Summary
このプロトコルは、ブレオマイシン処理されたヒト末梢リンパ球の間期核におけるγH2AXおよび53BP1病巣の同時検出を通じて、DNA二本鎖切断の形成および修復を評価する方法を提示する。
Abstract
二本鎖切断(DSB)は、細胞核に発生する可能性のある最も重篤な病変の1つであり、修復されない場合、癌を含む重篤な結果につながる可能性があります。したがって、細胞はDSBを修復するための複雑なメカニズムを備えており、これらの経路には、Ser-139(すなわちγH2AX)およびp53結合タンパク質1(53BP1)のリン酸化形態のヒストンH2AXが含まれます。両方のタンパク質はDSBの部位で病巣を形成する可能性があるため、これらのマーカーの同定は、DSBとその修復速度論の両方を研究するのに適した方法と考えられています。γH2AXと53BP1病巣の形成につながる分子プロセスによると、2つのDNA損傷マーカーを同時に検出することによってDSBを定量できる代替アプローチを設定するために、DSB付近でのそれらの共局在を調べることがより有用である可能性があります。したがって、このプロトコルは、二重免疫蛍光におけるγH2AXおよび53BP1病巣の存在を介して、放射線模倣剤ブレオマイシンによってヒトリンパ球に誘導されるゲノム損傷を評価することを目的としています。この方法論を用いて、ブレオマイシン誘発性DSBの修復動態を研究する予備的な試みとして、γH2AXと53BP1病巣の数の経時的な変化も明らかにしました。
Introduction
DNA損傷は、細胞の酸化的代謝によって生成されるROSなどの内因性、または化学物質と物理的の両方の外因性の薬剤によって継続的に誘発されます1。最も有害な病変の中で、二本鎖切断(DSB)は、染色体異常を引き起こし、それが発がんプロセスを開始する可能性があるため、ゲノム不安定性に寄与する上で基本的な役割を果たします。したがって、細胞はDSBを修復する複雑で効率的なメカニズムを備えている2。
DSBが発生すると、細胞はDNA損傷応答(DDR)をトリガーし、MRE11 / RAD50 / NBS1複合体とともに、ATMまたはATRキナーゼが動員され、細胞周期を遅くしたり停止したりする他のタンパク質を活性化します3。これらのキナーゼの必須標的はヒストンH2AXであり、これはDSBから数メガ塩基以内のSer-139上でリン酸化され(すなわちγH2AX)、それによってBRCA1およびp53結合タンパク質1(53BP1)3などのいくつかの修復因子の動員を可能にする。その後、相同組換え(HR)、非相同末端結合(NHEJ)、または一本鎖アニーリング(SSA)の間の1つの経路がトリガーされ、DSBが修復されます4,5。したがって、53BP1はHRまたはNHEJの選択を決定することに関与し、主にHR6ではなくNHEJの活性化を促進します。さらに、H2AXヒストンのリン酸化型と53BP1の両方がDSBの部位に病巣を形成する可能性があります。これらの病巣は二本鎖の完全性が回復するまで持続するため、時間間隔内のγH2AXまたは53BP1病巣の出現/消失を評価することは、細胞系におけるDSBの発生および修復を評価するための有用な方法と考えられる6,7。しかし、上記の分子プロセスによれば、γH2AXと53BP1病巣はDDR 8,9の間にDSBの近くで共局在することが予想されるので、二重免疫蛍光においてこれらのマーカーの存在を同時に検出することは有用であり得る。
したがって、この原稿の目的は、放射性模倣剤ブレオマイシンによってヒト末梢リンパ球に誘発されるゲノム損傷を評価するためのγH2AXと53BP1病巣の同時定量の適合性を評価することでした。同じ方法論を使用して、以前に設定された実験手順10に従って、ブレオマイシン誘発性DSBの修復速度論を描写することも試みました。
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Protocol
研究はピサ大学の倫理委員会によって承認され、各ドナーから情報を得て署名された同意が得られました。
1. γH2AXおよび53BP1病巣の形成
- サンプルの調製と変異原性治療
- 抗凝固剤としてリチウムヘパリンを含む採血(例えば、Vacutainer)チューブ内の健康な成人から静脈穿刺によって全血サンプルを収集する。
- 適切な血液サンプルの保存を保証するために、サンプリングから24時間以内に手順を開始してください。
- 300 μLのサンプルを、4.7 mLの完全培地(0.5%ペニシリン-ストレプトマイシン、0.75%フィトヘマグルチニン、10%FBS以前に不活性化、88.75%RPMI 1640)を含むチューブに加えます。
- 次に、硫酸ブレオマイシンを最終濃度5 μg/mLまで添加します。
注意:硫酸ブレオマイシンは変異原です。皮膚への接触や吸入を避けてください。溶液を調製し、フードの下にサンプルを追加します。 - 各サンプルについて、ネガティブコントロール(変異原の非存在)を設定します。
- チューブを37°Cのサーモスタットに2時間入れます。
- 固定
- サンプルを540 x g で室温で5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、ペレットを渦で再懸濁します。
- 5 mLの低張溶液(500 mLの脱イオン水に溶解した2.87 gのKCl)と400 μLの固定前溶液(5:3酢酸:メタノール)を加えて、赤血球の溶血を引き起こします。
- サンプルを540 x g で室温で5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、ペレットを室温で5 mLのメタノールに少なくとも30分間再懸濁して細胞を固定します。
- あるいは、使用時まで細胞を-20°Cで保存してください。
- スライドの準備
- サンプルを540 x g で室温で5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、ペレットを5 mLの3:1メタノール:酢酸溶液に再懸濁します。これらの手順をもう一度繰り返します。
- 最後に、溶液を540 x g で室温で5分間遠心分離します。
- ペレットを再懸濁するのに十分な溶液(0.5 mL)を残して上清を再度吸引し、激しくピペットで移動し、再懸濁した細胞ペレットをスライドに落とし、風乾します。スライドは4°Cで保管してください。
- 免疫蛍光
注:免疫蛍光法は、標的自体に結合する一次抗体と、標的を局在化させることを可能にする一次抗体に結合する蛍光二次抗体を使用して、特定の細胞標的を同定するための免疫学的方法です11。この場合、一次抗体としてマウスモノクローナル抗53BP1(1:50)およびウサギポリクローナル抗γH2AX(1:50)が使用され、二次抗体としてAlexaFluor568抗マウス(1:400)およびDyLight488抗ウサギ(1:200)がそれぞれ使用されます。- スライドを50 mLの1x PBSでクープリンジャーで5分間2回洗浄します(スライド16枚を背中合わせに)。
- 次に、ブロッキング溶液(10 mLのFBS、10 mLの10x PBS、80 mLの脱イオン水、300 μLのTriton-X)で30分間保持します。
- ブロッキング溶液に溶解した一次抗体を含む2つの溶液のそれぞれを各スライドに10 μL加えます。スライドをパラフィンテープで覆い、4°Cで一晩インキュベートします。
- インキュベーション後、1x PBSで5分間3回の洗浄を行います。
- ブロッキング溶液に溶解した二次抗体を含む2つの溶液のそれぞれを各スライドに10 μL加えます。スライドをパラフィンテープで覆い、室温で2時間インキュベートする。
- 1x PBSで5分間3回洗浄します。
- アセンブリの前にカバーガラスにDAPIを含む退色防止溶液2.5 μLを加え、核を対比染色します。
注:病巣動態を評価するために、手順は1.1から1.4で説明したのと同じであり、細胞採取と二重免疫蛍光は、ブレオマイシン治療後2時間後、および変異原を除去した後、治療後4時間、6時間、および24時間で実行されます。
2. 蛍光顕微鏡による分析
注:「蛍光顕微鏡」とは、蛍光を使用して画像を生成する顕微鏡を指します。試料は、蛍光色素によって吸収される特定の波長の光で照らされ、より長い波長の光を放出させます12。AlexaFluor568とDyLight 488は、それぞれ約568nmと488nmの光を吸収し、603nmと520nmの光を放出します。したがって、それらはそれぞれTRITCまたはFITCフィルターを使用して赤色または緑色の蛍光として可視されます。
- 100倍の浸漬対物レンズの下で各スライドの焦点の存在をスコアリングします(図1)。
- スライドごとに200個の核をスコアリングし、各核のγH2AX/53BP1病巣の数を数えます。
- スコアリングされた全核あたりの病巣の平均数の観点から結果を表現します。これらには、γH2AX/53BP1陽性(少なくとも1つの蛍光シグナルを示す)および陰性(蛍光シグナルを示さない)の両方の核が含まれる。
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Representative Results
