Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dubbel immunofluorescens av γH2AX och 53BP1 i humana perifera lymfocyter

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65472
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Summary

Detta protokoll presenterar en metod för att bedöma bildandet och reparationen av DNA-dubbelsträngsbrott genom samtidig detektion av γH2AX och 53BP1-foci i interfaskärnor av bleomycinbehandlade humana perifera lymfocyter.

Abstract

Dubbelsträngsbrott (DSB) är en av de allvarligaste lesionerna som kan uppstå i cellkärnor, och om de inte repareras kan de leda till allvarliga resultat, inklusive cancer. Cellen är därför försedd med komplexa mekanismer för att reparera DSB, och dessa vägar involverar histon H2AX i sin fosforylerade form vid Ser-139 (nämligen γH2AX) och p53-bindande protein 1 (53BP1). Eftersom båda proteinerna kan bilda foci på DSB: s platser anses identifiering av dessa markörer vara en lämplig metod för att studera både DSB och deras kinetik för reparation. Enligt de molekylära processer som leder till bildandet av γH2AX och 53BP1-foci kan det vara mer användbart att undersöka deras samlokalisering nära DSB för att skapa ett alternativt tillvägagångssätt som möjliggör kvantifiering av DSB genom samtidig detektion av två DNA-skademarkörer. Således syftar detta protokoll till att bedöma den genomiska skada som induceras i humana lymfocyter av det radiomimetiska medlet bleomycin genom närvaron av γH2AX och 53BP1-foci i en dubbel immunofluorescens. Med hjälp av denna metod avgränsade vi också variationen i antalet γH2AX och 53BP1-foci över tid, som ett preliminärt försök att studera reparationskinetiken hos bleomycininducerade DSB.

Introduction

DNA-skador induceras kontinuerligt av medel som kan vara endogena, såsom ROS genererad av cellulär oxidativ metabolism, eller exogen, både kemikalier och fysiska1. Bland de mest skadliga skadorna spelar dubbelsträngsbrott (DSB) en grundläggande roll för att bidra till genomisk instabilitet, eftersom de orsakar kromosomavvikelser som i sin tur kan initiera karcinogenesprocessen. Således är celler försedda med komplexa och effektiva mekanismer för DSB: s reparation2.

När en DSB inträffar utlöser cellen DNA-skaderesponsen (DDR) där, tillsammans med MRE11 / RAD50 / NBS1-komplexet, ATM- eller ATR-kinaser rekryteras för att aktivera andra proteiner som saktar ner eller stoppar cellcykeln3. Ett viktigt mål för dessa kinaser är histon H2AX, som fosforyleras på Ser-139 inom några megabaser från DSB (nämligen γH2AX), vilket möjliggör rekrytering av flera reparationsfaktorer såsom bland annat BRCA1 och p53-bindande protein 1 (53BP1)3. Senare utlöses en väg mellan homolog rekombination (HR), icke-homolog ändfogning (NHEJ) eller enkelsträngad glödgning (SSA) för att reparera DSB 4,5. Därför är 53BP1 involverad i att diktera valet mellan HR eller NHEJ, främst främja aktiveringen av NHEJ snarare än HR6. Dessutom kan både den fosforylerade formen av H2AX histon och 53BP1 bilda foci på DSB: s platser. Eftersom dessa foci kvarstår tills dubbelsträngens integritet återställs anses bedömning av utseendet / försvinnandet av γH2AX eller 53BP1-foci inom ett tidsintervall vara en användbar metod för att utvärdera förekomsten och reparationen av DSB i ett cellsystem 6,7. Enligt de molekylära processerna ovan beskrivna, eftersom γH2AX och 53BP1-foci förväntas samlokaliseras nära DSB under DDR8,9, kan det emellertid vara användbart att samtidigt detektera närvaron av dessa markörer i en dubbel immunofluorescens.

