Summary
Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.
Abstract
Çift iplikçik kopmaları (DSB'ler), hücre çekirdeğinde meydana gelebilecek en ciddi lezyonlardan biridir ve onarılmazsa, kanser de dahil olmak üzere ciddi sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, hücreye DSB'leri onarmak için karmaşık mekanizmalar sağlanır ve bu yollar Ser-139 (yani γH2AX) ve p53 bağlayıcı protein 1'de (53BP1) fosforile edilmiş formunda histon H2AX'i içerir. Her iki protein de DSB'lerin bölgelerinde odaklar oluşturabildiğinden, bu belirteçlerin tanımlanması hem DSB'leri hem de onarım kinetiğini incelemek için uygun bir yöntem olarak kabul edilir. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumuna yol açan moleküler süreçlere göre, iki DNA hasar belirtecinin aynı anda tespiti ile DSB'lerin nicelleştirilmesine izin veren alternatif bir yaklaşım oluşturmak için DSB'lerin yakınındaki ko-lokalizasyonlarını araştırmak daha yararlı olabilir. Bu nedenle, bu protokol, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı, ikili immünofloresansta γH2AX ve 53BP1 odaklarının varlığı yoluyla değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini incelemek için bir ön girişim olarak, zaman içinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının sayısındaki değişimi de tanımladık.
Introduction
DNA hasarı, hücresel oksidatif metabolizma tarafından üretilen ROS veya hem kimyasallar hem de fiziksel1 gibi eksojen olabilen ajanlar tarafından sürekli olarak indüklenir. En zararlı lezyonlar arasında, çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler) genomik instabiliteye katkıda bulunmada temel bir rol oynar, çünkü bunlar karsinogenez sürecini başlatabilen kromozom anormalliklerine neden olurlar. Böylece hücrelere DSB'lerin onarımı2'nin karmaşık ve verimli mekanizmaları sağlanır.
Bir DSB meydana geldiğinde, hücre, MRE11 / RAD50 / NBS1 kompleksi ile birlikte, hücre döngüsü3'ü yavaşlatan veya durduran diğer proteinleri aktive etmek için ATM veya ATR kinazların işe alındığı DNA hasar yanıtını (DDR) tetikler. Bu kinazların temel bir hedefi, DSB'lerden (yani γH2AX) birkaç megabaz içinde Ser-139 üzerinde fosforile edilen histon H2AX'tir, böylece diğerlerinin yanı sıra BRCA1 ve p53 bağlayıcı protein 1 (53BP1)3 gibi çeşitli onarım faktörlerinin işe alınmasına izin verir. Daha sonra,DSB'leri 4,5'i onarmak için homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya tek iplikli tavlama (SSA) arasında bir yol tetiklenir. Bu nedenle, 53BP1, İK veya NHEJ arasındaki seçimi dikte etmede, esas olarak HR6 yerine NHEJ'nin aktivasyonunu teşvik etmede rol oynar. Dahası, hem H2AX histonun hem de 53BP1'in fosforile edilmiş formu, DSB'lerin bölgelerinde odaklar oluşturabilir. Bu odaklar, çift ipliğin bütünlüğü geri kazanılana kadar devam ettiğinden, γH2AX veya 53BP1 odaklarının bir zaman aralığında ortaya çıkışını / kaybolmasını değerlendirmek, bir hücre sisteminde DSB'lerin oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için yararlı bir yöntem olarak kabul edilir 6,7. Bununla birlikte, yukarıda tarif edilen moleküler süreçlere göre, γH2AX ve 53BP1 odaklarının DDR8,9 sırasında DSB'lerin yakınında birlikte lokalize olması beklendiğinden, bu belirteçlerin varlığını çift immünofloresanda eşzamanlı olarak tespit etmek yararlı olabilir.
Bu nedenle, bu makalenin amacı, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan periferik lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı değerlendirmek için γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı nicelleştirilmesinin uygunluğunu değerlendirmektir. Aynı metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini daha önce kurulmuş deneysel bir prosedür10'a göre tanımlamaya çalıştık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma Pisa Üniversitesi etik kurulu tarafından onaylanmış, her donörden bilgilendirilmiş ve imzalı onam alınmıştır.
1. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumu
- Numunelerin hazırlanması ve mutajenik tedavi
- Antikoagülan olarak lityum heparin içeren kan toplama (örneğin, Vacutainer) tüplerinde sağlıklı yetişkin bireylerden venipunktur yoluyla tam kan örnekleri toplayın.
- Uygun kan örneği korumasını garanti etmek için, numune alımından sonraki 24 saat içinde prosedürü başlatın.
- Numunenin 300 μL'sini 4.7 mL tam ortam içeren bir tüpe ekleyin (% 0.5 penisilin-streptomisin,% 0.75 fitohemaglutinin,% 10 FBS daha önce inaktive edilmiş,% 88.75 RPMI 1640).
- Daha sonra bleomisin sülfatı 5 μg / mL'lik bir son konsantrasyona ekleyin.
DİKKAT: Bleomisin sülfat bir mutajendir. Cilt temasından ve solumaktan kaçının. Çözeltiyi hazırlayın ve numuneyi bir başlık altına ekleyin. - Her numune için negatif bir kontrol ayarlayın (mutajen yokluğu).
- Tüpü 2 saat boyunca 37 ° C'de bir termostata yerleştirin.
- Fiksasyon
- Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.
- Süpernatantı aspire edin ve peleti vorteks ile yeniden askıya alın.
- Kırmızı kan hücrelerinin hemolizine neden olmak için 5 mL hipotonik çözelti (500 mL deiyonize suda çözünmüş 2.87 g KCl) ve 400 μL pre-fiksatif çözelti (5: 3 asetik asit: metanol) ekleyin.
- Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.
- Süpernatantı aspire edin ve hücreleri sabitlemek için peleti oda sıcaklığında 5 mL metanol içinde en az 30 dakika boyunca yeniden askıya alın.
- Alternatif olarak, hücreleri kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
- Slayt hazırlama
- Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.
- Süpernatantı aspire edin ve peleti 3: 1 metanolün 5 mL'sinde yeniden askıya alın: asetik asit çözeltisi. Bu adımları bir kez daha yineleyin.
- Sonunda, çözeltiyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de tekrar santrifüj edin.
- Pelet, pipeti kuvvetli bir şekilde askıya almak, yeniden askıya alınmış hücre peletini slaytlara bırakmak ve havayla kurutmak için yeterli çözelti (0.5 mL) bırakarak süpernatantı tekrar aspire edin. Slaytları 4 °C'de saklayın.
- İmmünofloresan
NOT: İmmünofloresan, hedefin kendisini bağlayan bir primer antikor ve hedef11'in lokalizasyonuna izin veren primere bağlanan bir floresan sekonder antikor kullanarak spesifik hücre hedeflerini tanımlamak için immünolojik bir yöntemdir. Bu durumda, birincil antikorlar olarak bir fare monoklonal anti-53BP1 (1:50) ve bir tavşan poliklonal anti-γH2AX (1:50) kullanılırken, ikincil antikorlar olarak sırasıyla AlexaFluor568 anti-fare (1:400) ve DyLight488 anti-tavşan (1:200) kullanılır.- Slaytları iki kez 50 mL 1x PBS içinde 5 dakika boyunca kuplin kavanozda yıkayın (arka arkaya 16 slayt).
- Daha sonra bunları bloke edici çözeltide 30 dakika bekletin (10 mL FBS, 10 mL 10x PBS, 80 mL deiyonize su, 300 μL Triton-X).
- Her slayta, blokaj çözeltisinde çözünmüş birincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 μL'sini ekleyin. Slaytları parafin bantla örtün ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 1x PBS'de üç yıkama yapın.
- Her slayta, blokaj çözeltisinde çözünmüş ikincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 μL'sini ekleyin. Slaytları parafin bantla örtün ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 1x PBS'de üç yıkama yapın.
- Çekirdekleri boyamak için montajdan önce kapaklara DAPI ile 2,5 μL antifade çözeltisi ekleyin.
NOT: Fok kinetiği değerlendirmek için, prosedür 1.1 ila 1.4 arasında tarif edilenle aynıdır, hücre hasadı ve ikili immünofloresansın 0 saatte, bleomisin tedavisinden 2 saat sonra ve daha sonra mutajeni çıkardıktan sonra, tedavi sonrası 4 saat, 6 saat ve 24 saatte gerçekleştirildiğini belirtmektedir.
2. Floresan mikroskobu ile analiz
NOT: "Floresan mikroskobu", bir görüntü oluşturmak için floresan kullanan herhangi bir mikroskopu ifade eder. Örnek, floroforlar tarafından emilen belirli bir dalga boyundaki (veya dalga boylarındaki) ışıkla aydınlatılır ve bu da daha uzun dalga boylarında ışık yaymalarına neden olur12. AlexaFluor568 ve DyLight 488, sırasıyla yaklaşık 568 ve 488 nm ışığı emer ve sırasıyla 603 ve 520 nm ışık yayar. Böylece, sırasıyla bir TRITC veya bir FITC filtresi kullanılarak kırmızı veya yeşil floresan olarak görülebilirler.
- Her slayttaki odakların varlığını 100x daldırma hedefi altında puanlayın (Şekil 1).
- Slayt başına 200 çekirdek puanlayın ve her çekirdekteki γH2AX/53BP1 odaklarının sayısını sayın.
- Ekspresyon sonuçları, puanlanan toplam çekirdek başına ortalama odak sayısı açısından ifade eder. Bunlar arasında hem γH2AX/53BP1 pozitif (en az bir floresan sinyali gösteren) hem de negatif (herhangi bir floresan sinyali göstermeyen) çekirdekler bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Periferik lenfositlerin floresan mikroskop analizi ile elde edilen veriler, üç ana yönü değerlendirmemize izin verir: bleomisin tedavisinin, mutajenik etkisinden dolayı γH2AX ve 53BP1 odaklarının (ve dolayısıyla DSB'lerin) sayısını arttırmadaki etkinliği, her iki odağın da DSB'lerin bölgesinde ne ölçüde birlikte lokalize olduğu ve bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini tanımlamak için γH2AX ve 53BP1 odaklarının zaman seyri. Beklendiği gibi, tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hücreler arasında hem γH2AX hem de 53BP1 odaklarının çok daha yüksek bir frekansı gözlendi, böylece bleomisinin periferik lenfositlerde DSB oluşumunu indüklediği doğrulandı (Şekil 2).
İki belirtecin odak sayısında büyük bir fark gözlenmiştir; Özellikle, γH2AX odakları 53BP1 odaklarından daha fazlaydı, bu nedenle birlikte lokalizasyonun her zaman gerçekleşmediğini ve birden fazla faktöre bağlı olabileceğini gösteriyor (Şekil 3).
DSB'lerin onarım kinetiği ile ilgili olarak, her şeyden önce, odakların gerçek onarımının ilk seçilen zaman noktası olan 2 saatten önce nasıl başlayabileceğinin altını çizmek önemlidir ve çeşitli zaman noktalarında, yeni oluşan odakların yanı sıra daha önce oluşmuş ve henüz onarılmamış odakları da gözlemleyebiliriz.
Daha önce söylenenler dikkate alındığında, γH2AX ve 53BP1 odaklarının zaman içindeki zaman seyri, aynı işleve katkıda bulunmalarına rağmen farklı bir davranış göstermiştir. γH2AX odakları tedaviden 2 saat sonra artmıştır ve daha sonra tedaviden 24 saat sonra kontrol değerine ulaşmadan ilerleyici bir azalmaya başlamışlardır. Varyansta, 53BP1 odaklarının sıklığı tedavi sonrası 4 saate kadar artmış, daha sonra 6 saatte azalmış ve tedavi sonrası 24 saat sonra en yüksek değere geri dönmüştür (Şekil 4).
Şekil 1: İnsan periferik lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1 için ikili immünofloresan: (A) bleomisin tedavisinden önce γH2AX ve 53BP1 odakları olmayan çekirdekler, (B) ve (C) bleomisin tedavisine bağlı farklı miktarlarda γH2AX ve 53BP1 odaklarına sahip çekirdekler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İki DSB belirteci için tedavi edilmemiş ve bleomisin ile tedavi edilmiş (5 μg / mL) lenfositler arasındaki karşılaştırma. Hata çubukları SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: γH2AX ve 53BP1 odaklarının toplam miktarı (hem spontan hem de mutajen kaynaklı) arasındaki karşılaştırma. Hata çubukları SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: γH2AX ve 53BP1 odakları kinetiği. 0 saat, 2 saat, 4 saat, 6 saat ve 24 saat, lenfositlerin toplandığı farklı zamanları temsil eder; hata çubukları SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
γH2AX ve 53BP1 odaklarının immünofloresan analizi, bir hücre sisteminin fazlar arası çekirdeklerinde genomik hasarı değerlendirmek için uygun bir yöntemdir. Bu prosedür, deneylerin sonucunu, özellikle fiksasyon ve geçirgenlikte kullanılan ajanları, antikorların tipini ve seyreltme faktörlerini ve mutajenin konsantrasyonunu etkileyebilecek birkaç kritik noktaya sahiptir.
İmmünofloresan yöntemi, esas olarak protein olan antijenleri tanımlamayı beklediği için protein bütünlüğünün korunması esastır. Bu protokolde, lenfositleri sabitlemek için metanol kullanılır. Bu adım özellikle önemlidir, çünkü alkol suyun yerini değiştirerek ve çözünür proteinlerin çökelmesine neden olarak hareket ederken, diğer sabit olmayan hücresel bileşenler PBS13 gibi bir tuzlu tampon çözeltisinde yıkanarak çıkarılabilir.
Bir diğer önemli geçiş, bu durumda hem geçirgenliğe hem de blokaja izin veren bir blokaj çözeltisi aracılığıyla gerçekleştirilen geçirgenleştirmedir. Blokaj, çözeltiye FBS eklenerek gerçekleştirilir: numunedeki proteinleri bağlar ve antikorların yanlış hedefe bağlanmasını önler, çünkü FBS ile antikorun spesifik hedefi arasındaki bağ, antikor ile hedefin kendisi arasındaki yüksek afinite nedeniyle daha sonra kırılabilir. Permeabilizasyon birkaç çözücü kullanılarak gerçekleştirilebilir, bu durumda, iyonik olmayan deterjan Triton X-100 kullanılır: plazma zarını çözündürerek ve daha sonra bozarak bir fosfolipid çift katmanına karışır14.
İmmünofloresanın başarısı için etkili γH2AX ve 53BP1 antikorlarının seçimi çok önemli olduğundan, güvenilirliği kanıtlanmış antikorların kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, en iyi performans gösteren konsantrasyonu belirlemek için antikorların birkaç seyreltmesinin denenmesi önerilir.
Ön deneyler olarak, olası arka plan gürültüsünü veya otofloresanı değerlendirmek için farklı kontroller üzerinde çalıştık. Özellikle, farklı deneylerde, yalnızca birincil antikorları, yalnızca ikincil antikorları, her bir lekeyi ayrı ayrı kullandık ve lekelenme olmadı. Beklendiği gibi, sadece primer / ikincil antikorların varlığında, protokolü her bir leke ile ayrı ayrı uyguladığımızda yeşil veya kırmızı floresan lekeleri (γH2AX veya 53BP1 odaklarının varlığını gösteren) gözlemlerken herhangi bir odak gözlemlemedik. Hiçbir boyama kontrolü ile ilgili olarak, dağınık boyama ile kendini gösteren arka plan gürültüsü / otofloresan gözlemledik. Bunun yerine, immünofloresan protokolünü uyguladıktan sonra, γH2AX veya 53BP1 odakları, kahverengi-koyu çekirdeklerde, kullanılan florokromlar (FITC veya TRITC) için uygun filtre altında yeşil veya kırmızı sinyaller olarak açıkça görülebilir. Bu nedenle, arka plan gürültüsü / otofloresan, odakların tanımlanmasını önemli ölçüde etkilemez, çünkü bir floresan noktasının uygun bir odak olup olmadığını değerlendirmek için belirli kriterler kullandık (yani, mikroskopun odaklanması sırasında, γ-H2AX ve 53BP1 odakları, hücre çekirdeğinin dışında potansiyel olarak bulunan diğer floresan noktaların aynı odak düzleminde olmamalıdır). Bu kriterler, hem öznelliği azaltmamıza hem de arka plan gürültüsünün / otofloresanlığın etkisini ihmal edilebilir hale getirmemize izin verdiği için seçilmiştir.
Bleomisin, düşük LET iyonlaştırıcı radyasyonun (IR) nasıl davrandığına çok benzer şekilde, deoksiriboz üzerindeki son derece spesifik serbest radikal saldırısı ile DSB'leri indükleyen radikal bazlı bir mutajendir. Bu nedenle, bleomisin radyomimetik bir ajan olarak tanımlanır15. Büyük miktarda bleomisin kaynaklı DSB, en kötü senaryoda apoptozun aktivasyonunu tetikleyen lenfositlerin proliferasyonunu ciddi şekilde etkileyebileceğinden, sitotoksisiteye neden olmadan DSB oluşumuna yol açabilecek bir dozu tanımlamak için mutajenin birkaç konsantrasyonunun test edilmesi önerilmektedir.
Birçok çalışma, IR ile indüklenen DSB'leri onarmak için ana yolun NHEJ olduğunu ve lezyonun yakınında 53BP1'in varlığı ile desteklendiğini göstermektedir16,17. Bununla birlikte, IR'ye benzer şekilde davranan bleomisin ile tedaviden sonra daha fazla miktarda 53BP1 odağının ortaya çıkması beklenmesine rağmen, çalışmamızda 53BP1 odaklarından daha yüksek bir γH2AX frekansı gözlemledik. γH2AX ve 53BP1 odaklarının analizinin temel avantajı, hücresel yanıtı maruz kalma veya patolojik bağlamlarda değerlendirme yeteneğine dayanır. Aslında, γH2AX ve 53BP1 odaklarının IR etkileri18'in güvenilir ve yerleşik belirteçleri olduğu ve γH2AX odaklarının varlığının çeşitli kanser formlarında önemli bir prognostik faktörü temsil ettiği iyi bilinmektedir19 veya daha genel olarak, DSB oluşumunu arttırmak için ajanların veya kimyasalların yeteneğini belirlemeye razı olurlar. Ayrıca, γH2AX ve 53BP1 odakları, DSB'lerin artışı ile belirli bir hastalık20,21 arasında olası bir ilişki kurmak, tedaviye yanıt açısından bir tedaviyi doğrulamak 22,23 veya tümör radyosensitivitesini tahmin etmek için değerlendirilebilir 24.
γH2AX ve 53BP1 odakları DSB'leri ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak yazarlar her iki yöntemin de sınırlamaları olduğunun altını çizmelidir: asıl endişe, DSB'leri kendileri tespit etmemeleri, ancak onarım süreçlerinde yer alan iki spesifik faktörden oluşmaktadır. Bu nedenle, onarım kinetiğinin oldukça değişken25 olduğu göz önüne alındığında, sonuçların yorumlanması belirsiz olabilir.
Bununla birlikte, bu çalışma, γH2AX ve 53BP1 odaklarını aynı anda ölçmek için çift immünofloresan kullanımının sonuçların yorumlanmasında çeşitli sorunlara yol açabileceğini göstermektedir. Bunun temel nedeni, DSB bölgelerinde 53BP1'den daha yüksek γH2AX varlığı ve bleomisin tedavisinden sonra gözlemlediğimiz iki belirteç için düşük seviyelerde birlikte lokalize floresan sinyalleridir. Öte yandan, histon H2AX, bir DSB'nin ortaya çıktığı andan tamir edilene kadar Ser-139 üzerinde fosforile olmaya devam ederken, 53BP1, örneğin sadece NHEJ aktive edilebildiğinde, daha spesifik koşullar altında işe alınan bir proteindir, ayrıca 53BP1, hücre döngüsü25'in G1 fazı sırasında güçlü bir şekilde baskındır. Ayrıca, 53BP1, bir DSB'nin γH2AX ile birlikte meydana geldiği, ancak daha kısa bir süre devam ettiği ve bu nedenle ikili immünofloresansın onu ve γH2AX'i aynı anda lokalize edemediği durumlarda işe alınmış olabilir. Bununla birlikte, araştırmacı, ayrıntılı ve güvenilir bir protokol sağladığımız ikili bir immünofloresan gerçekleştirmenin daha uygun olduğunu düşünüyorsa, bu yöntemin doğal olarak yukarıda açıklandığı gibi olayın gerçek sıklığını küçümsemeye yol açabileceğini düşünmek önemlidir. Aynı zamanda, olayı abartmamak için, birlikte lokalize γH2AX ve 53BP1 odaklarını iki farklı nokta olarak saymaktan kaçınılmalıdır, çünkü gerçekten sadece bir DSB'nin varlığını gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Tam kan bağışçılarına ve kan örneklerini alan tüm sağlık personeline teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
References
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S.
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