末梢リンパ球の蛍光顕微鏡分析によって得られたデータは、3つの主要な側面を評価することを可能にします:その変異原性効果によるγH2AXおよび53BP1病巣(したがってDSB)の数の増加におけるブレオマイシン治療の有効性、DSBの部位で両方の病巣がどの程度共局在しているか、およびブレオマイシン誘発性DSBの修復動態を描写するためのγH2AXおよび53BP1病巣の時間経過。予想通り、未処理細胞と未処理細胞の間でγH2AXと53BP1病巣の両方の非常に高い頻度が観察され、ブレオマイシンが末梢リンパ球でDSBの形成を誘導することが確認されました(図2)。
2つのマーカーの病巣の数に大きな違いが観察されました。特に、γH2AX病巣は53BP1病巣よりも多く、共局在が常に起こるとは限らず、複数の要因に依存する可能性があることを示しています(図3)。
DSBの修復速度論に関しては、まず、病巣の実際の修復が最初に選択された時点である2時間より前にどのように開始できるか、そしてさまざまな時点で、新しく形成された病巣と、以前に形成され、まだ修復されていない病巣を観察できることを強調することが重要です。
前述のことを考慮すると、γH2AXと53BP1病巣の経時的な経時変化は、同じ機能に寄与しているものの、異なる挙動を示した。γH2AX病巣は治療後2時間後に増加し、その後進行性の減少を開始したが、治療後24時間で対照値に達することはなかった。分散では、53BP1病巣の頻度は治療後4時間まで増加し、その後6時間で減少し、治療後24時間で最高値に戻りました(図4)。
図1:γH2AXおよび53BP1のヒト末梢リンパ球における二重免疫蛍光: (A)ブレオマイシン治療前のγH2AXおよび53BP1病巣のない核、(B)および(C)ブレオマイシン治療によるγH2AXおよび53BP1病巣の量が異なる核。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:2つのDSBマーカーの未処理リンパ球とブレオマイシン処理(5 μg/mL)リンパ球の比較。エラーバーはSEMを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:γH2AXと53BP1病巣の総量(自然誘発および変異原誘発の両方)の比較。 エラーバーはSEMを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:γH2AXおよび53BP1病巣動態 。 0時間、2時間、4時間、6時間、および24時間は、リンパ球が採取されたさまざまな時間を表します。エラーバーはSEMを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
γH2AXおよび53BP1病巣の免疫蛍光分析は、細胞系の間期核におけるゲノム損傷を評価するのに適した方法です。この手順には、実験の結果に影響を与える可能性のあるいくつかの重要なポイント、主に固定および透過処理に使用される薬剤、抗体の種類とその希釈因子、および変異原の濃度があります。
免疫蛍光法は、主にタンパク質である抗原を同定することが期待されているため、タンパク質の完全性の維持は基本です。このプロトコルでは、メタノールを使用してリンパ球を固定します。アルコールは水を置換して可溶性タンパク質の沈殿を引き起こすことによって作用し、一方、固定されていない他の細胞成分はPBS13などの生理食塩水緩衝溶液で洗浄することによって除去できるため、このステップは特に重要です。
別の重要な通過は、ブロッキング溶液を介して行われる透過処理であり、この場合、透過処理とブロッキングの両方を可能にします。ブロッキングは、FBSを溶液に添加することによって実行されます:FBSと抗体の特異的ターゲットとの間の結合は、抗体とターゲット自体との間の高い親和性のために後で切断される可能性があるため、サンプル中のタンパク質に結合し、抗体が間違ったターゲットに結合するのを防ぎます。透過処理はいくつかの溶媒を用いて行うことができ、この場合、非イオン性界面活性剤Triton X−100が使用される:それはリン脂質二重層にインターカレートし、原形質膜を可溶化しそして次にそれを破壊する14。
効率的なγH2AXおよび53BP1抗体の選択は免疫蛍光の成功に不可欠であるため、信頼性が実証された抗体の使用を強くお勧めします。また、抗体の希釈を数回試して、最も優れた濃度を特定することもお勧めします。
予備実験として、バックグラウンドノイズまたは自家蛍光の可能性を評価するために、さまざまなコントロールを研究しました。特に、異なる実験では、一次抗体のみ、二次抗体のみを使用し、それぞれを個別に染色し、染色は行わなかった。予想通り、一次/二次抗体の存在下のみでは焦点は観察されなかったが、各染色で個別にプロトコルを実行した場合、緑色または赤色の蛍光スポット(γH2AXまたは53BP1病巣のいずれかの存在を示す)が観察された。染色コントロールなしに関しては、びまん性染色で現れるバックグラウンドノイズ/自家蛍光を観察しました。代わりに、免疫蛍光プロトコルを実行した後、γH2AXまたは53BP1病巣は、使用される蛍光色素(FITCまたはTRITC)の適切なフィルターの下で、緑または赤のシグナルとして茶色-暗核にはっきりと見えます。したがって、バックグラウンドノイズ/自家蛍光は、1つの蛍光スポットが適切な焦点であるかどうかを評価するために特定の基準を使用したため、病巣の同定に有意な影響を与えません(つまり、顕微鏡の焦点合わせ中、γ-H2AXおよび53BP1病巣は、細胞核の外側に存在する可能性のある他の蛍光スポットの同じ焦点面上にあってはなりません)。これらの基準は、主観性を減らし、バックグラウンドノイズ/自家蛍光の影響を無視できるようにするために選択されました。
ブレオマイシンは、低LET電離放射線(IR)の作用と非常によく似た方法で、デオキシリボースに対する高度に特異的なフリーラジカル攻撃によってDSBを誘導するラジカルベースの変異原性物質です。したがって、ブレオマイシンは、放射線模倣剤15として定義される。大量のブレオマイシン誘発性DSBはリンパ球の増殖に深刻な影響を及ぼし、最悪のシナリオではアポトーシスの活性化を引き起こす可能性があるため、数濃度の変異原性物質をテストして、細胞毒性をもたらすことなくDSB形成につながる可能性のある用量を特定することが推奨されます。
いくつかの研究は、IR誘発性DSBを修復するための主要な経路がNHEJであり、病変の近くに53BP1が存在することによって促進されることを示しています16,17。しかし、IRと同様に作用するブレオマイシンによる治療後には、より多くの53BP1病巣が発生することが予想されるかもしれませんが、私たちの研究では、53BP1病巣よりもγH2AXの頻度が高いことが観察されました。γH2AXおよび53BP1病巣解析の主な利点は、曝露または病理学的状況のいずれかで細胞応答を評価する能力に依存しています。実際、γH2AXおよび53BP1病巣がIR効果の信頼できる確立されたマーカーであることはよく知られており18、γH2AX病巣の存在は、いくつかの形態の癌における重要な予後因子を表す19、または、より一般的には、DSBの発生を増加させる薬剤または化学物質の能力を決定することに同意します。さらに、γH2AXおよび53BP1病巣は、DSBs増加と特定の疾患との間の可能な関係を確立するために評価することができ20、21、治療に対する応答の観点から治療を検証する22、23、または腫瘍放射線感受性を推定する24。
γH2AXおよび53BP1病巣アッセイはDSBを定量するために広く使用されているが、著者らは両方の方法に限界があることを強調しなければならない:主な関心事は、DSB自体を検出するのではなく、修復プロセスに関与する2つの特定の要因を検出するという事実にある。したがって、修復動力学が非常に変動することを考慮すると25、結果の解釈はあいまいになる可能性があります。
しかし、本研究は、γH2AXと53BP1病巣を同時に定量するための二重免疫蛍光の使用が、結果の解釈にいくつかの問題を引き起こす可能性があることを示しています。これは主に、DSB部位でのγH2AXの存在が53BP1よりも高いことと、ブレオマイシン処理後に観察された2つのマーカーの共局在蛍光シグナルのレベルが低いことの両方によるものです。一方、ヒストンH2AXは、DSBが出現してから修復されるまでSer-139上でリン酸化されたままであり、一方、53BP1は、より特異的な条件下でリクルートされるタンパク質であり、例えばNHEJのみが活性化できる場合、また、53BP1は細胞周期のG1期に強く優勢である25。さらに、53BP1は、DSBがγH2AXと一緒に発生した場合に実際にリクルートされた可能性がありますが、持続時間は短いため、二重免疫蛍光は、それとγH2AXを同時に局在させることができません。ただし、詳細で信頼性の高いプロトコルを提供した二重免疫蛍光法を実施することがより適切であると研究者が判断した場合、この方法は本質的にイベントの真の頻度を過小評価することにつながる可能性があることを考慮することが重要です上記のように。同時に、イベントを過大評価しないために、共局在γH2AXと53BP1病巣を2つの異なるスポットとして数えることは、実際に1つのDSBのみの存在を示すため、避ける必要があります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
全血献血者と血液サンプルを採取したすべての医療従事者に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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