Syftet med detta manuskript var således att utvärdera lämpligheten av samtidig kvantifiering av γH2AX och 53BP1-foci för att bedöma den genomiska skada som induceras i humana perifera lymfocyter av det radiomimetiska medlet bleomycin. Med samma metodik försökte vi också avgränsa reparationskinetiken för bleomycininducerade DSB enligt en tidigare inrättad experimentell procedur10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studien godkändes av den etiska kommittén vid Pisa University, och informerat och undertecknat samtycke erhölls från varje donator.

1. Bildning av γH2AX och 53BP1 foci

  1. Beredning av prover och mutagen behandling
    1. Samla helblodprover genom venipunktur från friska vuxna individer i bloduppsamlingsrör (t.ex. Vacutainer) som innehåller litiumheparin som antikoagulant.
    2. För att garantera korrekt bevarande av blodprovet, starta proceduren inom 24 timmar efter provtagningen.
    3. Tillsätt 300 μL av provet till ett rör innehållande 4,7 ml komplett medium (0,5% penicillin-streptomycin, 0,75% fytohemagglutinin, 10% FBS tidigare inaktiverat, 88,75% RPMI 1640).
    4. Tillsätt sedan bleomycinsulfat till en slutlig koncentration av 5 μg/ml.
      VARNING: Bleomycinsulfat är ett mutagent. Undvik hudkontakt och inandning. Förbered lösningen och tillsätt provet under en huva.
    5. För varje prov, upprätta en negativ kontroll (frånvaro av mutagen).
    6. Placera röret i en termostat vid 37 °C i 2 timmar.
  2. Fixering
    1. Centrifugera proverna vid 540 x g i 5 min vid rumstemperatur.
    2. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten med virvel.
    3. Tillsätt 5 ml hypotonisk lösning (2,87 g KCl upplöst i 500 ml avjoniserat vatten) och 400 μL förfixativ lösning (5:3 ättiksyra: metanol) för att orsaka hemolys av röda blodkroppar.
    4. Centrifugera proverna vid 540 x g i 5 min vid rumstemperatur.
    5. Aspirera supernatanten och resuspendera pelleten i 5 ml metanol vid rumstemperatur i minst 30 minuter för att fixera cellerna.
    6. Alternativt kan cellerna förvaras vid -20 °C tills de används.
  3. Förberedelse av bilder
    1. Centrifugera proverna vid 540 x g i 5 min vid rumstemperatur.
    2. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i 5 ml av en 3:1 metanol: ättiksyralösning. Upprepa dessa steg en gång till.
    3. I slutet, centrifugera lösningen igen vid 540 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
    4. Aspirera supernatanten igen och lämna tillräckligt med lösning (0,5 ml) för att resuspendera pelleten, pipettera kraftigt, släpp den återsuspenderade cellpelleten på objektglasen och lufttorka. Förvara glasen vid 4 °C.
  4. Immunofluorescens
    OBS: Immunofluorescens är en immunologisk metod för att identifiera specifika cellmål med hjälp av en primär antikropp som binder själva målet och en fluorescerande sekundär antikropp som binder primären som möjliggör lokalisering av målet11. I detta fall används en mus monoklonal anti-53BP1 (1:50) och en kanin polyklonal anti-yH2AX (1:50) som primära antikroppar, medan AlexaFluor568 anti-mus (1:400) och DyLight488 anti-kanin (1:200) används som sekundära antikroppar.
    1. Tvätta glasen två gånger i 50 ml 1x PBS i 5 minuter i couplinburk (16 bilder rygg mot rygg).
    2. Håll dem sedan i 30 minuter i blockeringslösning (10 ml FBS, 10 ml 10x PBS, 80 ml avjoniserat vatten, 300 μL Triton-X).
    3. Tillsätt till varje objektglas 10 μl av var och en av de två lösningarna som innehåller de primära antikropparna upplösta i blockeringslösningen. Täck glasen med paraffintejp och inkubera vid 4 °C över natten.
    4. Efter inkubation, utför tre tvättar i 1x PBS i 5 minuter.
    5. Tillsätt till varje objektglas 10 μl av var och en av de två lösningarna som innehåller sekundära antikroppar upplösta i blockeringslösningen. Täck glasen med paraffintejp och inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar.
    6. Utför tre tvättar i 1x PBS i 5 min.
    7. Tillsätt 2,5 μL antifadelösning med DAPI på täckglasen före monteringen för att motfärga kärnorna.
      OBS: För att bedöma foci kinetik är proceduren densamma som beskrivs från 1.1 till 1.4, notera att cellskörd och dubbel immunofluorescens utförs vid 0 h, efter 2 h post-bleomycinbehandling och sedan, efter att ha avlägsnat mutagenet, vid 4 h, 6 h och 24 h efter behandling.

2. Analys genom ett fluorescensmikroskop

OBS: "Fluorescensmikroskop" avser alla mikroskop som använder fluorescens för att generera en bild. Provet belyses med ljus med en specifik våglängd (eller våglängder) som absorberas av fluoroforerna, vilket får dem att avge ljus med längre våglängder12. AlexaFluor568 och DyLight 488 absorberar ljus på cirka 568 och 488 nm och avger ljus på 603 respektive 520 nm. Således är de synliga som röd eller grön fluorescens med användning av ett TRITC- respektive ett FITC-filter.

  1. Poängsätt förekomsten av foci i varje bild under ett 100x nedsänkningsmål (figur 1).
  2. Gör 200 kärnor per bild och räkna antalet γH2AX / 53BP1-foci i varje kärna.
  3. Expressresultat i termer av det genomsnittliga antalet foci per totalt antal kärnor som poängsätts. Dessa inkluderar både γH2AX/53BP1 positiva (visar minst en fluorescenssignal) och negativa (visar inte någon fluorescenssignal) kärnor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data erhållna genom fluorescensmikroskopanalys av perifera lymfocyter tillåter oss att utvärdera tre huvudaspekter: effektiviteten av bleomycinbehandling för att öka antalet γH2AX och 53BP1-foci (och därmed DSB) på grund av dess mutagena effekt, i vilken utsträckning både foci samlokaliserade på DSB: s plats och tidsförloppet för γH2AX och 53BP1-foci för att avgränsa reparationskinetiken för bleomycininducerade DSB. Som förväntat observerades en mycket högre frekvens av både γH2AX och 53BP1 foci mellan obehandlade och behandlade celler, vilket bekräftar att bleomycin inducerar bildandet av DSB i perifera lymfocyter (figur 2).

En stor skillnad observerades i antalet foci för de två markörerna; i synnerhet var γH2AX-foci fler än 53BP1-foci, vilket indikerar att samlokalisering inte alltid sker och kan bero på flera faktorer (figur 3).

När det gäller reparationskinetiken för DSB är det först och främst viktigt att understryka hur den faktiska reparationen av foci kan börja före den första valda tidpunkten, som är 2 timmar, och att vi vid olika tidpunkter kan observera nybildade foci såväl som foci som har bildats tidigare och som inte har reparerats ännu.

Med hänsyn till vad som tidigare sagts visade tidsförloppet för γH2AX och 53BP1-foci över tiden ett annat beteende även om de bidrar till samma funktion. γH2AX-foci ökade efter 2 timmar efter behandlingen, och sedan började de en progressiv minskning, dock utan att nå kontrollvärdet vid 24 timmar efter behandlingen. Vid varians ökade frekvensen av 53BP1-foci fram till 4 timmar efter behandling, minskade sedan vid 6 timmar och återgick till det högsta värdet 24 timmar efter behandling (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Dubbel immunofluorescens i humana perifera lymfocyter för γH2AX och 53BP1: (A) kärnor utan γH2AX och 53BP1-foci före bleomycinbehandling, (B) och (C) kärnor med olika mängder γH2AX och 53BP1-foci på grund av bleomycinbehandling. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Jämförelse mellan obehandlade och bleomycinbehandlade (5 μg/ml) lymfocyter för de två DSB-markörerna. Felstaplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Jämförelse mellan den totala mängden (både spontan och mutageninducerad) av γH2AX och 53BP1-foci. Felstaplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: γH2AX och 53BP1 foci kinetik. 0 timmar, 2 timmar, 4 timmar, 6 timmar och 24 timmar representerar de olika tidpunkter vid vilka lymfocyter skördades; felstaplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunofluorescensanalys av γH2AX och 53BP1 foci är en lämplig metod för att bedöma genomisk skada i interfaskärnor i ett cellsystem. Denna procedur har flera kritiska punkter som kan påverka resultatet av experimenten, huvudsakligen de medel som används vid fixering och permeabilisering, typen av antikroppar och deras utspädningsfaktorer och koncentrationen av mutagenet.

Upprätthållandet av proteinintegritet är grundläggande eftersom immunofluorescensmetoden förväntar sig att identifiera antigener som huvudsakligen är proteiner. I detta protokoll används metanol för att fixera lymfocyter. Detta steg är särskilt viktigt eftersom alkohol verkar genom att förskjuta vatten och orsaka utfällning av lösliga proteiner, medan de andra inte fasta cellulära komponenterna kan avlägsnas genom tvättning i en saltlösningsbuffertlösning, såsom PBS13.

En annan nyckelpassage är permeabilisering som utförs genom en blockeringslösning, vilket i detta fall möjliggör både permeabilisering och blockering. Blockering utförs genom att tillsätta FBS till lösningen: det binder proteinerna i provet och förhindrar antikroppar från att binda fel mål eftersom bindningen mellan FBS och antikroppens specifika mål senare kan brytas på grund av den höga affiniteten mellan antikroppen och själva målet. Permeabilisering kan utföras med användning av flera lösningsmedel, i detta fall används det nonjoniska tvättmedlet Triton X-100: det interkalerar i ett fosfolipid-dubbelskikt, solubiliserar plasmamembranet och stör detsedan 14.

Eftersom valet av effektiva γH2AX- och 53BP1-antikroppar är avgörande för immunofluorescensens framgång, rekommenderas starkt användning av antikroppar med bevisad tillförlitlighet. Det rekommenderas också att prova flera utspädningar av antikropparna för att identifiera den bäst presterande koncentrationen.

Som preliminära experiment studerade vi olika kontroller för att bedöma eventuellt bakgrundsbrus eller autofluorescens. I synnerhet använde vi, i olika experiment, endast de primära antikropparna, endast de sekundära antikropparna, varje fläck individuellt och ingen färgning. Som förväntat, i närvaro av primära / sekundära antikroppar, observerade vi inget fokus, medan vi observerade antingen gröna eller röda fluorescerande fläckar (indikerar närvaron av antingen γH2AX eller 53BP1 foci) när vi utförde protokollet med varje fläck individuellt. När det gäller inga färgningskontroller observerade vi bakgrundsbrus / autofluorescens, vilket manifesterar sig med diffus färgning. Istället, efter att ha utfört immunofluorescensprotokollet, är γH2AX eller 53BP1-foci tydligt synliga i de brun-mörka kärnorna som gröna eller röda signaler under lämpligt filter för de använda fluorokromerna (FITC eller TRITC). Således påverkar bakgrundsbrus / autofluorescens inte på ett betydande sätt identifieringen av foci, också för att vi använde specifika kriterier för att bedöma om en fluorescerande punkt är ett korrekt fokus (dvs under mikroskopets fokusering bör γ-H2AX och 53BP1-foci inte vara på samma fokalplan för andra fluorescerande fläckar som potentiellt finns utanför cellkärnan). Dessa kriterier har valts eftersom de både låter oss minska subjektiviteten och göra effekten av bakgrundsbrus / autofluorescens försumbar.

Bleomycin är ett radikalbaserat mutagen som inducerar DSB genom den mycket specifika fria radikalattacken på deoxiribos, på ett mycket liknande sätt som hur låg LET-joniserande strålning (IR) verkar. Således definieras bleomycin som ett radiomimetisk medel15. Eftersom en stor mängd bleomycininducerade DSB allvarligt kan påverka spridningen av lymfocyter som i värsta fall utlöser aktivering av apoptos, föreslås att man testar flera koncentrationer av mutagent för att identifiera en dos som kan leda till DSB-bildning utan att resultera i cytotoxicitet.

Flera studier visar att den huvudsakliga vägen för att reparera IR-inducerade DSB är NHEJ, vilket främjas av närvaron av 53BP1 nära lesionen16,17. Även om en större mängd 53BP1-foci kan förväntas inträffa efter behandling med bleomycin, som fungerar på samma sätt som IR, observerade vi i vår studie en högre frekvens av γH2AX än 53BP1-foci. Den största fördelen med γH2AX och 53BP1 foci-analysen bygger på förmågan att utvärdera det cellulära svaret i antingen exponering eller patologiska sammanhang. Det är faktiskt välkänt att γH2AX och 53BP1-foci är tillförlitliga och etablerade markörer för IR-effekter18, liksom närvaron av γH2AX-foci representerar en viktig prognostisk faktor i flera former av cancer19, eller, mer allmänt, samtycker de till att bestämma förmågan hos medel eller kemikalier att öka DSB-förekomsten. Vidare kan γH2AX och 53BP1 foci utvärderas för att fastställa ett möjligt samband mellan DSB-ökning och en viss sjukdom20,21, för att verifiera en terapi när det gäller svar på behandlingen 22,23 eller för att uppskatta tumörens radiokänslighet 24.

γH2AX- och 53BP1-foci-analyser används ofta för att kvantifiera DSB, men författarna måste understryka att båda metoderna har begränsningar: huvudproblemet består i det faktum att de inte upptäcker DSB själva, utan två specifika faktorer som är involverade i reparationsprocesser. Med tanke på att reparationskinetiken är mycket variabel25 kan tolkningen av resultaten vara tvetydig.

Den aktuella studien indikerar dock att användningen av dubbel immunofluorescens för att samtidigt kvantifiera γH2AX och 53BP1-foci kan leda till flera problem i tolkningen av resultaten. Detta beror främst på både den högre närvaron av γH2AX än 53BP1 vid DSB-platser och de låga nivåerna av samlokaliserade fluorescenssignaler för de två markörerna som vi har observerat efter bleomycinbehandling. Å andra sidan förblir histon H2AX fosforylerad på Ser-139 från det att en DSB visas tills den repareras, medan 53BP1 är ett protein som rekryteras under mer specifika förhållanden, till exempel när endast NHEJ kan aktiveras, är 53BP1 också starkt dominerande under G1-fasen av cellcykel25. Dessutom kan 53BP1 faktiskt ha rekryterats där en DSB har inträffat tillsammans med γH2AX, men kvarstår under en kortare tid, och därför kan dubbel immunofluorescens inte lokalisera den och γH2AX samtidigt. Men om forskaren anser det mer lämpligt att utföra en dubbel immunofluorescens, för vilken vi har tillhandahållit ett detaljerat och tillförlitligt protokoll, är det viktigt att överväga att denna metod i sig kan leda till att underskatta händelsens verkliga frekvens, som beskrivits ovan. Samtidigt, för att inte överskatta händelsen, bör man undvika att räkna de samlokaliserade γH2AX och 53BP1-foci som två olika fläckar eftersom det verkligen indikerar närvaron av endast en DSB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma för helblodsgivarna och all vårdpersonal som tog blodproverna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) Invitrogen A21124 53BP1 secondary antibody
Bleoprim Sanofi bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X Euroclone ECB3001D antibiotics for culture medium
PBS 10X Termofisher 14200075 Phosphate-buffered saline
FBS Euroclone EC20180L Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated Termofisher #35552 γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody Merck MAB 3802 53BP1 primary antibody
Labophot 2 Nikon Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody Cell Signaling #2577 γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin Termofisher R30852801 component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640 Euroclone ECB9006L Culture medium
Triton-X100 Sigma T9284 Nonionic detergent for permeabilization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 197
Dubbel immunofluorescens av γH2AX och 53BP1 i humana perifera lymfocyter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Falaschi, A., Chiaramonte, A.,… More

Falaschi, A., Chiaramonte, A., Testi, S., Scarpato, R. Dual Immunofluorescence of γH2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes. J. Vis. Exp. (197), e65472, doi:10.3791/65472 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter