Summary
Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.
Abstract
As quebras de fita dupla (DSBs) são uma das lesões mais graves que podem ocorrer nos núcleos celulares e, se não reparadas, podem levar a desfechos graves, incluindo câncer. A célula é, portanto, provida de mecanismos complexos para reparar DSBs, e essas vias envolvem histona H2AX em sua forma fosforilada em Ser-139 (ou seja, γH2AX) e proteína ligadora de p53 1 (53BP1). Como ambas as proteínas podem formar focos nos sítios dos DSBs, a identificação desses marcadores é considerada um método adequado para estudar tanto os DSBs quanto sua cinética de reparo. De acordo com os processos moleculares que levam à formação dos focos γH2AX e 53BP1, poderia ser mais útil investigar sua co-localização perto dos DSBs, a fim de estabelecer uma abordagem alternativa que permita quantificar os DSBs pela detecção simultânea de dois marcadores de dano ao DNA. Assim, este protocolo tem como objetivo avaliar o dano genômico induzido em linfócitos humanos pelo agente radiomimético bleomicina através da presença de focos γH2AX e 53BP1 em imunofluorescência dupla. Usando essa metodologia, também delineamos a variação no número de focos γH2AX e 53BP1 ao longo do tempo, como uma tentativa preliminar de estudar a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina.
Introduction
O dano ao DNA é continuamente induzido por agentes que podem ser endógenos, como as EROs geradas pelo metabolismo oxidativo celular, ou exógenos, tanto químicos quanto físicos1. Dentre as lesões mais lesivas, as quebras de dupla fita (DSBs) têm papel fundamental na contribuição para a instabilidade genômica, uma vez que causam aberrações cromossômicas que, por sua vez, podem iniciar o processo de carcinogênese. Assim, as células são providas de mecanismos complexos e eficientes de reparo deDSBs 2.
Quando ocorre um DSB, a célula desencadeia a resposta de dano ao DNA (DDR) onde, juntamente com o complexo MRE11/RAD50/NBS1, as quinases ATM ou ATR são recrutadas para ativar outras proteínas que retardam ou interrompem o ciclo celular3. Um alvo essencial dessas quinases é a histona H2AX, que é fosforilada em Ser-139 dentro de algumas megabases dos DSBs (ou seja, γH2AX), permitindo assim o recrutamento de vários fatores de reparo, tais como, entre outros, BRCA1 e proteína ligadora de p53 1 (53BP1)3. Posteriormente, uma via entre recombinação homóloga (HR), junção final não homóloga (NHEJ) ou recozimento de fita simples (SSA) é acionada para reparar os DSBs 4,5. Portanto, o 53BP1 está envolvido em ditar a escolha entre FC ou EJNH, promovendo principalmente a ativação do NHEJ ao invés da FC6. Além disso, tanto a forma fosforilada da histona H2AX quanto a 53BP1 podem formar focos nos sítios dos DSBs. Como esses focos persistem até que a integridade da dupla fita seja restaurada, avaliar o aparecimento/desaparecimento dos focos γH2AX ou 53BP1 em um intervalo de tempo é considerado um método útil para avaliar a ocorrência e o reparo de DSBs em um sistema celular 6,7. No entanto, de acordo com os processos moleculares descritos acima, uma vez que se espera que os focos de γH2AX e 53BP1 co-localizem próximos aos DSBs durante aDDR8,9, pode ser útil detectar concomitantemente a presença desses marcadores em uma imunofluorescência dupla.
Assim, o objetivo deste artigo foi avaliar a adequação da quantificação simultânea dos focos γH2AX e 53BP1 para avaliar o dano genômico induzido em linfócitos periféricos humanos pelo agente radiomimético bleomicina. Usando a mesma metodologia, também tentamos delinear a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina de acordo com um procedimento experimental previamente estabelecido10.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Pisa, e consentimento informado e assinado foi obtido de cada doador.
1. Formação dos focos γH2AX e 53BP1
- Preparação de amostras e tratamento mutagénico
- Coletar amostras de sangue total por punção venosa de indivíduos adultos saudáveis em tubos de coleta de sangue (por exemplo, Vacutainer) contendo heparina de lítio como anticoagulante.
- Para garantir a preservação adequada da amostra de sangue, inicie o procedimento em até 24 h após a amostragem.
- Adicionar 300 μL da amostra a um tubo contendo 4,7 mL de meio completo (penicilina-estreptomicina a 0,5%, fitohemaglutinina a 0,75%, SFB a 10% previamente inativado, RPMI 1640 a 88,75%).
- Em seguida, adicione sulfato de bleomicina a uma concentração final de 5 μg/mL.
CUIDADO: O sulfato de bleomicina é um agente mutagênico. Evite o contato com a pele e a inalação. Prepare a solução e adicione a amostra sob um capuz. - Para cada amostra, estabelecer um controlo negativo (ausência de agente mutagénico).
- Colocar o tubo num termóstato a 37 °C durante 2 horas.
- Fixação
- Centrifugar amostras a 540 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet com vórtice.
- Adicionar 5 mL de solução hipotônica (2,87 g de KCl dissolvido em 500 mL de água deionizada) e 400 μL de solução pré-fixadora (ácido acético 5:3: metanol) para causar hemólise das hemácias.
- Centrifugar amostras a 540 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de metanol à temperatura ambiente por pelo menos 30 min para fixar as células.
- Em alternativa, conservar as células a -20 °C até à utilização.
- Preparação de slides
- Centrifugar amostras a 540 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de uma solução de metanol: ácido acético 3:1. Repita essas etapas mais uma vez.
- No final, centrifugar novamente a solução a 540 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar novamente o sobrenadante deixando solução suficiente (0,5 mL) para ressuspender o pellet, pipetar vigorosamente, soltar o pellet de célula ressuspensa nas lâminas e secar ao ar. Conservar as lâminas a 4 °C.
- Imunofluorescência
NOTA: A imunofluorescência é um método imunológico para identificar alvos celulares específicos usando um anticorpo primário que se liga ao próprio alvo e um anticorpo secundário fluorescente que se liga ao primário que permite localizar o alvo11. Neste caso, um anti-53BP1 monoclonal de camundongo (1:50) e um anti-γH2AX policlonal de coelho (1:50) são usados como anticorpos primários, enquanto AlexaFluor568 anti-camundongo (1:400) e DyLight488 anti-coelho (1:200) são usados como anticorpos secundários, respectivamente.- Lavar as lâminas duas vezes em 50 mL de PBS 1x por 5 min em frasco couplin (16 lâminas consecutivas).
- Em seguida, mantê-los por 30 min em solução de bloqueio (10 mL de FBS, 10 mL de PBS 10x, 80 mL de água deionizada, 300 μL de Triton-X).
- Adicionar a cada lâmina 10 μL de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos primários dissolvidos na solução de bloqueio. Cubra as lâminas com fita adesiva de parafina e incube a 4 °C durante a noite.
- Após a incubação, realizar três lavagens em PBS 1x por 5 min.
- Adicionar a cada lâmina 10 μL de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos secundários dissolvidos na solução de bloqueio. Cobrir as lâminas com fita parafínica e incubar à temperatura ambiente durante 2 h.
- Realize três lavagens em 1x PBS por 5 min.
- Adicionar 2,5 μL de solução antifade com DAPI nas lamínulas antes da montagem para contramanchar os núcleos.
NOTA: Para avaliar a cinética dos focos, o procedimento é o mesmo descrito de 1,1 a 1,4, observando que a coleta de células e a imunofluorescência dupla são realizadas em 0 h, após 2 h pós-tratamento com bleomicina e depois, após a remoção do mutagênio, em 4 h, 6 h e 24 h pós-tratamento.
2. Análise através de microscópio de fluorescência
NOTA: "Microscópio de fluorescência" refere-se a qualquer microscópio que usa fluorescência para gerar uma imagem. O espécime é iluminado com luz de um comprimento de onda específico (ou comprimentos de onda) que é absorvida pelos fluoróforos, fazendo com que eles emitam luz de comprimentos de onda mais longos12. AlexaFluor568 e DyLight 488 absorvem luz de aproximadamente 568 e 488 nm e emitem luz de 603 e 520 nm, respectivamente. Assim, eles são visíveis como fluorescência vermelha ou verde usando um filtro TRITC ou FITC, respectivamente.
- Pontuar a presença de focos em cada lâmina sob uma objetiva de imersão de 100x (Figura 1).
- Escore 200 núcleos por lâmina e conte o número de focos γH2AX/53BP1 em cada núcleo.
- Resultados expressos em termos do número médio de focos por núcleo total pontuado. Estes incluem núcleos γH2AX/53BP1 positivos (mostrando pelo menos um sinal de fluorescência) e negativos (não mostrando nenhum sinal de fluorescência).
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Representative Results
Os dados obtidos pela análise em microscópio de fluorescência de linfócitos periféricos permitem avaliar três aspectos principais: a eficácia do tratamento com bleomicina em aumentar o número de focos γH2AX e 53BP1 (e, portanto, de DSBs) devido ao seu efeito mutagênico, em que medida ambos os focos co-localizados no local dos DSBs e o tempo-curso dos focos γH2AX e 53BP1 para delinear a cinética de reparo de DSBs induzidos por bleomicina. Como esperado, uma frequência muito maior de focos γH2AX e 53BP1 foi observada entre as células não tratadas e tratadas, confirmando que a bleomicina induz a formação de DSBs em linfócitos periféricos (Figura 2).
Observou-se grande diferença no número de focos dos dois marcadores; em particular, os focos de γH2AX foram mais numerosos que os de 53BP1, indicando que a co-localização nem sempre ocorre e pode depender de múltiplos fatores (Figura 3).
Em relação à cinética de reparo dos DSBs, em primeiro lugar, é importante ressaltar como o reparo real dos focos pode começar antes do primeiro ponto de tempo selecionado, que é de 2 h, e que, em vários momentos, podemos observar focos recém-formados, bem como focos que foram formados anteriormente e que ainda não foram reparados.
Levando-se em consideração o que foi dito anteriormente, o tempo-curso dos focos de γH2AX e 53BP1 ao longo do tempo mostrou um comportamento diferente, embora contribuam para a mesma função. Os focos de γH2AX aumentaram após 2h pós-tratamento, iniciando então uma redução progressiva, sem, no entanto, atingir o valor de controle em 24 h após o tratamento. Na variância, a frequência de focos de 53BP1 aumentou até 4 h pós-tratamento, diminuiu em 6 h e retornou ao maior valor 24 h após o tratamento (Figura 4).
Figura 1: Imunofluorescência dupla em linfócitos periféricos humanos para γH2AX e 53BP1: (A) núcleos sem focos γH2AX e 53BP1 antes do tratamento com bleomicina, (B) e (C) núcleos com diferentes quantidades de focos γH2AX e 53BP1 devido ao tratamento com bleomicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação entre linfócitos não tratados e tratados com bleomicina (5 μg/mL) para os dois marcadores de DSBs. As barras de erro representam SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação entre a quantidade total (espontânea e induzida por mutagênio) dos focos γH2AX e 53BP1. As barras de erro representam SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cinética dos focos de γH2AX e 53BP1. 0 h, 2 h, 4h, 6 h e 24 h representam os diferentes momentos em que os linfócitos foram coletados; barras de erro representam SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A análise por imunofluorescência dos focos γH2AX e 53BP1 é um método adequado para avaliar danos genômicos em núcleos interfásicos de um sistema celular. Esse procedimento possui vários pontos críticos que podem afetar o resultado dos experimentos, principalmente, os agentes utilizados na fixação e permeabilização, o tipo de anticorpos e seus fatores de diluição, e a concentração do mutagênico.
A manutenção da integridade proteica é fundamental, uma vez que o método de imunofluorescência espera identificar antígenos que são principalmente proteínas. Nesse protocolo, o metanol é usado para fixar linfócitos. Essa etapa é particularmente importante, pois o álcool age deslocando a água e causando a precipitação de proteínas solúveis, enquanto os outros componentes celulares não fixos podem ser removidos por lavagem em solução tampão salina, como o PBS13.
Outra passagem fundamental é a permeabilização, que é realizada através de uma solução de bloqueio, que neste caso permite tanto a permeabilização quanto o bloqueio. O bloqueio é realizado pela adição de FBS à solução: ele liga as proteínas na amostra e impede que os anticorpos se liguem ao alvo errado, uma vez que a ligação entre FBS e o alvo específico do anticorpo pode ser quebrada posteriormente devido à alta afinidade entre o anticorpo e o próprio alvo. A permeabilização pode ser realizada com o uso de vários solventes, neste caso, utiliza-se o detergente não iônico Triton X-100: ele intercala em uma bicamada fosfolipídica, solubilizando a membrana plasmática e rompendo-a14.
Como a escolha de anticorpos γH2AX e 53BP1 eficientes é crucial para o sucesso da imunofluorescência, recomenda-se fortemente o uso de anticorpos de confiabilidade comprovada. Sugere-se também tentar várias diluições dos anticorpos para identificar a concentração de melhor desempenho.
Como experimentos preliminares, estudamos diferentes controles para avaliar possíveis ruídos de fundo ou autofluorescência. Notadamente, usamos, em diferentes experimentos, apenas os anticorpos primários, os anticorpos secundários apenas, cada coloração individualmente e nenhuma coloração. Como esperado, na presença apenas de anticorpos primários/secundários, não observamos nenhum foco, enquanto observamos manchas fluorescentes verdes ou vermelhas (indicando a presença de focos γH2AX ou 53BP1) quando realizamos o protocolo com cada coloração individualmente. Em relação aos controles sem coloração, observou-se ruído de fundo/autofluorescência, que se manifesta com coloração difusa. Em vez disso, após a realização do protocolo de imunofluorescência, os focos de γH2AX ou 53BP1 são claramente visíveis nos núcleos marrom-escuros como sinais verdes ou vermelhos sob o filtro apropriado para os fluorocromos usados (FITC ou TRITC). Assim, o ruído de fundo/autofluorescência não influencia de forma significativa a identificação dos focos, também porque utilizamos critérios específicos para avaliar se um ponto fluorescente é um foco adequado (ou seja, durante a focalização do microscópio, os focos de γ-H2AX e 53BP1 não devem estar no mesmo plano focal de outros pontos fluorescentes potencialmente presentes fora do núcleo celular). Esses critérios foram escolhidos porque ambos permitem reduzir a subjetividade e tornar o impacto do ruído de fundo/autofluorescência insignificante.
A bleomicina é um mutagênio de base radical que induz DSBs pelo ataque altamente específico de radicais livres à desoxirribose, de forma muito semelhante à baixa radiação ionizante (IR) LET atua. Assim, a bleomicina é definida como um agente radiomimético15. Uma vez que uma grande quantidade de DSBs induzidos por bleomicina poderia afetar severamente a proliferação de linfócitos desencadeando, no pior cenário, a ativação da apoptose, sugere-se testar várias concentrações do mutagênio para identificar uma dose que possa levar à formação de DSBs sem resultar em citotoxicidade.
Vários estudos mostram que a principal via para o reparo de DSBs induzidos por RI é o NHEJ, que é promovido pela presença de 53BP1 próximo à lesão16,17. No entanto, embora se possa esperar que uma maior quantidade de focos de 53BP1 ocorra após o tratamento com bleomicina, que age de forma semelhante à RI, em nosso estudo, observamos uma frequência maior de focos de γH2AX do que de 53BP1. A principal vantagem da análise dos focos γH2AX e 53BP1 está na capacidade de avaliar a resposta celular em contextos de exposição ou patológicos. De fato, sabe-se que os focos γH2AX e 53BP1 são marcadores confiáveis e estabelecidos dos efeitos da RI18, assim como a presença de focos γH2AX representam um importante fator prognóstico em diversas formas decâncer19, ou, de forma mais geral, consentem em determinar a capacidade de agentes ou substâncias químicas em aumentar a ocorrência de BLS. Além disso, os focos de γH2AX e 53BP1 podem ser avaliados para estabelecer uma possível relação entre o aumento do DSB e uma determinada doença20,21, para verificar uma terapia em termos de resposta ao tratamento 22,23 ou para estimar a radiossensibilidade tumoral 24.
Os ensaios de focos γH2AX e 53BP1 são amplamente utilizados para quantificar os DSBs, no entanto, os autores devem ressaltar que ambos os métodos apresentam limitações: a principal preocupação consiste no fato de que eles não detectam DSBs em si, mas dois fatores específicos envolvidos nos processos de reparo. Assim, considerando que a cinética de reparo é altamentevariável25, a interpretação dos resultados poderia ser ambígua.
No entanto, o presente estudo indica que o uso de imunofluorescência dupla para quantificar simultaneamente os focos de γH2AX e 53BP1 poderia levar a vários problemas na interpretação dos resultados. Isso se deve principalmente à maior presença de γH2AX do que 53BP1 nos locais de DSBs e aos baixos níveis de sinais de fluorescência co-localizados para os dois marcadores que observamos após o tratamento com bleomicina. Por outro lado, a histona H2AX permanece fosforilada no Ser-139 desde o aparecimento de um DSB até que seja reparada, enquanto a 53BP1 é uma proteína que é recrutada em condições mais específicas, por exemplo, quando apenas NHEJ pode ser ativado, também, o 53BP1 é fortemente dominante durante a fase G1 do ciclo celular25. Além disso, o 53BP1 pode realmente ter sido recrutado quando um DSB ocorreu junto com γH2AX, mas persiste por um tempo mais curto e, portanto, a imunofluorescência dupla é incapaz de localizá-lo e γH2AX simultaneamente. No entanto, se o pesquisador julgar mais adequado realizar uma imunofluorescência dupla, para a qual fornecemos um protocolo detalhado e confiável, é importante considerar que esse método pode inerentemente levar a subestimar a verdadeira frequência do evento, como descrito acima. Ao mesmo tempo, para não superestimar o evento, deve-se evitar a contagem dos focos γH2AX e 53BP1 colocalizados como dois pontos diferentes, pois indica a presença de apenas um DSB.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Somos gratos aos doadores de sangue total e a todo o pessoal de saúde que colheu as amostras de sangue.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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