Summary
Este protocolo presenta un método para evaluar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante la detección simultánea de focos γH2AX y 53BP1 en núcleos interfase de linfocitos periféricos humanos tratados con bleomicina.
Abstract
Las roturas de doble cadena (DSB) son una de las lesiones más graves que pueden ocurrir en los núcleos celulares y, si no se reparan, pueden conducir a resultados graves, incluido el cáncer. Por lo tanto, la célula está provista de mecanismos complejos para reparar DSB, y estas vías involucran histona H2AX en su forma fosforilada en Ser-139 (es decir, γH2AX) y la proteína de unión a p53 1 (53BP1). Como ambas proteínas pueden formar focos en los sitios de los DSB, la identificación de estos marcadores se considera un método adecuado para estudiar tanto los DSB como su cinética de reparación. De acuerdo con los procesos moleculares que conducen a la formación de focos γH2AX y 53BP1, podría ser más útil investigar su colocalización cerca de los DSB para establecer un enfoque alternativo que permita cuantificar los DSB mediante la detección simultánea de dos marcadores de daño en el ADN. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar el daño genómico inducido en linfocitos humanos por el agente radiomimético bleomicina a través de la presencia de focos γH2AX y 53BP1 en una inmunofluorescencia dual. Usando esta metodología, también delineamos la variación en el número de focos γH2AX y 53BP1 a lo largo del tiempo, como un intento preliminar de estudiar la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina.
Introduction
El daño del ADN es inducido continuamente por agentes que pueden ser endógenos, como ROS generados por el metabolismo oxidativo celular, o exógenos, tanto químicos como físicos1. Entre las lesiones más dañinas, las roturas de doble cadena (DSB) juegan un papel fundamental para contribuir a la inestabilidad genómica, ya que causan aberraciones cromosómicas que a su vez pueden iniciar el proceso de carcinogénesis. Por lo tanto, las células están provistas de mecanismos complejos y eficientes de reparación de DSB2.
Cuando se produce un DSB, la célula desencadena la respuesta al daño del ADN (DDR) donde, junto con el complejo MRE11/RAD50/NBS1, se reclutan quinasas ATM o ATR para activar otras proteínas que ralentizan o detienen el ciclo celular3. Una diana esencial de estas quinasas es la histona H2AX, que se fosforila en Ser-139 dentro de unas pocas megabases de los DSB (a saber, γH2AX), lo que permite el reclutamiento de varios factores de reparación como, entre otros, BRCA1 y la proteína de unión a p53 1 (53BP1)3. Más tarde, se activa una vía entre la recombinación homóloga (HR), la unión final no homóloga (NHEJ) o el recocido de una sola hebra (SSA) para reparar los DSB 4,5. Por lo tanto, 53BP1 está involucrado en dictar la elección entre HR o NHEJ, promoviendo principalmente la activación de NHEJ en lugar de HR6. Además, tanto la forma fosforilada de la histona H2AX como la 53BP1 pueden formar focos en los sitios de los DSB. Como estos focos persisten hasta que se restaura la integridad de la doble cadena, la evaluación de la aparición/desaparición de focos γH2AX o 53BP1 dentro de un intervalo de tiempo se considera un método útil para evaluar la ocurrencia y reparación de DSB en un sistema celular 6,7. Sin embargo, de acuerdo con los procesos moleculares descritos anteriormente, dado que se espera que los focos γH2AX y 53BP1 se colocalicen cerca de los DSB durante la DDR8,9, puede ser útil detectar simultáneamente la presencia de estos marcadores en una inmunofluorescencia dual.
Por lo tanto, el objetivo de este manuscrito fue evaluar la idoneidad de la cuantificación simultánea de los focos γH2AX y 53BP1 para evaluar el daño genómico inducido en linfocitos periféricos humanos por el agente radiomimético bleomicina. Utilizando la misma metodología, también intentamos delinear la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina de acuerdo con un procedimiento experimental previamente establecido10.
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Protocol
El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Pisa, y se obtuvo el consentimiento informado y firmado de cada donante.
1. Formación de focos γH2AX y 53BP1
- Preparación de muestras y tratamiento mutagénico
- Recolectar muestras de sangre total por venopunción de individuos adultos sanos en tubos de recolección de sangre (por ejemplo, Vacutainer) que contienen heparina de litio como anticoagulante.
- Para garantizar la conservación adecuada de la muestra de sangre, comience el procedimiento dentro de las 24 h posteriores al muestreo.
- Añadir 300 μL de la muestra a un tubo que contenga 4,7 mL de medio completo (0,5% penicilina-estreptomicina, 0,75% fitohemaglutinina, 10% FBS previamente inactivado, 88,75% RPMI 1640).
- Luego agregue sulfato de bleomicina a una concentración final de 5 μg / ml.
PRECAUCIÓN: El sulfato de bleomicina es un mutágeno. Evite el contacto con la piel y la inhalación. Prepare la solución y agregue la muestra debajo de una campana. - Para cada muestra, establecer un control negativo (ausencia de mutágeno).
- Colocar el tubo en un termostato a 37 °C durante 2 h.
- Fijación
- Centrifugar muestras a 540 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet con vórtice.
- Añadir 5 ml de solución hipotónica (2,87 g de KCl disuelto en 500 ml de agua desionizada) y 400 μL de solución prefijadora (ácido acético 5:3: metanol) para causar hemólisis de los glóbulos rojos.
- Centrifugar muestras a 540 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5 ml de metanol a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para fijar las células.
- Alternativamente, almacenar las celdas a -20 °C hasta su uso.
- Preparación de diapositivas
- Centrifugar muestras a 540 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5 mL de una solución de ácido acético 3:1 metanol. Repita estos pasos una vez más.
- Al final, centrifugar la solución de nuevo a 540 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirar de nuevo el sobrenadante dejando suficiente solución (0,5 ml) para resuspender el pellet, pipetear vigorosamente, dejar caer el pellet de células resuspendidas sobre los portaobjetos y secar al aire. Conservar los portaobjetos a 4 °C.
- Inmunofluorescencia
NOTA: La inmunofluorescencia es un método inmunológico para identificar dianas celulares específicas utilizando un anticuerpo primario que se une al objetivo en sí y un anticuerpo secundario fluorescente que se une al primario que permite localizar el objetivo11. En este caso, un anti-53BP1 monoclonal de ratón (1:50) y un anti-γH2AX policlonal de conejo (1:50) se utilizan como anticuerpos primarios, mientras que AlexaFluor568 anti-ratón (1:400) y DyLight488 anti-conejo (1:200) se utilizan como anticuerpos secundarios, respectivamente.- Lave los portaobjetos dos veces en 50 ml de 1x PBS durante 5 minutos en un frasco de cuplin (16 portaobjetos seguidos).
- Luego manténgalos durante 30 minutos en solución de bloqueo (10 ml de FBS, 10 ml de 10x PBS, 80 ml de agua desionizada, 300 μL de Triton-X).
- Añadir a cada portaobjetos 10 μL de cada una de las dos soluciones que contienen los anticuerpos primarios disueltos en la solución bloqueante. Cubrir los portaobjetos con cinta adhesiva de parafina e incubar a 4 °C durante la noche.
- Después de la incubación, realice tres lavados en 1x PBS durante 5 min.
- Añadir a cada portaobjetos 10 μL de cada una de las dos soluciones que contienen los anticuerpos secundarios disueltos en la solución de bloqueo. Cubrir los portaobjetos con cinta adhesiva de parafina e incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
- Realice tres lavados en 1x PBS durante 5 min.
- Añadir 2,5 μL de solución antidecoloración con DAPI en los cubreobjetos antes del montaje para contrarrestar los núcleos.
NOTA: Para evaluar la cinética de los focos, el procedimiento es el mismo que el descrito de 1,1 a 1,4, teniendo en cuenta que la recolección celular y la inmunofluorescencia dual se realizan a las 0 h, después de 2 h después del tratamiento con bleomicina y luego, después de haber eliminado el mutágeno, a las 4 h, 6 h y 24 h después del tratamiento.
2. Análisis a través de un microscopio de fluorescencia
NOTA: "Microscopio de fluorescencia" se refiere a cualquier microscopio que utiliza fluorescencia para generar una imagen. La muestra se ilumina con luz de una longitud de onda específica (o longitudes de onda) que es absorbida por los fluoróforos, haciendo que emitan luz de longitudes de onda más largas12. AlexaFluor568 y DyLight 488 absorben luz de aproximadamente 568 y 488 nm y emiten luz de 603 y 520 nm, respectivamente. Por lo tanto, son visibles como fluorescencia roja o verde utilizando un filtro TRITC o FIFC, respectivamente.
- Puntúe la presencia de focos en cada diapositiva bajo un objetivo de inmersión de 100x (Figura 1).
- Puntúe 200 núcleos por portaobjetos y cuente el número de focos γH2AX/53BP1 en cada núcleo.
- Exprese los resultados en términos del número promedio de focos por núcleo total puntuado. Estos incluyen núcleos γH2AX/53BP1 positivos (que muestran al menos una señal de fluorescencia) y negativos (que no muestran ninguna señal de fluorescencia).
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Representative Results
Los datos obtenidos por el análisis con microscopio de fluorescencia de linfocitos periféricos nos permiten evaluar tres aspectos principales: la efectividad del tratamiento con bleomicina para aumentar el número de focos de γH2AX y 53BP1 (y por lo tanto de DSB) debido a su efecto mutagénico, en qué medida ambos focos colocalizados en el sitio de los DSB, y el curso temporal de los focos de γH2AX y 53BP1 para delinear la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina. Como era de esperar, se observó una frecuencia muy alta de focos γH2AX y 53BP1 entre las células no tratadas y tratadas, confirmando así que la bleomicina induce la formación de DSB en linfocitos periféricos (Figura 2).
Se observó una gran diferencia en el número de focos de los dos marcadores; en particular, los focos γH2AX fueron más numerosos que los focos 53BP1, lo que indica que la colocalización no siempre ocurre y puede depender de múltiples factores (Figura 3).
En cuanto a la cinética de reparación de los DSB, en primer lugar, es importante subrayar cómo la reparación real de los focos puede comenzar antes del primer punto de tiempo seleccionado, que es de 2 h, y que en varios puntos de tiempo, podemos observar focos recién formados, así como focos que se han formado previamente y que aún no se han reparado.
Teniendo en cuenta lo dicho anteriormente, el curso temporal de los focos γH2AX y 53BP1 a lo largo del tiempo mostró un comportamiento diferente aunque contribuyan a la misma función. Los focos de γH2AX aumentaron después de 2 h después del tratamiento, y luego comenzaron una reducción progresiva, sin alcanzar, sin embargo, el valor de control a las 24 h después del tratamiento. En varianza, la frecuencia de focos 53BP1 aumentó hasta 4 h después del tratamiento, luego disminuyó a las 6 h y volvió al valor más alto 24 h después del tratamiento (Figura 4).
Figura 1: Inmunofluorescencia dual en linfocitos periféricos humanos para γH2AX y 53BP1: (A) núcleos sin focos γH2AX y 53BP1 antes del tratamiento con bleomicina, núcleos (B) y (C) con diferentes cantidades de focos γH2AX y 53BP1 debido al tratamiento con bleomicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación entre linfocitos no tratados y tratados con bleomicina (5 μg/ml) para los dos marcadores DSB. Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación entre la cantidad total (tanto espontánea como inducida por mutágenos) de focos γH2AX y 53BP1. Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: cinética de focos γH2AX y 53BP1. 0 h, 2 h, 4h, 6 h y 24 h representan los diferentes momentos en que se recolectaron los linfocitos; Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El análisis de inmunofluorescencia de los focos γH2AX y 53BP1 es un método adecuado para evaluar el daño genómico en los núcleos de interfase de un sistema celular. Este procedimiento tiene varios puntos críticos que pueden afectar el resultado de los experimentos, principalmente, los agentes utilizados en la fijación y permeabilización, el tipo de anticuerpos y sus factores de dilución, y la concentración del mutágeno.
El mantenimiento de la integridad de las proteínas es fundamental ya que el método de inmunofluorescencia espera identificar antígenos que son principalmente proteínas. En este protocolo, el metanol se utiliza para fijar linfocitos. Este paso es particularmente importante ya que el alcohol actúa desplazando el agua y causando la precipitación de proteínas solubles, mientras que los otros componentes celulares no fijos pueden eliminarse lavando en una solución tampón salina, como PBS13.
Otro paso clave es la permeabilización que se realiza a través de una solución de bloqueo, que en este caso permite tanto la permeabilización como el bloqueo. El bloqueo se realiza agregando FBS a la solución: se une a las proteínas en la muestra y evita que los anticuerpos se unan al objetivo incorrecto, ya que el enlace entre FBS y el objetivo específico del anticuerpo puede romperse más tarde debido a la alta afinidad entre el anticuerpo y el objetivo en sí. La permeabilización se puede realizar utilizando varios disolventes, en este caso, se utiliza el detergente no iónico Triton X-100: se intercala en una bicapa de fosfolípidos, solubilizando la membrana plasmática y luego interrumpiéndola14.
Como la elección de anticuerpos γH2AX y 53BP1 eficientes es crucial para el éxito de la inmunofluorescencia, se recomienda encarecidamente el uso de anticuerpos de probada fiabilidad. También se sugiere probar varias diluciones de los anticuerpos para identificar la concentración de mejor rendimiento.
Como experimentos preliminares, estudiamos diferentes controles con el fin de evaluar el posible ruido de fondo o autofluorescencia. En particular, utilizamos, en diferentes experimentos, solo los anticuerpos primarios, solo los anticuerpos secundarios, cada tinción individualmente y sin tinción. Como era de esperar, en presencia de anticuerpos primarios/secundarios solamente, no observamos ningún foco, mientras que observamos manchas fluorescentes verdes o rojas (indicando la presencia de focos γH2AX o 53BP1) cuando realizamos el protocolo con cada tinción individualmente. Con respecto a los controles sin tinción, observamos ruido de fondo/autofluorescencia, que se manifiesta con tinción difusa. En cambio, después de realizar el protocolo de inmunofluorescencia, los focos γH2AX o 53BP1 son claramente visibles en los núcleos marrón-oscuro como señales verdes o rojas bajo el filtro apropiado para los fluorocromos utilizados (FITC o TRITC). Por lo tanto, el ruido de fondo/autofluorescencia no influye de manera significativa en la identificación de focos, también porque utilizamos criterios específicos para evaluar si un punto fluorescente es un foco adecuado (es decir, durante el enfoque del microscopio, los focos γ-H2AX y 53BP1 no deben estar en el mismo plano focal de otros puntos fluorescentes potencialmente presentes fuera del núcleo celular). Estos criterios se han elegido porque nos permiten reducir la subjetividad y hacer que el impacto del ruido de fondo / autofluorescencia sea insignificante.
La bleomicina es un mutágeno basado en radicales que induce DSB por el ataque altamente específico de radicales libres sobre la desoxirribosa, de una manera muy similar a cómo actúa la radiación ionizante (IR) de bajo LET. Así, la bleomicina se define como un agente radiomimético15. Dado que una gran cantidad de DSB inducidos por bleomicina podría afectar gravemente la proliferación de linfocitos desencadenando, en el peor de los casos, la activación de la apoptosis, se sugiere probar varias concentraciones del mutágeno para identificar una dosis que pueda conducir a la formación de DSB sin dar lugar a citotoxicidad.
Varios estudios muestran que la principal vía para reparar los DSB inducidos por IR es NHEJ, que es promovida por la presencia de 53BP1 cerca de la lesión16,17. Sin embargo, aunque se podría esperar que ocurra una mayor cantidad de focos 53BP1 después del tratamiento con bleomicina, que actúa de manera similar a IR, en nuestro estudio, observamos una mayor frecuencia de γH2AX que los focos 53BP1. La principal ventaja del análisis de focos γH2AX y 53BP1 radica en la capacidad de evaluar la respuesta celular en contextos de exposición o patológicos. De hecho, es bien sabido que los focos γH2AX y 53BP1 son marcadores confiables y establecidos de los efectos IR18, así como la presencia de focos γH2AX representa un factor pronóstico importante en varias formas de cáncer19, o, más generalmente, consienten en determinar la capacidad de los agentes o productos químicos para aumentar la ocurrencia de DSB. Además, los focos γH2AX y 53BP1 pueden ser evaluados para establecer una posible relación entre el aumento de DSBs y una determinada enfermedad 20,21, para verificar una terapia en términos de respuesta al tratamiento 22,23, o para estimar la radiosensibilidad tumoral 24.
Los ensayos de focos γH2AX y 53BP1 son ampliamente utilizados para cuantificar los DSB, sin embargo, los autores deben subrayar que ambos métodos tienen limitaciones: la principal preocupación consiste en el hecho de que no detectan los DSB en sí mismos, sino dos factores específicos involucrados en los procesos de reparación. Así, considerando que la cinética de reparación es altamente variable25, la interpretación de los resultados podría ser ambigua.
Sin embargo, el presente estudio indica que el uso de inmunofluorescencia dual para cuantificar simultáneamente los focos γH2AX y 53BP1 podría conducir a varios problemas en la interpretación de los resultados. Esto se debe principalmente a la mayor presencia de γH2AX que 53BP1 en los sitios de DSB y a los bajos niveles de señales de fluorescencia colocalizadas para los dos marcadores que hemos observado después del tratamiento con bleomicina. Por otro lado, la histona H2AX permanece fosforilada en Ser-139 desde el momento en que aparece un DSB hasta que se repara, mientras que 53BP1 es una proteína que se recluta en condiciones más específicas, por ejemplo, cuando solo se puede activar NHEJ, además, 53BP1 es fuertemente dominante durante la fase G1 del ciclo celular25. Además, 53BP1 puede haber sido reclutado cuando se ha producido un DSB junto con γH2AX, pero persiste durante un tiempo más corto y, por lo tanto, la inmunofluorescencia dual no puede localizarlo y γH2AX simultáneamente. Sin embargo, si el investigador considera más apropiado realizar una inmunofluorescencia dual, para lo cual hemos proporcionado un protocolo detallado y confiable, es importante considerar que este método puede conducir inherentemente a subestimar la verdadera frecuencia del evento, como se describió anteriormente. Al mismo tiempo, para no sobreestimar el evento, se debe evitar contar los focos γH2AX y 53BP1 colocalizados como dos puntos diferentes, ya que indica la presencia de un solo DSB.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos los donantes de sangre y a todo el personal de salud que tomó las muestras de sangre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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