Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dobbel immunfluorescens av γH2AX og 53BP1 i humane perifere lymfocytter

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65472
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Summary

Denne protokollen presenterer en metode for å vurdere dannelsen og reparasjonen av DNA-dobbeltstrengbrudd gjennom samtidig påvisning av γH2AX og 53BP1-foci i interfasekjerner av bleomycinbehandlede humane perifere lymfocytter.

Abstract

Dobbeltstrengbrudd (DSB) er en av de mest alvorlige lesjonene som kan oppstå i cellekjerner, og hvis de ikke repareres, kan de føre til alvorlige utfall, inkludert kreft. Cellen er derfor utstyrt med komplekse mekanismer for å reparere DSB, og disse veiene involverer histon H2AX i sin fosforylerte form ved Ser-139 (nemlig γH2AX) og p53 bindende protein 1 (53BP1). Siden begge proteinene kan danne foci på DSB-stedene, anses identifisering av disse markørene som en egnet metode for å studere både DSB og deres reparasjonskinetikk. I henhold til de molekylære prosessene som fører til dannelsen av γH2AX og 53BP1 foci, kan det være mer nyttig å undersøke deres samlokalisering nær DSB for å sette opp en alternativ tilnærming som gjør det mulig å kvantifisere DSB ved samtidig påvisning av to DNA-skademarkører. Dermed tar denne protokollen sikte på å vurdere genomisk skade indusert i humane lymfocytter av radiomimetikkmidlet bleomycin gjennom tilstedeværelsen av γH2AX og 53BP1 foci i en dobbel immunfluorescens. Ved hjelp av denne metodikken avgrenset vi også variasjonen i antall γH2AX og 53BP1 foci over tid, som et foreløpig forsøk på å studere reparasjonskinetikken til bleomycininduserte DSBer.

Introduction

DNA-skade induseres kontinuerlig av midler som kan være endogene, for eksempel ROS generert av cellulær oksidativ metabolisme, eller eksogene, både kjemikalier og fysisk1. Blant de mest skadelige lesjonene spiller dobbeltstrengbrudd (DSB) en grunnleggende rolle i å bidra til genomisk ustabilitet, siden de forårsaker kromosomavvik som igjen kan starte karsinogeneseprosessen. Dermed er cellene utstyrt med komplekse og effektive mekanismer for DSBs reparasjon2.

Når en DSB oppstår, utløser cellen DNA-skaderesponsen (DDR) der ATM- eller ATR-kinaser sammen med MRE11 / RAD50 / NBS1-komplekset rekrutteres for å aktivere andre proteiner som bremser eller stopper cellesyklusen3. Et viktig mål for disse kinasene er histon H2AX, som fosforyleres på Ser-139 i noen få megabaser fra DSB-ene (nemlig γH2AX), og dermed tillater rekruttering av flere reparasjonsfaktorer som blant annet BRCA1 og p53 bindingsprotein 1 (53BP1)3. Senere utløses en vei mellom homolog rekombinasjon (HR), ikke-homolog endesammenføyning (NHEJ) eller enkeltstrenget glødning (SSA) for å reparere DSB 4,5. Derfor er 53BP1 involvert i å diktere valget mellom HR eller NHEJ, hovedsakelig fremme aktiveringen av NHEJ i stedet for HR6. Videre kan både den fosforylerte formen av H2AX histon og 53BP1 danne foci på stedene til DSB. Da disse fociene vedvarer til integriteten til dobbeltstrengen er gjenopprettet, anses det å vurdere utseendet / forsvinningen av γH2AX eller 53BP1 foci innen et tidsintervall som en nyttig metode for å evaluere forekomsten og reparasjonen av DSB i et cellesystem 6,7. Imidlertid, i henhold til de molekylære prosessene ovenfor beskrevet, siden γH2AX og 53BP1 foci forventes å samlokalisere nær DSB under DDR8,9, kan det imidlertid være nyttig å oppdage samtidig tilstedeværelsen av disse markørene i en dobbel immunfluorescens.

Målet med dette manuskriptet var derfor å evaluere egnetheten av samtidig kvantifisering av γH2AX og 53BP1 foci for å vurdere genomisk skade indusert i humane perifere lymfocytter av radiomimetikkmidlet bleomycin. Ved hjelp av samme metodikk forsøkte vi også å avgrense reparasjonskinetikken til bleomycininduserte DSB i henhold til en tidligere satt eksperimentell prosedyre10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studien ble godkjent av den etiske komiteen ved Pisa University, og informert og signert samtykke ble innhentet fra hver donor.

1. Dannelse av γH2AX og 53BP1 foci

  1. Prøvepreparering og mutagen behandling
    1. Samle hele blodprøver ved venepunktur fra friske voksne individer i blodinnsamling (f.eks Vacutainer) rør som inneholder litium heparin som en antikoagulant.
    2. For å garantere riktig blodprøvebevaring, start prosedyren innen 24 timer etter prøvetaking.
    3. Tilsett 300 μL av prøven til et rør som inneholder 4,7 ml komplett medium (0,5% penicillin-streptomycin, 0,75% fytohemagglutinin, 10% FBS tidligere inaktivert, 88,75% RPMI 1640).
    4. Tilsett deretter bleomycinsulfat til en endelig konsentrasjon på 5 μg/ml.
      FORSIKTIG: Bleomycinsulfat er et mutagen. Unngå hudkontakt og innånding. Forbered løsningen og legg prøven under en hette.
    5. For hver prøve, sett opp en negativ kontroll (fravær av mutagen).
    6. Plasser slangen i en termostat ved 37 °C i 2 timer.
  2. Fiksering
    1. Sentrifugeprøver ved 540 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten med virvel.
    3. Tilsett 5 ml hypotonisk oppløsning (2,87 g KCl oppløst i 500 ml avionisert vann) og 400 μL prefiksativ oppløsning (5: 3 eddiksyre: metanol) for å forårsake hemolyse av røde blodlegemer.
    4. Sentrifugeprøver ved 540 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    5. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml metanol ved romtemperatur i minst 30 minutter for å fikse cellene.
    6. Alternativt kan du oppbevare cellene ved -20 °C til bruk.
  3. Forberedelse av lysbilder
    1. Sentrifugeprøver ved 540 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml av en 3:1 metanol: eddiksyreoppløsning. Gjenta disse trinnene en gang til.
    3. På slutten, sentrifuge løsningen igjen ved 540 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    4. Aspirer supernatanten igjen og la nok oppløsning (0,5 ml) til å resuspendere pelleten, pipette kraftig, slippe den resuspenderte cellepelleten på lysbildene og lufttørke. Lagre lysbildene på 4 °C.
  4. Immunfluorescens
    MERK: Immunfluorescens er en immunologisk metode for å identifisere spesifikke cellemål ved hjelp av et primært antistoff som binder selve målet og et fluorescerende sekundært antistoff som binder det primære som tillater lokalisering av målet11. I dette tilfellet brukes en musmonoklonal anti-53BP1 (1:50) og en kaninpolyklonal anti-γH2AX (1:50) som primære antistoffer, mens AlexaFluor568 anti-mus (1:400) og DyLight488 antikanin (1:200) brukes som henholdsvis sekundære antistoffer.
    1. Vask lysbildene to ganger i 50 ml 1x PBS i 5 min i couplin krukke (16 lysbilder rygg mot rygg).
    2. Hold dem deretter i 30 minutter i blokkeringsløsning (10 ml FBS, 10 ml 10x PBS, 80 ml avionisert vann, 300 μL Triton-X).
    3. Legg til hvert lysbilde 10 μL av hver av de to løsningene som inneholder de primære antistoffene oppløst i blokkeringsløsningen. Dekk lysbildene med parafintape og rug ved 4 °C over natten.
    4. Etter inkubering, utfør tre vask i 1x PBS i 5 minutter.
    5. Legg til hvert lysbilde 10 μL av hver av de to løsningene som inneholder sekundære antistoffer oppløst i blokkeringsløsningen. Dekk lysbildene med parafintape og inkuber ved romtemperatur i 2 timer.
    6. Utfør tre vasker i 1x PBS i 5 min.
    7. Tilsett 2,5 μL antifadeoppløsning med DAPI på dekslene før monteringen for å motflekke kjernene.
      MERK: For å vurdere focikinetikken er prosedyren den samme som beskrevet fra 1,1 til 1,4, og noterer at cellehøsting og dobbel immunfluorescens utføres ved 0 timer, etter 2 timer etter bleomycinbehandling og deretter, etter å ha fjernet mutagenet, ved 4 timer, 6 timer og 24 timer etter behandling.

2. Analyse gjennom et fluorescensmikroskop

MERK: "Fluorescensmikroskop" refererer til ethvert mikroskop som bruker fluorescens for å generere et bilde. Prøven belyses med lys av en bestemt bølgelengde (eller bølgelengder) som absorberes av fluoroforene, noe som får dem til å avgi lys med lengre bølgelengder12. AlexaFluor568 og DyLight 488 absorberer lys på ca. 568 og 488 nm og avgir lys på henholdsvis 603 og 520 nm. Dermed er de synlige som rød eller grønn fluorescens ved bruk av henholdsvis et TRITC- eller FITC-filter.

  1. Skår tilstedeværelsen av foci i hvert lysbilde under et 100x nedsenkningsmål (figur 1).
  2. Score 200 kjerner per lysbilde og telle antall γH2AX / 53BP1 foci i hver kjerne.
  3. Express resultater i form av gjennomsnittlig antall foci per totale kjerner scoret. Disse inkluderer både γH2AX/53BP1 positive (viser minst ett fluorescenssignal) og negative (viser ikke noe fluorescenssignal) kjerner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data oppnådd ved fluorescensmikroskopanalyse av perifere lymfocytter tillater oss å evaluere tre hovedaspekter: effektiviteten av bleomycinbehandling ved å øke antallet γH2AX og 53BP1 foci (og dermed DSB) på grunn av dens mutagene effekt, i hvilken grad begge foci samlokaliseres på stedet for DSB, og tidsforløpet av γH2AX og 53BP1 foci for å avgrense reparasjonskinetikken til bleomycininduserte DSB. Som forventet ble det observert en svært høyere frekvens av både γH2AX- og 53BP1-foci mellom ubehandlede og behandlede celler, noe som bekreftet at bleomycin induserer danning av DSB i perifere lymfocytter (figur 2).

En stor forskjell ble observert i antall foci av de to markørene; Spesielt var γH2AX-foci mer tallrike enn 53BP1-foci, noe som indikerer at samlokalisering ikke alltid forekommer og kan avhenge av flere faktorer (figur 3).

Når det gjelder reparasjonskinetikken til DSB, er det først og fremst viktig å understreke hvordan den faktiske reparasjonen av foci kan starte før det første valgte tidspunktet, som er 2 timer, og at vi på forskjellige tidspunkter kan observere nydannede foci samt foci som har blitt dannet tidligere og som ikke har blitt reparert ennå.

Med tanke på det som tidligere ble sagt, viste tidsforløpet av γH2AX og 53BP1 foci over tid en annen oppførsel, selv om de bidrar til samme funksjon. γH2AX-foci økte etter 2 timer etter behandling, og deretter startet de en progressiv reduksjon, uten å nå kontrollverdien 24 timer etter behandlingen. Ved varians økte frekvensen av 53BP1 foci til 4 timer etter behandling, deretter redusert ved 6 timer og returnert til høyeste verdi 24 timer etter behandling (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Dobbel immunfluorescens i humane perifere lymfocytter for γH2AX og 53BP1: (A) kjerner uten γH2AX og 53BP1 foci før bleomycinbehandling, (B) og (C) kjerner med forskjellige mengder γH2AX og 53BP1 foci på grunn av bleomycinbehandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Sammenligning mellom ubehandlet og bleomycinbehandlet (5 μg/ml) lymfocytter for de to DSB-markørene. Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning mellom total mengde (både spontan og mutagenindusert) av γH2AX og 53BP1 foci. Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: γH2AX og 53BP1 foci kinetikk. 0 timer, 2 timer, 4t, 6 timer og 24 timer representerer de forskjellige tidspunktene hvor lymfocytter ble høstet; feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunfluorescensanalyse av γH2AX og 53BP1 foci er en egnet metode for å vurdere genomisk skade i interfasekjerner i et cellesystem. Denne prosedyren har flere kritiske punkter som kan påvirke utfallet av forsøkene, hovedsakelig midlene som brukes i fiksering og permeabilisering, typen antistoffer og deres fortynningsfaktorer og konsentrasjonen av mutagen.

Vedlikehold av proteinintegritet er grunnleggende siden immunfluorescensmetoden forventer å identifisere antigener som hovedsakelig er proteiner. I denne protokollen brukes metanol til å fikse lymfocytter. Dette trinnet er spesielt viktig siden alkohol virker ved å fortrenge vann og forårsake utfelling av oppløselige proteiner, mens de andre ikke faste cellulære komponentene kan fjernes ved vasking i en saltvannsbufferløsning, slik som PBS13.

En annen nøkkelpassasje er permeabilisering som utføres gjennom en blokkeringsløsning, som i dette tilfellet tillater både permeabilisering og blokkering. Blokkering utføres ved å legge FBS til løsningen: det binder proteinene i prøven og forhindrer antistoffer i å binde feil mål siden bindingen mellom FBS og det spesifikke målet for antistoffet senere kan brytes på grunn av den høye affiniteten mellom antistoffet og selve målet. Permeabilisering kan utføres ved bruk av flere løsningsmidler, i dette tilfellet brukes det ikke-ioniske vaskemiddelet Triton X-100: det interkalerer i et fosfolipid-dobbeltlag, solubiliserer plasmamembranen og forstyrrer denderetter 14.

Siden valget av effektive γH2AX- og 53BP1-antistoffer er avgjørende for suksessen til immunfluorescensen, anbefales det sterkt å bruke antistoffer med påvist pålitelighet. Det foreslås også å prøve flere fortynninger av antistoffene for å identifisere den best presterende konsentrasjonen.

Som foreløpige eksperimenter studerte vi forskjellige kontroller for å vurdere mulig bakgrunnsstøy eller autofluorescens. Spesielt brukte vi, i forskjellige eksperimenter, bare de primære antistoffene, bare de sekundære antistoffene, hver flekk individuelt og ingen farging. Som forventet, i nærvær av primære / sekundære antistoffer, observerte vi ikke noe fokus, mens vi observerte enten grønne eller røde fluorescerende flekker (indikerer tilstedeværelsen av enten γH2AX eller 53BP1 foci) når vi utførte protokollen med hver flekk individuelt. Når det gjaldt ingen fargekontroller, observerte vi bakgrunnsstøy/autofluorescens, noe som manifesterer seg ved diffus farging. I stedet, etter å ha utført immunfluorescensprotokollen, er γH2AX eller 53BP1 foci tydelig synlige i de brune mørke kjernene som grønne eller røde signaler under passende filter for de brukte fluorokromene (FITC eller TRITC). Dermed påvirker bakgrunnsstøy / autofluorescens ikke på en signifikant måte identifiseringen av foci, også fordi vi brukte spesifikke kriterier for å vurdere om en fluorescerende flekk er et riktig fokus (dvs. under mikroskopets fokusering bør γ-H2AX og 53BP1 foci ikke være på samme fokalplan av andre fluorescerende flekker som potensielt er tilstede utenfor cellekjernen). Disse kriteriene er valgt fordi de både lar oss redusere subjektiviteten og gjøre virkningen av bakgrunnsstøy/autofluorescens ubetydelig.

Bleomycin er et radikalbasert mutagen som induserer DSB ved det svært spesifikke frie radikalangrepet på deoksyribose, på en veldig lik måte som hvordan lav LET ioniserende stråling (IR) virker. Dermed er bleomycin definert som et radiomimetisk middel15. Siden en stor mengde bleomycinindusert DSB kan påvirke spredningen av lymfocytter og i verste fall aktivere apoptose, anbefales det å teste flere konsentrasjoner av mutagen for å identifisere en dose som kan føre til DSBs dannelse uten at cytotoksisitet kan resultere.

Flere studier viser at den viktigste veien for å reparere IR-indusert DSB er NHEJ, som fremmes av tilstedeværelsen av 53BP1 nær lesjonen16,17. Imidlertid, selv om en større mengde 53BP1-foci kan forventes å oppstå etter behandling med bleomycin, som virker på samme måte som IR, observerte vi i vår studie en høyere frekvens av γH2AX enn 53BP1 foci. Den største fordelen med γH2AX og 53BP1 foci-analysen er avhengig av evnen til å evaluere den cellulære responsen i enten eksponering eller patologiske sammenhenger. Faktisk er det velkjent at γH2AX og 53BP1 foci er pålitelige og etablerte markører for IR-effekter18, samt tilstedeværelsen av γH2AX foci representerer en viktig prognostisk faktor i flere former for kreft19, eller mer generelt samtykker de til å bestemme evnen til agenter eller kjemikalier for å øke DSBs forekomst. Videre kan γH2AX og 53BP1 foci evalueres for å etablere en mulig sammenheng mellom DSB økning og en viss sykdom 20,21, for å verifisere en behandling med tanke på respons på behandlingen 22,23, eller for å estimere tumor radiosensitivitet 24.

γH2AX og 53BP1 foci-analyser er mye brukt for å kvantifisere DSB, men forfatterne må understreke at begge metodene har begrensninger: Hovedbekymringen består i at de ikke selv oppdager DSB, men to spesifikke faktorer involvert i reparasjonsprosesser. Tatt i betraktning at reparasjonskinetikken er svært variabel25, kan tolkningen av resultatene være tvetydig.

Den foreliggende studien indikerer imidlertid at bruk av dobbel immunfluorescens for samtidig å kvantifisere γH2AX og 53BP1 foci kan føre til flere problemer i tolkningen av resultatene. Dette skyldes hovedsakelig både høyere forekomst av γH2AX enn 53BP1 ved DSBs lokaliteter og de lave nivåene av samlokaliserte fluorescenssignaler for de to markørene som vi har observert etter bleomycinbehandling. På den annen side forblir histon H2AX fosforylert på Ser-139 fra det tidspunktet en DSB vises til den er reparert, mens 53BP1 er et protein som rekrutteres under mer spesifikke forhold, for eksempel når bare NHEJ kan aktiveres, også 53BP1 er sterkt dominerende under G1-fasen av cellesyklus25. Videre kan 53BP1 faktisk ha blitt rekruttert der en DSB har oppstått sammen med γH2AX, men vedvarer i kortere tid, og derfor ikke kan lokalisere den og γH2AX samtidig. Men hvis forskeren anser det mer hensiktsmessig å utføre en dobbel immunfluorescens, som vi har gitt en detaljert og pålitelig protokoll for, er det viktig å vurdere at denne metoden iboende kan føre til undervurdering av den sanne frekvensen av hendelsen, som beskrevet ovenfor. Samtidig, for ikke å overvurdere hendelsen, bør man unngå å telle de samlokaliserte γH2AX og 53BP1-fociene som to forskjellige steder, siden det faktisk indikerer tilstedeværelsen av bare en DSB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige overfor blodgiverne og alt helsepersonellet som tok blodprøvene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) Invitrogen A21124 53BP1 secondary antibody
Bleoprim Sanofi bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X Euroclone ECB3001D antibiotics for culture medium
PBS 10X Termofisher 14200075 Phosphate-buffered saline
FBS Euroclone EC20180L Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated Termofisher #35552 γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody Merck MAB 3802 53BP1 primary antibody
Labophot 2 Nikon Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody Cell Signaling #2577 γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin Termofisher R30852801 component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640 Euroclone ECB9006L Culture medium
Triton-X100 Sigma T9284 Nonionic detergent for permeabilization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 197
Dobbel immunfluorescens av γH2AX og 53BP1 i humane perifere lymfocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Falaschi, A., Chiaramonte, A.,… More

Falaschi, A., Chiaramonte, A., Testi, S., Scarpato, R. Dual Immunofluorescence of γH2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes. J. Vis. Exp. (197), e65472, doi:10.3791/65472 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter