Summary
이 프로토콜은 블레오마이신 처리된 인간 말초 림프구의 간기 핵에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 검출을 통해 DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 평가하는 방법을 제시합니다.
Abstract
이중 가닥 절단(DSB)은 세포핵에서 발생할 수 있는 가장 심각한 병변 중 하나이며, 복구하지 않으면 암을 포함한 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 세포에는 DSB를 복구하는 복잡한 메커니즘이 제공되며 이러한 경로는 Ser-139(즉, γH2AX) 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)에서 인산화된 형태의 히스톤 H2AX를 포함합니다. 두 단백질 모두 DSB 부위에서 병소를 형성할 수 있기 때문에 이러한 마커의 식별은 DSB와 복구 동역학을 모두 연구하는 데 적합한 방법으로 간주됩니다. γH2AX 및 53BP1 병소의 형성으로 이어지는 분자 과정에 따르면, 두 개의 DNA 손상 마커를 동시에 검출하여 DSB를 정량화할 수 있는 대체 접근법을 설정하기 위해 DSB 근처의 공동 국소화를 조사하는 것이 더 유용할 수 있습니다. 따라서, 이 프로토콜은 이중 면역형광에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 존재를 통해 방사성 모방제 블레오마이신에 의해 인간 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하는 것을 목표로 한다. 이 방법론을 사용하여 우리는 또한 블레오마이신 유도 DSB의 복구 역학을 연구하기 위한 예비 시도로 시간 경과에 따른 γH2AX 및 53BP1 병소 수의 변화를 설명했습니다.
Introduction
DNA 손상은 세포 산화 대사에 의해 생성된 ROS와 같은 내인성일 수 있는 작용제에 의해 연속적으로 유도되거나, 또는 외인성, 화학적 및 물리적둘 다1. 가장 해로운 병변 중 이중 가닥 절단(DSB)은 염색체 이상을 일으켜 발암 과정을 시작할 수 있기 때문에 게놈 불안정성에 기여하는 근본적인 역할을 합니다. 따라서, 세포는 DSBs를 복구하는 복잡하고 효율적인 메카니즘을 제공받는다2.
DSB가 발생하면 세포는 MRE11/RAD50/NBS1 복합체와 함께 ATM 또는 ATR 키나아제를 모집하여 세포 주기를 늦추거나 멈추게 하는 다른 단백질을 활성화하는 DNA 손상 반응(DDR)을 유발합니다3. 이러한 키나아제의 필수 표적은 히스톤 H2AX이며, 이는 DSB(즉, γH2AX)로부터 몇 메가베이스 내에서 Ser-139에 인산화되어 BRCA1 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)3. 나중에, 상동 재조합 (HR), 비-상동 말단 접합 (NHEJ), 또는 단일-가닥 어닐링 (SSA) 중 하나의 경로가 DSB를 복구하기 위해 트리거된다 4,5. 따라서 53BP1은 HR 또는 NHEJ 중 하나를 선택하는 데 관여하며 주로 HR6보다는 NHEJ의 활성화를 촉진합니다. 또한, H2AX 히스톤과 53BP1의 인산화 된 형태는 모두 DSB 부위에서 병소를 형성 할 수 있습니다. 이들 병소는 이중 가닥의 완전성이 회복될 때까지 지속되므로, 시간 간격 내에 γH2AX 또는 53BP1 병소의 출현/소실을 평가하는 것은 셀 시스템에서 DSB의 발생 및 복구를 평가하는 유용한 방법으로 간주된다 6,7. 그러나, 상기 기술된 분자 과정에 따르면, γH2AX 및 53BP1 초점은 DDR8,9 동안 DSB 근처에서 공동 국소화될 것으로 예상되기 때문에, 이중 면역형광에서 이들 마커의 존재를 동시에 검출하는 것이 유용할 수 있다.
따라서, 이 원고의 목적은 방사성 모방제 블레오마이신에 의해 인간 말초 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하기 위해 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 정량화의 적합성을 평가하는 것이었습니다. 동일한 방법론을 사용하여 이전에 설정된 실험 절차10에 따라 블레오마이신 유도 DSB의 복구 역학을 설명하려고 시도했습니다.
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Protocol
이 연구는 피사 대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며 각 기증자로부터 정보에 입각하고 서명 된 동의를 얻었습니다.
1. γH2AX 및 53BP1 병소의 형성
- 시료 준비 및 돌연변이 유발 처리
- 항응고제로 리튬 헤파린이 포함된 혈액 수집(예: Vacutainer) 튜브에서 건강한 성인 개인의 정맥 천자에 의한 전혈 샘플을 수집합니다.
- 적절한 혈액 샘플 보존을 보장하려면 샘플링 후 24시간 이내에 절차를 시작하십시오.
- 300μL의 샘플을 4.7mL의 완전 배지(0.5% 페니실린-스트렙토마이신, 0.75% 식물성 헤마글루티닌, 이전에 비활성화된 10% FBS, 88.75% RPMI 1640)가 들어 있는 튜브에 추가합니다.
- 그런 다음 블레오마이신 설페이트를 최종 농도 5μg/mL에 추가합니다.
주의: 블레오마이신 설페이트는 돌연변이 유발 물질입니다. 피부 접촉 및 흡입을 피하십시오. 용액을 준비하고 후드 아래에 샘플을 추가하십시오. - 각 샘플에 대해 음성 대조군(돌연변이원 없음)을 설정합니다.
- 튜브를 37°C의 온도 조절기에 2시간 동안 놓습니다.
- 고정
- 실온에서 5분 동안 540 x g 의 원심분리기 샘플.
- 상층액을 흡인하고 소용돌이로 펠릿을 다시 현탁하십시오.
- 5mL의 저삼투압 용액(500mL의 탈이온수에 용해된 2.87g의 KCl)과 400μL의 사전 고정 용액(5:3 아세트산: 메탄올)을 추가하여 적혈구의 용혈을 유발합니다.
- 실온에서 5분 동안 540 x g 의 원심분리기 샘플.
- 상청액을 흡인하고 펠렛을 실온에서 메탄올 5mL에 최소 30분 동안 재현탁하여 세포를 고정합니다.
- 대안적으로, 사용할 때까지 세포를 -20°C에서 보관한다.
- 슬라이드 준비
- 실온에서 5분 동안 540 x g 의 원심분리기 샘플.
- 상층액을 흡인하고 펠릿을 3:1 메탄올:아세트산 용액 5mL에 재현탁합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 마지막에, 용액을 실온에서 5분 동안 540 x g 에서 다시 원심분리한다.
- 펠릿을 재현탁하기에 충분한 용액(0.5mL)을 남기고 상청액을 다시 흡인하고, 격렬하게 피펫팅하고, 재현탁된 세포 펠릿을 슬라이드에 떨어뜨리고, 자연 건조합니다. 슬라이드를 4°C에서 보관합니다.
- 면역형광
참고: 면역형광법은 표적 자체에 결합하는 1차 항체와 표적에 국소화할 수 있는 1차 결합하는 형광 2차 항체를 사용하여 특정 세포 표적을 식별하는 면역학적 방법입니다11. 이 경우 마우스 단클론 항-53BP1(1:50)과 토끼 다클론 항-γH2AX(1:50)를 1차 항체로 사용하고 AlexaFluor568 항-마우스(1:400) 및 DyLight488 항-토끼(1:200)를 각각 2차 항체로 사용합니다.- 슬라이드를 커플플린 병에서 5분 동안 1x PBS 50mL로 두 번 세척합니다(연속 16개의 슬라이드).
- 그런 다음 블로킹 용액(FBS 10mL, 10x PBS 10mL, 탈이온수 80mL, Triton-X 300μL)에 30분 동안 보관합니다.
- 블로킹 용액에 용해된 1차 항체를 함유하는 2개의 용액 각각의 10 μL를 각 슬라이드에 첨가한다. 슬라이드를 파라핀 테이프로 덮고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 배양 후 1x PBS에서 5분 동안 3회 세척을 수행합니다.
- 블로킹 용액에 용해된 2차 항체를 함유하는 2개의 용액 각각의 10 μL를 각 슬라이드에 첨가한다. 슬라이드를 파라핀 테이프로 덮고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
- 1x PBS에서 5분 동안 3회 세척을 수행합니다.
- 핵을 반대 염색하기 위해 조립 전에 커버슬립에 DAPI가 포함된 페이드 방지 용액 2.5μL를 추가합니다.
참고: 초점 동역학을 평가하기 위해 절차는 1.1에서 1.4까지 설명된 것과 동일하며, 세포 수확 및 이중 면역형광은 블레오마이신 처리 후 0시간, 2시간 후, 그리고 돌연변이원을 제거한 후, 처리 후 4시간, 6시간 및 24시간.
2. 형광현미경을 통한 분석
참고: "형광 현미경"은 형광을 사용하여 이미지를 생성하는 모든 현미경을 의미합니다. 시편은 형광단에 흡수되는 특정 파장(또는 파장)의 빛으로 조명되어 더 긴 파장의 빛을 방출하게 한다12. AlexaFluor568 및 DyLight 488은 각각 약 568 및 488 nm의 빛을 흡수하고 603 및 520 nm의 빛을 방출합니다. 따라서 각각 TRITC 또는 FITC 필터를 사용하여 적색 또는 녹색 형광으로 볼 수 있습니다.
- 100x 몰입 대물렌즈에서 각 슬라이드의 초점의 존재 여부를 점수화합니다(그림 1).
- 슬라이드당 200개의 핵을 채점하고 각 핵의 γH2AX/53BP1 병소 수를 계산합니다.
- 점수가 매겨진 총 핵당 평균 병소 수로 결과를 표현합니다. 여기에는 γH2AX/53BP1 양성(적어도 하나의 형광 신호를 나타냄) 및 음성(형광 신호를 나타내지 않음) 핵이 모두 포함됩니다.
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Representative Results
말초 림프구의 형광 현미경 분석으로 얻은 데이터를 통해 우리는 세 가지 주요 측면을 평가할 수 있습니다: 돌연변이 유발 효과로 인해 γH2AX 및 53BP1 병소(따라서 DSB)의 수를 증가시키는 블레오마이신 치료의 효과, 두 병소가 DSB 부위에 공동 국한되는 정도, 블레오마이신 유도 DSB의 복구 동역학을 설명하기 위한 γH2AX 및 53BP1 병소의 시간 경과. 예상한 바와 같이, 처리되지 않은 세포와 처리된 세포 사이에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 매우 높은 빈도가 관찰되었으며, 따라서 블레오마이신이 말초 림프구에서 DSB의 형성을 유도한다는 것을 확인했습니다(그림 2).
두 마커의 초점 수에서 큰 차이가 관찰되었습니다. 특히, γH2AX 병소는 53BP1 병소보다 더 많았으며, 따라서 공동 국소화가 항상 발생하는 것은 아니며 여러 요인에 의존할 수 있음을 나타냅니다(그림 3).
DSB의 복구 동역학과 관련하여, 우선, 첫 번째 선택된 시점 인 2 시간 이전에 병소의 실제 수리가 어떻게 시작될 수 있는지, 그리고 다양한 시점에서 이전에 형성되어 아직 복구되지 않은 병소뿐만 아니라 새로 형성된 병소를 관찰 할 수 있다는 점을 강조하는 것이 중요합니다.
이전에 말한 것을 고려할 때, 시간 경과에 따른 γH2AX 및 53BP1 초점의 시간 경과는 동일한 기능에 기여하지만 다른 거동을 보였다. γH2AX 병소는 처리 후 2시간 후에 증가했고, 그 후 점진적인 감소를 시작했지만, 치료 후 24시간에 대조군 값에 도달하지 못했습니다. 분산에서 53BP1 병소의 빈도는 처리 후 4시간까지 증가한 다음 6시간에서 감소하고 처리 후 24시간 후에 가장 높은 값으로 돌아왔습니다(그림 4).
그림 1: γH2AX 및 53BP1에 대한 인간 말초 림프구의 이중 면역형광: (A) 블레오마이신 처리 전 γH2AX 및 53BP1 병소가 없는 핵, (B) 및 (C) 블레오마이신 처리로 인한 γH2AX 및 53BP1 병소의 양이 다른 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 두 DSB 마커에 대한 미처리 림프구와 블레오마이신 처리(5μg/mL) 림프구 간의 비교. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: γH2AX의 총량(자발적 및 돌연변이원 유발 모두)과 53BP1 병소의 비교. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: γH2AX 및 53BP1 병소 동역학. 0 h, 2 h, 4h, 6 h 및 24 h는 림프구가 수확된 상이한 시간을 나타내고; 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
γH2AX 및 53BP1 병소의 면역형광 분석은 세포 시스템의 간기 핵에서 게놈 손상을 평가하는 데 적합한 방법입니다. 이 절차에는 실험 결과, 주로 고정 및 투과에 사용되는 제제, 항체 유형 및 희석 인자, 돌연변이 유발 물질의 농도에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 중요한 사항이 있습니다.
면역형광법은 주로 단백질인 항원을 식별할 것으로 예상하기 때문에 단백질 무결성의 유지는 기본입니다. 이 프로토콜에서 메탄올은 림프구를 고정하는 데 사용됩니다. 이 단계는 알코올이 물을 대체하고 가용성 단백질의 침전을 유발하여 작용하는 반면, 고정되지 않은 다른 세포 성분은 PBS13과 같은 식염수 완충 용액에서 세척하여 제거할 수 있기 때문에 특히 중요합니다.
또 다른 주요 통로는 차단 용액을 통해 수행되는 투과화이며, 이 경우 투과화와 차단을 모두 허용합니다. 블로킹은 FBS를 용액에 첨가하여 수행됩니다 : FBS와 항체의 특정 표적 사이의 결합이 항체와 표적 자체 사이의 높은 친화력으로 인해 나중에 끊어 질 수 있기 때문에 샘플의 단백질을 결합하고 항체가 잘못된 표적에 결합하는 것을 방지합니다. 투과화는 여러 용매를 사용하여 수행할 수 있으며, 이 경우 비이온성 세제인 Triton X-100이 사용됩니다: 인지질 이중층으로 삽입하여 원형질막을 가용화한 다음 이를 파쇄합니다(14).
효율적인 γH2AX 및 53BP1 항체의 선택이 면역형광의 성공에 매우 중요하므로 신뢰성이 입증된 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 가장 성능이 좋은 농도를 확인하기 위해 항체를 여러 번 희석하는 것이 좋습니다.
예비 실험으로, 우리는 가능한 배경 소음 또는자가 형광을 평가하기 위해 다양한 대조군을 연구했습니다. 특히, 우리는 다른 실험에서 1차 항체만, 2차 항체만, 각 염색을 개별적으로 사용했으며 염색은 하지 않았습니다. 예상대로 1차/2차 항체만 있는 경우 초점을 관찰하지 않은 반면, 각 염색에 대해 개별적으로 프로토콜을 수행했을 때 녹색 또는 빨간색 형광 반점(γH2AX 또는 53BP1 병소의 존재를 나타냄)을 관찰했습니다. 염색 대조군이 없는 것과 관련하여 우리는 확산 염색으로 나타나는 배경 소음/자가형광을 관찰했습니다. 대신, 면역 형광 프로토콜을 수행 한 후, γH2AX 또는 53BP1 초점은 사용 된 형광 색소 (FITC 또는 TRITC)에 대한 적절한 필터 하에서 녹색 또는 적색 신호로 갈색-어두운 핵에서 명확하게 볼 수 있습니다. 따라서 배경 잡음/자가형광은 초점 식별에 큰 영향을 미치지 않으며, 또한 하나의 형광 반점이 적절한 초점인지 평가하기 위해 특정 기준을 사용했기 때문입니다(즉, 현미경의 초점 중에 γ-H2AX 및 53BP1 초점은 세포핵 외부에 잠재적으로 존재하는 다른 형광 반점의 동일한 초점면에 있지 않아야 합니다). 이러한 기준은 주관성을 줄이고 배경 소음/자가형광의 영향을 무시할 수 있게 해주기 때문에 선택되었습니다.
블레오마이신은 낮은 LET 전리 방사선(IR)이 작용하는 방식과 매우 유사한 방식으로 디옥시리보스에 대한 매우 특이적인 자유 라디칼 공격에 의해 DSB를 유도하는 라디칼 기반 돌연변이원입니다. 따라서, 블레오마이신은 방사성모방제(15)로서 정의된다. 다량의 블레오마이신 유도 DSB가 림프구의 증식에 심각한 영향을 미칠 수 있기 때문에 최악의 시나리오인 세포자멸사 활성화에서는 세포독성을 유발하지 않고 DSB 형성을 유도할 수 있는 용량을 확인하기 위해 여러 농도의 돌연변이원을 테스트하는 것이 좋습니다.
여러 연구에 따르면 IR 유도 DSB를 복구하는 주요 경로는 NHEJ이며, 이는 병변 근처에 53BP1이 존재함으로써 촉진됩니다16,17. 그러나 IR과 유사하게 작용하는 블레오마이신으로 치료한 후 더 많은 양의 53BP1 병소가 발생할 것으로 예상될 수 있지만, 본 연구에서는 53BP1 병소보다 γH2AX의 빈도가 더 높은 것을 관찰했습니다. γH2AX 및 53BP1 병소 분석의 주요 이점은 노출 또는 병리학적 맥락에서 세포 반응을 평가하는 능력에 달려 있습니다. 사실, γH2AX와 53BP1 병소는 IR 효과의 신뢰할 수 있고 확립된 마커라는 것은 잘 알려져 있다.18, γH2AX 병소의 존재는 여러 형태의 암에서 중요한 예후 인자를 나타낸다19, 또는 더 일반적으로, 그들은 DSBs 발생을 증가시키는 작용제 또는 화학물질의 능력을 결정하는 데 동의한다. 또한, γH2AX 및 53BP1 병소는 DSB 증가와 특정 질병20,21 사이의 가능한 관계를 확립하기 위해 평가되거나, 치료 22,23에 대한 반응 측면에서 치료법을 검증하거나, 종양 방사선 민감도를 추정하기 위해 평가될 수 있다 24.
γH2AX 및 53BP1 병소 분석은 DSB를 정량화하기 위해 널리 사용되지만, 저자는 두 방법 모두 한계가 있음을 강조해야합니다 : 주요 관심사는 DSB 자체를 검출하지 않는다는 사실에 있지만 수리 프로세스와 관련된 두 가지 특정 요인에 있습니다. 따라서, 복구 동역학이 매우 가변적이라는 것을 고려할 때(25), 결과의 해석은 모호할 수 있다.
그러나 본 연구는 γH2AX 및 53BP1 병소를 동시에 정량화하기 위해 이중 면역형광을 사용하면 결과 해석에 몇 가지 문제가 발생할 수 있음을 나타냅니다. 이것은 주로 DSB 부위에서 γH2BP53보다 1AX의 더 높은 존재와 블레오마이신 치료 후 관찰된 두 마커에 대한 낮은 수준의 공동 국소 형광 신호 때문입니다. 반면에, 히스톤 H2AX는 DSB가 나타날 때부터 복구 될 때까지 Ser-139에서 인산화 된 상태로 유지되는 반면, 53BP1은 NHEJ 만 활성화 될 수있는보다 특정한 조건 하에서 모집되는 단백질이며, 또한 53BP1은 세포주기25의 G1 단계에서 강하게 우세합니다. 또한, 53BP1은 DSB가 γH2AX와 함께 발생했지만 더 짧은 시간 동안 지속되는 경우 실제로 모집되었을 수 있으므로 이중 면역형광은 DSB와 γH2AX를 동시에 국소화할 수 없습니다. 그러나 연구자가 상세하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공한 이중 면역형광을 수행하는 것이 더 적절하다고 판단하는 경우 이 방법이 본질적으로 위에서 설명한 대로 사건의 실제 빈도를 과소평가할 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 동시에, 사건을 과대 평가하지 않기 위해, 공동 국소화 된 γH2AX 및 53BP1 초점을 두 개의 다른 지점으로 계산하는 것은 실제로 하나의 DSB 만 존재한다는 것을 나타내기 때문에 피해야합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
혈액 샘플을 채취 한 전혈 기증자와 모든 의료진에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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