויים לפני ההרכבה כדי להכתים את הגרעינים.
      הערה: על מנת להעריך קינטיקה מוקדית, ההליך זהה למתואר מ 1.1 ל 1.4, וציין כי קצירת תאים ואת immunofluorescence כפול מבוצעים ב 0 שעות, לאחר 2 שעות לאחר טיפול bleomycin ולאחר מכן, לאחר הסרת mutagen, ב 4 שעות, 6 שעות, ו 24 שעות לאחר הטיפול.

2. ניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הערה: "מיקרוסקופ פלואורסצנטי" מתייחס לכל מיקרוסקופ המשתמש בפלואורסצנטיות כדי ליצור תמונה. הדגימה מוארת באור מסוים (או אורכי גל) הנבלע על ידי הפלואורופורים, מה שגורם להם לפלוט אור באורכי גל ארוכים יותר12. AlexaFluor568 ו-DyLight 488 בולעים אור של כ-568 ו-488 ננומטר ופולטים אור של 603 ו-520 ננומטר, בהתאמה. לכן, הם נראים כמו פלואורסצנטיות אדומה או ירוקה באמצעות מסנן TRITC או FITC, בהתאמה.

  1. דרג את נוכחות המוקדים בכל שקופית תחת יעד טבילה של 100x (איור 1).
  2. הניחו 200 גרעינים בכל שקופית וספרו את מספר מוקדי γH2AX/53BP1 בכל גרעין.
  3. תוצאות אקספרס במונחים של מספר המוקדים הממוצע לכל סך הגרעינים שדורגו. אלה כוללים גרעיני γH2AX/53BP1 חיוביים (מראים לפחות אות פלואורסצנטי אחד) ושליליים (לא מראים אות פלואורסצנטי אחד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נתונים המתקבלים על ידי ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי של לימפוציטים היקפיים מאפשרים לנו להעריך שלושה היבטים עיקריים: היעילות של טיפול בלומיצין בהגדלת מספר מוקדי γH2AX ו- 53BP1 (ולכן של DSBs) בשל השפעתו המוטגנית, באיזו מידה שני מוקדים לוקליזציה משותפת באתר של DSBs, ואת מהלך הזמן של γH2AX ו 53BP1 מוקדים כדי לשרטט את קינטיקה תיקון של DSB המושרה בלומיצין. כצפוי, נצפתה תדירות גבוהה מאוד של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בין תאים לא מטופלים לתאים מטופלים, מה שמאשר כי בלומיצין גורם להיווצרות DSB בלימפוציטים היקפיים (איור 2).

הבדל גדול נצפה במספר המוקדים של שני הסמנים; בפרט, מוקדי γH2AX היו רבים יותר ממוקדים של 53BP1, מה שמצביע על כך שלוקליזציה משותפת לא תמיד מתרחשת ויכולה להיות תלויה בגורמים מרובים (איור 3).

לגבי קינטיקה תיקון של DSBs, קודם כל, חשוב להדגיש כיצד תיקון בפועל של מוקדים יכול להתחיל לפני נקודת הזמן הראשונה שנבחרה, שהיא 2 שעות, וכי בנקודות זמן שונות, אנו יכולים לראות מוקדים חדשים שנוצרו כמו גם מוקדים שנוצרו בעבר ועדיין לא תוקנו.

אם ניקח בחשבון את מה שנאמר קודם לכן, מהלך הזמן של γH2AX ו 53BP1 מוקדים לאורך זמן הראה התנהגות שונה למרות שהם תורמים לאותה פונקציה. מוקדי γH2AX גדלו לאחר שעתיים לאחר הטיפול, ואז הם החלו בהפחתה הדרגתית, מבלי להגיע לערך הבקרה לאחר 24 שעות לאחר הטיפול. בשונות, התדירות של מוקדי 53BP1 עלתה עד 4 שעות לאחר הטיפול, ואז ירדה לאחר 6 שעות וחזרה לערך הגבוה ביותר 24 שעות לאחר הטיפול (איור 4).

Figure 1
איור 1: אימונופלואורסנציה כפולה בלימפוציטים היקפיים אנושיים עבור γH2AX ו-53BP1: (A) גרעינים ללא מוקדי γH2AX ו-53BP1 לפני טיפול בבלומיצין, (B) ו-(C) גרעינים עם כמויות שונות של מוקדי γH2AX ו-53BP1 כתוצאה מטיפול בבלומיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השוואה בין לימפוציטים שלא טופלו לבין לימפוציטים שטופלו בבלומיצין (5 מיקרוגרם/מ"ל) עבור שני סמני DSB. קווי שגיאה מייצגים SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: השוואה בין הכמות הכוללת (הן הספונטנית והן המושרה על ידי מוטגן) של מוקדי γH2AX ו-53BP1. קווי שגיאה מייצגים SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: קינטיקה של מוקדי γH2AX ו-53BP1. 0 שעות, 2 שעות, 4 שעות, 6 שעות ו-24 שעות מייצגות את הזמנים השונים שבהם נקצרו; קווי שגיאה מייצגים SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח אימונופלואורסנציה של מוקדי γH2AX ו-53BP1 הוא שיטה מתאימה להערכת נזק גנומי בגרעינים בין-פאזיים של מערכת תאים. הליך זה יש כמה נקודות קריטיות שיכולות להשפיע על התוצאה של הניסויים, בעיקר, הסוכנים המשמשים קיבוע וחדירה, סוג הנוגדנים וגורמי דילול שלהם, ואת ריכוז של mutagen.

שמירה על שלמות החלבון היא בסיסית שכן שיטת immunofluorescence מצפה לזהות אנטיגנים כי הם בעיקר חלבונים. בפרוטוקול זה, מתנול משמש לתיקון לימפוציטים. שלב זה חשוב במיוחד מכיוון שאלכוהול פועל על ידי החלפת מים וגרימת משקעים של חלבונים מסיסים, בעוד ששאר הרכיבים התאיים שאינם קבועים ניתנים להסרה על ידי שטיפה בתמיסת חיץ מלוחים, כגון PBS13.

מעבר מפתח נוסף הוא חלחול המבוצע באמצעות פתרון חסימה, אשר במקרה זה מאפשר הן חדירה וחסימה. החסימה מתבצעת על ידי הוספת FBS לתמיסה: היא קושרת את החלבונים בדגימה ומונעת מהנוגדנים לקשור את המטרה הלא נכונה, שכן הקשר בין FBS למטרה הספציפית של הנוגדן יכול להישבר מאוחר יותר בשל הזיקה הגבוהה בין הנוגדן למטרה עצמה. חדירות יכולה להתבצע באמצעות מספר ממסים, במקרה זה, דטרגנט nonיוני Triton X-100 משמש: זה intercalates לתוך דו שכבה פוספוליפיד, מסיס את קרום הפלזמה ולאחר מכן משבש אותו14.

מכיוון שהבחירה בנוגדנים יעילים של γH2AX ו- 53BP1 חיונית להצלחת האימונופלואורסצנטיות, מומלץ בחום להשתמש בנוגדנים בעלי אמינות מוכחת. מומלץ גם לנסות מספר דילולים של הנוגדנים כדי לזהות את הריכוז בעל הביצועים הטובים ביותר.

כניסויים מקדימים, חקרנו בקרות שונות כדי להעריך רעשי רקע אפשריים או אוטופלואורסצנטיות. יש לציין כי השתמשנו בניסויים שונים בנוגדנים הראשוניים בלבד, בנוגדנים המשניים בלבד, כל כתם בנפרד וללא כתמים. כצפוי, בנוכחות נוגדנים ראשוניים/משניים בלבד, לא צפינו במיקוד כלשהו, בעוד שצפינו בכתמים פלואורסצנטיים ירוקים או אדומים (המעידים על נוכחות מוקדי γH2AX או 53BP1) כאשר ביצענו את הפרוטוקול עם כל כתם בנפרד. לגבי היעדר בקרות צביעה, הבחנו ברעשי רקע / אוטופלואורסצנטיות, המתבטאת בכתמים מפוזרים. במקום זאת, לאחר ביצוע פרוטוקול immunofluorescence, γH2AX או 53BP1 מוקדים נראים בבירור בגרעינים חומים-כהים כאותות ירוקים או אדומים תחת המסנן המתאים עבור fluorochromes בשימוש (FITC או TRITC). לכן, רעשי רקע / אוטופלואורסצנטיות אינם משפיעים באופן משמעותי על זיהוי מוקדים, גם משום שהשתמשנו בקריטריונים ספציפיים כדי להעריך אם נקודה פלואורסצנטית אחת היא מוקד נכון (כלומר, במהלך מיקוד המיקרוסקופ, מוקדים γ-H2AX ו- 53BP1 לא צריכים להיות באותו מישור מוקד של נקודות פלואורסצנטיות אחרות שעשויות להימצא מחוץ לגרעין התא). קריטריונים אלה נבחרו מכיוון שהם מאפשרים לנו להפחית את הסובייקטיביות ולהפוך את ההשפעה של רעשי רקע / אוטופלואורסצנטיות לזניחה.

בלומיצין הוא מוטגן מבוסס רדיקלים הגורם ל-DSB על ידי מתקפת רדיקלים חופשיים מאוד ספציפית על דאוקסיריבוז, באופן דומה מאוד לאופן שבו קרינה מייננת LET (IR) נמוכה. לפיכך, בלומיצין מוגדר כסוכן רדיומימטי15. מאחר שכמות גדולה של DSB המושרה על ידי בלומיצין עלולה להשפיע באופן חמור על התפשטות הלימפוציטים ולהפעיל, בתרחיש הגרוע ביותר, את הפעלת אפופטוזיס, מומלץ לבדוק מספר ריכוזים של המוטגן כדי לזהות מינון שיכול להוביל להיווצרות DSB מבלי לגרום לציטוטוקסיות.

מספר מחקרים מראים כי המסלול העיקרי לתיקון DSB המושרה IR הוא NHEJ, אשר מקודם על ידי נוכחות של 53BP1 ליד הנגע16,17. עם זאת, למרות שניתן לצפות לכמות גדולה יותר של מוקדי 53BP1 לאחר טיפול בבלומיצין, הפועל באופן דומה ל- IR, במחקר שלנו, ראינו תדירות גבוהה יותר של γH2AX מאשר 53BP1 מוקדים. היתרון העיקרי של ניתוח מוקדי γH2AX ו- 53BP1 מסתמך על היכולת להעריך את התגובה התאית בחשיפה או בהקשרים פתולוגיים. למעשה, ידוע היטב כי מוקדי γH2AX ו- 53BP1 הם סמנים אמינים ומבוססים של השפעות IR18, כמו גם נוכחותם של מוקדי γH2AX מייצגים גורם פרוגנוסטי חשוב במספר צורות של סרטן19, או, באופן כללי יותר, הם מסכימים לקבוע את יכולתם של סוכנים או כימיקלים להגביר את התרחשות DSBs. יתר על כן, ניתן להעריך מוקדי γH2AX ו- 53BP1 כדי לבסס קשר אפשרי בין עלייה ב- DSB לבין מחלה מסוימת 20,21, לאמת טיפול במונחים של תגובה לטיפול 22,23, או להעריך רגישות לקרינה של הגידול 24.

בדיקות מוקדים γH2AX ו- 53BP1 נמצאות בשימוש נרחב על מנת לכמת DSBs, עם זאת, על המחברים להדגיש כי לשתי השיטות יש מגבלות: הדאגה העיקרית מורכבת מכך שהם אינם מזהים DSB עצמם, אלא שני גורמים ספציפיים המעורבים בתהליכי תיקון. לכן, בהתחשב בכך קינטיקה תיקון הוא משתנה מאוד25, הפרשנות של התוצאות יכול להיות מעורפל.

עם זאת, המחקר הנוכחי מצביע על כך שהשימוש באימונופלואורסנציה כפולה כדי לכמת בו זמנית מוקדי γH2AX ו- 53BP1 עלול להוביל למספר בעיות בפרשנות התוצאות. זה נובע בעיקר הן מהנוכחות הגבוהה יותר של γH2AX מאשר 53BP1 באתרי DSB והן מהרמות הנמוכות של אותות פלואורסצנטיים מקומיים עבור שני הסמנים שראינו לאחר טיפול בבלומיצין. מצד שני, היסטון H2AX נשאר פוספורילציה על Ser-139 מרגע הופעת DSB ועד שהוא מתוקן, בעוד 53BP1 הוא חלבון המגויס בתנאים ספציפיים יותר, למשל כאשר רק NHEJ יכול להיות מופעל, גם, 53BP1 הוא דומיננטי מאוד במהלך שלב G1 של מחזורהתא 25. יתר על כן, ייתכן ש-53BP1 אכן גויס כאשר DSB התרחש יחד עם γH2AX, אך נמשך זמן קצר יותר, ולכן אימונופלואורסנציה כפולה אינה מסוגלת למקם אותו ואת γH2AX בו זמנית. עם זאת, אם החוקר מוצא לנכון יותר לבצע immunofluorescence כפול, אשר סיפקנו פרוטוקול מפורט ואמין, חשוב לשקול כי שיטה זו יכולה מטבעה להוביל להערכת חסר של התדירות האמיתית של האירוע, כפי שתואר לעיל. יחד עם זאת, כדי לא להעריך יתר על המידה את האירוע, יש להימנע מספירת מוקדי γH2AX ו- 53BP1 כשני מוקדים שונים מכיוון שהיא מצביעה על נוכחות של DSB אחד בלבד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לכל תורמי הדם ולכל אנשי הצוות הרפואי שלקחו את דגימות הדם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) Invitrogen A21124 53BP1 secondary antibody
Bleoprim Sanofi bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X Euroclone ECB3001D antibiotics for culture medium
PBS 10X Termofisher 14200075 Phosphate-buffered saline
FBS Euroclone EC20180L Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated Termofisher #35552 γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody Merck MAB 3802 53BP1 primary antibody
Labophot 2 Nikon Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody Cell Signaling #2577 γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin Termofisher R30852801 component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640 Euroclone ECB9006L Culture medium
Triton-X100 Sigma T9284 Nonionic detergent for permeabilization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 197
אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Falaschi, A., Chiaramonte, A.,… More

Falaschi, A., Chiaramonte, A., Testi, S., Scarpato, R. Dual Immunofluorescence of γH2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes. J. Vis. Exp. (197), e65472, doi:10.3791/65472 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter