Summary
Este trabalho descreve em detalhes os procedimentos operacionais e precauções a serem tomadas durante a Dumoxabustão no tratamento da espondilite anquilosante em camundongos experimentais.
Abstract
A espondilite anquilosante (EA) é uma forma de artrite que piora e incapacita progressivamente e afeta principalmente o esqueleto axial. Esta doença envolve principalmente a coluna vertebral e a articulação sacroilíaca. A fusão da coluna vertebral e da articulação sacroilíaca pode ocorrer no estágio mais avançado da doença, resultando em rigidez e cifose da coluna vertebral, bem como dificuldade para deambular, o que afeta seriamente a qualidade do trabalho e das atividades de vida diária e impõe uma pesada sobrecarga ao paciente, à família e à sociedade. Cada vez mais atenção tem sido dada à não-farmacoterapia como terapia alternativa para EA. A moxabustão é uma técnica terapêutica milenar utilizada na Medicina Tradicional Chinesa (MTC). A terapia de dumoxabustão, um tratamento externo único e inovador desenvolvido com base na moxabustão comum, tem um efeito terapêutico definitivo na EA. Du-moxabustão combina habilmente as técnicas compatíveis da MTC para integrar meridianos, acupontos, fitoterapia chinesa e moxabustão. Este trabalho descreve detalhadamente os procedimentos operacionais e precauções a serem tomadas durante a Du-moxabustão em camundongos experimentais para fornecer uma base experimental para o estudo do mecanismo da Du-moxabustão no tratamento da EA.
Introduction
A espondilite anquilosante (EA) é uma forma de artrite que piora e incapacita progressivamente e afeta principalmente o esqueleto axial. De acordo com o último levantamento epidemiológico, ~0,01%-1,8% das pessoas no mundo sofrem dessa condição1, a maioria dos quais são homens jovens (a proporção homem:mulher é ~2-3:1)2. A incidência de EA na população chinesa é de 0,2%-0,4%. Esta doença envolve principalmente a coluna vertebral e a articulação sacroilíaca. A fusão da coluna vertebral e da articulação sacroilíaca pode ocorrer nos estágios mais avançados da doença, resultando em rigidez e cifose da coluna vertebral, além de dificuldade de deambulação, o que afeta seriamente a qualidade do trabalho e das atividades de vida diária e impõe sobrecarga ao paciente, à família e àsociedade1. Atualmente, não há uma solução definitiva para a EA, e os tratamentos oferecidos, tanto farmacológicos quanto não farmacológicos, concentram-se principalmente no alívio da dor, retardando a progressão da doença e melhorando a qualidade de vida. Nos últimos anos, como as opções farmacoterapêuticas têm sido muito limitadas3, cada vez mais atenção tem sido dada à não farmacoterapia, que se tornou uma terapia alternativa para EA. Na China, os pacientes geralmente preferem o tratamento externo que consiste em Medicina Tradicional Chinesa (MTC), que tem efeitos colaterais menores e grande conveniência durante o tratamento.
A moxabustão é uma técnica terapêutica milenar utilizada na MTC. Du-moxabustão é uma técnica de tratamento externo que consiste em "moxabustão medicamentosa com espuma" no segmento da coluna vertebral do meridiano de Du. É usado principalmente no tratamento da EA e tem mostrado segurança e eficácia. Comparada com a moxabustão comum, a Du-moxabustão tem as características de uma ampla área de moxabustão, um grande cone de moxa, forte poder de fogo e alta temperatura4. Uma revisão sistemática e metanálise sugerem que a moxabustão é um tratamento complementar eficaz para EA5. Um estudo recente confirmou que os sintomas clínicos e alguns fatores inflamatórios de pacientes com EA melhoraram com a moxabustão6. Estudos revelaram que a Dumoxabustão pode aumentar o conteúdo cerebral de β-endorfina e exercer um efeito analgésico central7, diminuir a expressãodo gene HLA-B27 8 e retardar a taxa de recorrência da EA. A dumoxabustão também tem um efeito melhorador na progressão da EA, diminuindo o índice inflamatório VHS (VHS) e os níveis de proteína C reativa (PCR), peptídeo C-terminal do colágeno tipo I (CTX-I) e proteína Dickkopf1 (DKK1)9,10.
Outro estudo clínico mostrou que a Dumoxabustão pode ajustar ainda mais os subtipos desordenados de células T, Ig e complemento C3 para equilibrar o mecanismo imunológico11. Em termos de metabolismo ósseo, a moxabustão pode inibir a elevação da fosfatase alcalina (FA) e do fósforo séricos (S-P), aumentar o cálcio sérico (S-Ca), a densidade mineral óssea (DMO) e a resistência óssea12. Além disso, a Dumoxabustão pode reparar a função espinhal em múltiplos pontos para aliviar os sintomas de fadiga em pacientes com EA13. Alguns estudos em animais revelaram o mecanismo potencial da moxabustão no tratamento da EA. Um estudo indicou que a moxabustão melhorou significativamente o estado geral de saúde, reduziu os níveis de espessura da pata e diminuiu os níveis de IL-1β, PGE2, IL-6 e TNF-α nas amostras de tecido ligamentar da coluna vertebral. A análise das vias metabólicas relacionou os metabólitos identificados ao ciclo do ADT, bem como ao metabolismo de lipídios, aminoácidos, flora intestinal e purinas14. Outro estudo mostrou que a moxabustão suprimiu a expressão de citocinas pró-inflamatórias, IL-1β, TNF-α, IL-17 e IL-6; reduziu os níveis de mRNA de RANKL, RANK, ALP e OCN; e melhorou as características histopatológicas em camundongos EA15.
Embora esses estudos sugiram que a moxabustão pode ser eficaz no tratamento da EA, mais pesquisas são necessárias para confirmar esses achados e determinar o protocolo de tratamento ideal para moxabustão em pacientes com EA. Nossa equipe criou e modificou a terapia de moxabustão com base na teoria básica e operação prática da moxabustão tradicional chinesa, que tem sido amplamente realizada e aplicada na prática clínica chinesa há mais de 35 anos. Embora existam poucos estudos de alta qualidade sobre o tratamento da EA por Dumoxabustão, sua indicação no tratamento da EA tem sido apoiada por evidências. No entanto, o mecanismo de tratamento da EA com Dumoxabustão merece mais estudos. O estudo em animais é um método importante para explorar o mecanismo da Du-moxabustão no tratamento da EA. A operação clínica da Du-moxabustão é relativamente madura, mas raramente utilizada no estudo do mecanismo em experimentos animais. Este trabalho descreve em detalhes a operação e as precauções a serem tomadas durante a Du-moxabustão no tratamento de camundongos experimentais EA.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Revisão de Ética em Bem-Estar Animal Experimental da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong (nº. SDUTCM20230831301).
1. Preparo dos animais
- Determinar previamente os grupos experimentais e o número de animais por grupo.
- Escolha camundongos BALb/c machos, abrigue-os a uma temperatura constante de 22 ± 1 °C, umidade constante de 60 ± 5% e ambiente de luz de ciclo diurno de 12 h.
2. Estabelecimento do modelo de mouse AS
OBS: O modelo de EA foi induzido com proteoglicano de cartilagem (PG), que é um método clássico de modelagem16,17,18,19,20,21. Camundongos da linhagem BALB/c foram repetidamente imunizados com PG para induzir tendinite e espondilite. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados aos materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
- Use uma pipeta de 200 μL para extrair 200 μL de PG e CFA (ou IFA) em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Agitar suavemente para misturar o líquido no tubo da centrífuga.
- Coloque o tubo de centrífuga no moedor de tecido para homogeneização e, em seguida, incube no gelo por 4 min. Repita 5x. Defina os seguintes parâmetros no moedor de tecidos: 60 Hz, moagem 30 s, intervalo 10 s para um total de 6 ciclos.
- Extrair 0,2 ml de proteína PG emulsificada do tubo de centrifugação com uma seringa de 1 ml.
- Pegue e fixe o mouse com a mão esquerda. Coloque o rato em posição supina, mantendo a cabeça mais baixa do que a cauda para evitar danos aos órgãos abdominais quando a seringa for inserida.
- Esterilize o abdômen com compressas de álcool usando a mão direita.
- Com a seringa na mão direita, insira a agulha por via subcutânea ligeiramente à esquerda ou à direita da linha alba ventralis na metade inferior do abdómen.
- Empurre a agulha 3-5 mm subcutaneamente paralela à linha abdominal média e, em seguida, empurre a agulha para a cavidade abdominal em um ângulo de 45° em relação à pele.
- Penetre no peritônio, retire o tampão da agulha e injete lentamente a proteína PG emulsionada.
3. Dumoxabustão
NOTA: Preparar com antecedência as três matérias-primas mais importantes para a Du-moxabustão (Figura 1).
- Prepare cones de moxa. Pegue o veludo na mão, com duas palmas voltadas para direções opostas exercendo uma força de torção para esfregar o veludo em forma de fuso (Figura 2)
- Corte o gengibre em pedaços pequenos e purê em um espremedor de suco (Figura 3). Filtre o purê de gengibre através de gaze de algodão. Separe o suco de gengibre e a lama de gengibre do purê de gengibre para se preparar para o próximo passo.
- Prepare 10 g de lama de gengibre e 20 mL de suco de gengibre e coloque-os em copos de papel para uso posterior.
- Pesar 0,1 g de pó de MTC (uma mistura de canela em pó, cravo em pó, notopterygium em pó, antagarina em pó e almíscar artificial)22 e triturá-lo em uma argamassa.
- Colocar os ratos na caixa de indução anestésica do aparelho de anestesia animal e anestesiar-os com uma mistura de isoflurano a 2-3% e oxigênio a uma taxa de fluxo de 2 L/min.
- Avaliar a profundidade da anestesia observando a ausência de um reflexo de sobressalto inicialmente e verificar o nível de anestesia cirúrgica verificando a ausência de um reflexo pedal em resposta a um suave pinçamento dos dedos.
- Depois que o mouse atingir a anestesia no plano cirúrgico, retire-o da caixa e fixe-o na mesa de cirurgia em decúbito ventral. Alinhe a boca e o nariz do rato com a saída do anestésico.
- Administrar anestesia através de uma máscara acoplada ao aparelho de anestesia, através da qual isoflurano e oxigênio são administrados através de um circuito sem reinalação. Manter a anestesia e manter o mouse sobre uma almofada de aquecimento a 37 °C durante todo o procedimento operacional. Aplique lubrificante nos olhos para evitar a dessecação.
- Localizar os acupontos e identificar a área de estimulação (Figura 4).
- Faça a barba no cabelo na parte de trás do rato até que a pele cor de carne na parte de trás do rato seja vista. Certifique-se de que a largura da depilação seja de ~1,5 cm e que o comprimento seja da sétima vértebra cervical até a vértebra caudal (Figura 5A).
- Aplicar o suco de gengibre preparado com gaze de algodão na área raspada (Figura 3).
- Polvilhe o pó de MTC uniformemente com um pincel de escrita na linha mediana do dorso do rato e cubra-o com papel amoreira (Figura 5B-D).
- Faça uma coluna trapezoidal de gengibre com 6 cm de comprimento, 1,5 cm de largura e 3 mm de espessura com lama de gengibre. Fixe a coluna de gengibre no papel amoreira (Figura 5E).
- Faça um sulco acima da linha média da coluna de gengibre (Figura 3) e coloque o cone de moxa na coluna de gengibre.
- Acenda o cone de moxa, colocando um novo cone de moxa depois que o anterior queimar. Verifique a firmeza da coluna de gengibre para evitar a queimadura do rato, queimando um total de três cones (Figura 5F).
- Após a queima dos cones de moxa, limpe o gengibre e o pó TCM e limpe a parte de trás do mouse. Interrompa a anestesia neste momento.
- Permita que o rato recupere a consciência numa nova gaiola com acesso irrestrito a comida e água. Coloque a gaiola em uma almofada aquecida para ajudar no processo de recuperação. Monitore o animal até que ele recupere a consciência suficiente.
- Uma vez que o mouse tenha se recuperado completamente, confirme a presença do reflexo de retificação antes de devolvê-lo ao seu alojamento normal.
NOTA: Durante a operação, é necessário monitorar o estado mental dos ratos para evitar a respiração fraca. Evite escaldamento, mas mantenha os ratos aquecidos e evite hematomas nas garras e na cauda.
4. Avaliação do índice de artrite (IA)
- Avalie o escore de IA três vezes: antes da modelagem, após a modelagem e após o tratamento. Os padrões de avaliação são os seguintes: 0, sem vermelhidão ou inchaço; 1, ligeira vermelhidão ou inchaço em alguns dedos; 2, vermelhidão e inchaço na maioria das articulações dos dedos dos pés e dos pés; 3, vermelhidão grave e inchaço nos pés e abaixo da articulação do tornozelo; e 4, vermelhidão e inchaço nos pés e articulação do tornozelo23.
- Calcule os escores de IA das quatro patas, com um valor máximo de 16.
5. Teste de Rotarod
NOTA: O teste rotarod é usado para avaliar a coordenação motora e o equilíbrio, registrando o tempo que os ratos passam no tambor giratório. Este experimento consistiu de três tentativas separadas por intervalos de 20 min. Os dados oficiais do teste foram registrados a partir da terceira tentativa, com os dois primeiros servindo como exercícios de treinamento.
- Coloque os mouses em tambores giratórios que giram sob aceleração contínua de 4 a 40 rpm sobre 300 s24.
- Meça o tempo de latência (o tempo até o mouse cair da haste). Providencie acolchoamento para evitar lesões quando cair.
6. Teste de campo aberto (OFT)
OBS: O TPO é utilizado para avaliar o estado de movimento autonômico, visando identificar o comportamento patológico. Quatro arenas quadradas de campo aberto (50 cm x 50 cm x 40 cm) foram colocadas juntas para formar o aparelho. O fundo da caixa foi dividido em nove quadrados iguais.
- Controlar o ruído de fundo do laboratório para menos de 65 dB.
- Limpe todo o aparelho com etanol a 75% antes de cada ensaio.
- Coloque todos os ratos na sala de testes 1 h antes do teste para permitir que eles se adaptem ao seu ambiente.
- Coloque os ratos nas arenas quadradas de campo aberto e deixe-os explorar por 10 min.
- Registre a distância total e a velocidade de movimento por 10 min.
7. Eutanásia e coleta de espécimes
- Coloque o camundongo na caixa de indução anestésica e anestesia-o com uma mistura de isoflurano a 2-3% e oxigênio a uma taxa de fluxo de 2 L/min. Uma vez que o rato entra em um estado de anestesia profunda confirmado pela falta de reflexo pedal, transfira-o para a mesa de cirurgia para anestesia de manutenção.
- Pegue e fixe o mouse com a mão não dominante.
- Pressione levemente a área dos olhos para deixar os globos oculares congestionados e salientes.
- Use tesouras para aparar os bigodes do rato para evitar a hemólise causada pelos pelos.
- Confirme a profundidade da anestesia verificando a ausência de um reflexo pedal em resposta a uma pinça do dedo do pé. Use pinças para agarrar o globo ocular e removê-lo rapidamente, permitindo que o sangue flua para um tubo de microcentrífuga da cavidade ocular.
NOTA: Métodos alternativos de coleta de sangue, como punção cardíaca, também podem ser usados. - Quando a taxa de gotejamento de sangue diminuir, pressione suavemente a área cardíaca do rato para acelerar o bombeamento de sangue e obter mais sangue. Em seguida, eutanasiar o camundongo usando deslocamento cervical.
- Segure a perna logo acima da articulação do tornozelo usando pinça na mão não dominante. Em seguida, corte a perna logo acima da articulação do tornozelo usando uma tesoura.
8. Análise histológica
- Imergir os espécimes de tornozelo em paraformaldeído a 4% por mais de 24 h. Descalcificar em EDTA a 10% (pH = 7,4) por 1 mês.
- Mergulhe os espécimes em paraformaldeído a 4% por 2 h.
- Em seguida, mergulhe os espécimes em um gradiente de concentrações crescentes de etanol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%). Deixe de molho cada concentração de etanol por 1 h.
- Mergulhe os espécimes em xileno por 3 h.
- Imergir os espécimes de tornozelo em parafina por 7 h. Reserve os blocos de parafina em geladeira a 4 °C.
- Corte blocos de parafina até uma espessura de 6 μm usando uma máquina de seccionamento de parafina semiautomática.
- Deixe as fatias de molho por 4 x 5 min em xileno para completar a desparafinação.
- Mergulhe as fatias em um gradiente de concentrações decrescentes de etanol (100%, 100%, 95%, 75%) por 2 min cada. Mergulhe em água destilada por 2 min.
- Manchar as fatias com hematoxilina por 10 min e enxaguar com água destilada por 5 s.
- Mergulhe as fatias por 30 s no fluido de diferenciação e enxágue com água destilada por 5 s.
- Manchar as fatias com eosina por 1 min e enxaguar com água destilada por 3 min.
- Mergulhe as fatias em um gradiente de concentrações crescentes de etanol (80%, 95%, 100%, 100%) por 1 min cada. Mergulhe em xileno por 3 x 3 min e sele as fatias25.
9. Ensaio imunoenzimático (ELISA)
- Medir as concentrações de IL-17 e TNF-α no plasma usando os respectivos kits de acordo com as instruções do fabricante.
10. Análise estatística
- Expresse os dados como média ± erro padrão da média (EPM).
- Determinar a significância por meio de análise de variância (ANOVA) one-way ou ANOVA de medidas repetidas two-way, seguida pelos testes post hoc de Bonferroni ou Tamhane T2.
- Considere P < 0,05 estatisticamente significante.
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Representative Results
Camundongos modelo induzidos por PG desenvolveram sintomas de artrite periférica, caracterizada por vermelhidão e inchaço das extremidades e dos dedos, e gradualmente desenvolveram artrite axial já na semana 14, que é muito semelhante à manifestação da EA. Portanto, o modelo de EA em camundongos foi considerado bem-sucedido se o índice de artrite (IA) fosse superior a 3 pontos em 14 semanas após a última injeção22. Quando as patas dos camundongos pareciam inchadas, o tratamento Du-moxabustão foi realizado uma vez por semana para um total de 3x. Após o tratamento, os camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical sob anestesia profunda com isoflurano, seu sangue foi coletado e os tornozelos foram excisados.
Efeitos da Du-moxabustão na coodinação motora e no movimento autonômico
A EA induzida por PG bovina foi adotada como modelo para observar o efeito da Du-moxabustão no meridiano de Du sobre a coordenação motora. Inicialmente, o escore de edema articular foi utilizado para avaliar se o modelo foi bem-sucedido, e a coordenação motora e o movimento autonômico foram avaliados pelo teste rotarod e pelo TFO.
A avaliação da IA determinou a gravidade da artrite periférica. Após a modelagem, a ANOVA de medidas repetidas two-way revelou que os escores de edema articular nos grupos modelo e Du-moxabustão aumentaram significativamente em comparação com aqueles no grupo controle antes da Du-moxabustão (P < 0,01; Figura 6A). O tratamento com dumoxabustão diminuiu os escores de edema articular em comparação com os do grupo modelo após a dumoxabustão (P < 0,05; Figura 6A).
O teste rotarod foi empregado para avaliar a coordenação motora e o equilíbrio. A ANOVA de medidas repetidas two-way revelou diferenças significativas ao longo do tempo (F = 13,928, P = 0,000 < 0,05) e efeitos de interação de tempo e grupo (F = 12,583, P = 0,000 < 0,05). Após a modelagem, o tempo de latência do grupo controle não foi diferente daquele anterior à modelagem. Entretanto, após a modelagem, os tempos de latência dos grupos modelo e Du-moxabustão diminuíram significativamente em relação aos do grupo controle (P < 0,01; Figura 6B), não havendo diferenças significativas entre o grupo modelo e o grupo Du-moxabustão (P > 0,05; Figura 6B). Após o tratamento, o tempo de latência do grupo Du-moxabustão aumentou significativamente em relação ao grupo modelo (P < 0,05; Figura 6B). Estes resultados indicaram que a Dumoxabustão foi eficaz na melhora da coordenação motora em camundongos EA.
O TFO foi realizado para detectar movimento autonômico. Os parâmetros foram coletados e analisados automaticamente por meio do software (Figura 6C-E); A distância total e a velocidade média foram observadas principalmente neste estudo. Não houve diferença significativa na distância total e velocidade média entre os grupos antes da modelagem (P > 0,05; Figura 6C,D). Após a modelagem, a distância total e a velocidade média reduziram significativamente em relação ao grupo controle (P < 0,05; Figura 6C,D). Após o tratamento, a distância total e a velocidade média do grupo Du-moxabustão aumentaram significativamente em relação ao grupo modelo (P < 0,05; Figura 6C,D). Estes resultados indicaram que a Du-moxabustão foi eficaz em melhorar o movimento autonômico em camundongos EA.
Efeitos da Dumoxabustão na patologia da articulação do tornozelo
A coloração HE foi utilizada para observar as alterações patológicas na articulação do tornozelo. No grupo controle, não houve danos à estrutura da sinóvia, congestão na sinóvia e infiltração e necrose de células inflamatórias óbvias. Entretanto, no grupo modelo, observou-se hiperplasia e infiltração da sinóvia na cavidade articular, além de infiltração de células inflamatórias e edema tecidual. Combinado com a avaliação da IA, comprovou-se que o modelo de EA foi estabelecido com sucesso. Em comparação com o grupo modelo, a sinóvia dos camundongos do grupo Du-moxabustão estava mais intacta, o edema intersticial estava reduzido e a cartilagem articular relativamente intacta (Figura 7).
Efeitos da Du-moxabustão sobre os níveis plasmáticos de IL-17 e TNF-α
ELISA foi realizado para medir IL-17 e TNF-α no plasma. Os níveis plasmáticos de IL-17 e TNF-α do grupo modelo estavam significativamente aumentados em comparação com os do grupo controle (P < 0,01; Figura 6F,G). A dumoxabustão diminuiu os níveis plasmáticos de IL-17 e TNF-α (P < 0,05; Figura 6F,G).
Figura 1: Matérias-primas necessárias para a Dumoxabustão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Confecção de um cone de moxa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Prepare a água do gengibre e faça uma coluna de gengibre trapezoidal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Localização do GV14 e GV2 no mouse. (A) GV14 localizado no processo subespinhoso da sétima vértebra cervical; GV2 localizado no canal sacral do hiato. (B) Diagrama esquemático de Du moxabustão no mouse. (C) Área estimulada de Du moxabustão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Procedimento cirúrgico da Dumoxabustão em camundongo. (A) Raspe o cabelo e esfregue o suco de gengibre no camundongo na posição prona. (B,C) Polvilhe o pó TCM uniformemente. (D) Cubra o pó com papel amoreira. (E) Fixe firmemente a coluna de gengibre no papel amoreira. (F) Coloque um cone de moxa na coluna de gengibre; depois, acenda-o. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Efeitos da Du-moxabustão na coordenação motora, movimento autonômico e níveis de IL-17 e TNF-α. (A) Os escores de inchaço articular em camundongos. (B) O tempo de latência no teste rotarod. (C-E) Distância total, velocidade média e diagrama de pista do OFT. (F) Níveis plasmáticos de IL-17. (G) Níveis plasmáticos de TNF-α. Os valores foram expressos como média ± EPM (n = 6). ##P < 0,01, #P < 0,05 versus o grupo controle; $$P < 0,01, $P < 0,05 em relação ao grupo de modelos. Abreviações: IL = interleucina; TNF = fator de necrose tumoral; OFT = teste de campo aberto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Coloração HE da articulação do tornozelo. (A) A cavidade articular era lisa, sem infiltração inflamatória no grupo controle. (B) No grupo modelo, observou-se hiperplasia e infiltração da sinóvia na cavidade articular. (C) No grupo Dumoxabustão, a cavidade articular dos camundongos era lisa e o edema aliviado. Barras de escala = 200 μm. Abreviação: HE = hematoxilina-eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A EA manifesta-se clinicamente como dor nas costas, lombar e edema articular, podendo ocorrer deformidade da coluna vertebral e rigidez articular em casos graves26. O diagnóstico e o tratamento precoces podem melhorar a qualidade de vida, reduzir as taxas de incapacidade e melhorar o prognóstico de pacientes com EA. De acordo com a medicina tradicional chinesa (MTC), acredita-se que a EA seja causada por uma deficiência de Yang no rim e no meridiano de Du, bem como um acúmulo de mal frio internamente. A MTC defende a visão de que a moxabustão, baseada no conceito de meridianos, pode gerar Qi que aquece a superfície do corpo. Este Qi então viaja para baixo ao longo dos meridianos e acupontos. Em O Cânone Interior de Huangdi (uma obra-prima muito clássica e importante da MTC), está registrado que "o meridiano de Du doente é tratado". Como a SA está localizada no meridiano Du, a estimulação do meridiano Du é usada como ponto terapêutico. O meridiano Du é considerado o oceano dos canais Yang onde o Yang Qi atinge seu pico. A moxabustão no meridiano Du pode complementar o qi Yang, ativar o efeito do meridiano Du e ajustar o efeito de aquecimento do Yang renal, ou seja, aumentar a função de regulação imunológica da medicina ocidental.
Do ponto de vista da medicina ocidental, a medula espinhal desempenha um papel importante na transmissão de informações neurais. A dumoxabustão, que atua na entrada e saída das raízes nervosas espinhais, pode afetar a função e o mecanismo regulatório do sistema nervoso através da regulação de neurotransmissores. Na década de 1990, demonstrou-se que a Dumoxabustão aumentava o conteúdo de β-endorfinas no hipotálamo de ratos, tendo assim um efeito analgésico central7. Além disso, a entesite é uma complicação comum da EA, caracterizada por dor persistente e rigidez muscular, que pode afetar o movimento articular e corporal quando intensa. Como um método de tratamento da MTC que foi clinicamente validado, a Du-moxabustão pode efetivamente aliviar a inflamação, promover o reparo tecidual e melhorar a entesite no tratamento da EA.
Especificamente, os efeitos da acupuntura e da moxabustão se refletem principalmente nos seguintes aspectos. Primeiro, eles promovem a circulação sanguínea e a absorção da inflamação. A dumoxabustão estimula a circulação sanguínea e o metabolismo nos tecidos que circundam a coluna vertebral através do efeito de aquecimento e promove a absorção da inflamação e reparação tecidual, reduzindo assim o grau de inflamação e dor da inflamação da inserção do tendão. Em segundo lugar, melhoram a tensão muscular e ligamentar. O efeito de estimulação da Du-moxabustão pode melhorar a tensão muscular ao redor da coluna, relaxar os tecidos moles endurecidos, promover a atividade das articulações da coluna vertebral e reduzir a dor e a rigidez causadas pela tensão muscular e alongamento ligamentar. Em resumo, a Dumoxabustão, como terapia adjuvante, pode regular de forma abrangente as atividades dos sistemas nervoso, imunológico e circulatório do corpo, agindo na região da coluna, tornando o corpo mais equilibrado como um todo.
A inflamação é a principal manifestação da EA27. O TNF-α é uma citocina multiefetora e fator inflamatório produzido sob a estimulação de macrófagos mononucleares28. A atividade da FA e a síntese de colágeno podem ser inibidas pelo TNF-α, resultando em perda óssea e destruição da cartilagem29. Nos últimos anos, estudos constataram que a IL-17 desempenha um papel importante na patogênese da EA, o que foi plenamente demonstrado em uma revisão30. A IL-17 pode atuar diretamente nos osteoblastos, promover a expressão do ligante ativador do receptor do fator de transcrição nuclear κB (NF-κB) (RANKL) e promover a geração robusta de osteoclastos. Ao mesmo tempo, a IL-17 também afeta as células-tronco mesenquimais (CTMs), induzindo sua proliferação e promovendo sua diferenciação emosteoblastos31. Kenna32 e col. encontraram que o nível de IL-17 no sangue periférico de pacientes com EA aumentou quase duas vezes em comparação com controles saudáveis. O estudo sugere que os antagonistas da IL-17 podem ser uma nova opção para pacientes com EA que não respondem bem aos antagonistas do TNF-α33. Um estudo clínico mostrou que um regime posológico de antagonistas de IL-17 foi superior a um placebo para melhorar os sinais e sintomas radiográficos de espondiloartrite axial em pacientes34. Os resultados deste estudo mostraram que os níveis plasmáticos de TNF-α e IL-17 no grupo modelo foram significativamente mais elevados do que os do grupo controle, e os níveis plasmáticos de TNF-α e IL-17 diminuíram significativamente após o tratamento com Du-moxabustão.
A terapia de du-moxabustão usa habilmente as técnicas compatíveis da MTC para integrar meridianos, acupontos, fitoterapia chinesa e moxabustão. As matérias-primas da terapia de Du-moxabustão incluíram principalmente veludo moxa, gengibre e pó de TCM. Do ponto de vista da MTC, o veludo moxa, um produto processado da erva-mosca, tem a função de ativar colaterais, dissipar o frio e aliviar a dor. O gengibre desempenha um papel no alívio dos sintomas externos e dissipação do frio. Pesquisas modernas também mostram que o gengibre tem propriedades anti-inflamatórias e analgésicas35. Limpar a pele com suco de gengibre antes do tratamento ajuda a abrir os poros e promover a permeação transdérmica36, além de ajudar o pó de MTC a aderir à pele. A coluna trapezoidal de gengibre é firmemente fixada no dorso para fornecer uma base sólida para o cone de moxa. Após a queima do cone de moxa, os efeitos do poder de fogo, gengibre e pó de MTC trabalham juntos no meridiano de Du. Tendo em vista a patogênese da deficiência de Yang nesta doença, a Du-moxabustão atua diretamente no local da doença, aquecendo os meridianos, dispersando o frio, suplementando o Yang Qi e a essência, promovendo a circulação sanguínea e equilibrando o Yin e o Yang para tratar a raiz da doença.
Ao realizar a Dumoxabustão, vários detalhes devem ser considerados. Primeiro, o local de operação da Dumoxabustão é fixo, do ponto Dazhui (GV14) ao ponto Yaoshu (GV2) (anatomicamente do7º processo espinhoso da coluna cervical até a vértebra da cauda, incluindo toda a coluna), o que é consistente com o local de incidência de EA (Figura 4). Em segundo lugar, a umidade e a espessura do gengibre são importantes. O excesso de suco de gengibre deve ser espremido depois que o gengibre é processado em lama de gengibre para que a lama de gengibre não tenha sensação granular e sua espessura seja apropriada para ser feita na coluna de gengibre trapezoidal. Alta umidade e umidade na lama de gengibre podem facilmente dificultar a penetração do fogo de moxabustão e reduzir a quantidade de estímulo de moxabustão. Se a matéria-prima do gengibre estiver muito seca e as partículas forem muito grandes, é difícil fazer a coluna trapezoidal de gengibre, levando à rápida penetração de calor e escaldamento da pele. Terceiro, o tamanho e a firmeza do cone de moxa devem ser considerados. Os cones de moxa usados para moxabustão em camundongos têm ~4 cm de comprimento e 0,5 cm de diâmetro e devem ser apertados no momento do preparo. Um teste para o aperto é quando o cone não se desfaz mesmo depois de cair em uma superfície. Se o cone de moxa não for compacto o suficiente, levará a uma redução na quantidade de veludo moxa, um tempo de queima mais curto e uma redução no poder de fogo. Quarto, ao acender o cone de moxa, a cabeça, o meio e a cauda do cone de moxa devem ser acesos com incenso fino para fazer o cone de moxa queimar lentamente para alcançar o efeito nutritivo de fluxo e refluxo. Em quinto lugar, o almíscar é um ingrediente importante no pó medicinal da moxabustão. No segundo dia após a moxabustão, deve haver bolhas cristalinas como pequenas pérolas no meridiano de Du.
Um grande número de estudos clínicos confirmou a eficácia definitiva da Du-moxabustão no tratamento da EA 4,5,6. No entanto, a pesquisa sobre seu mecanismo de ação em experimentos com animais progride lentamente. Através de pesquisa e inovação, anos de experiência na operação de Du-moxabustão nos levaram a investigar seu uso em experimentos com camundongos. Este trabalho descreve em detalhes os procedimentos operacionais e precauções da Du-moxabustão no tratamento da EA em camundongos experimentais. Além disso, o efeito da moxabustão sobre a coordenação motora e os níveis plasmáticos de TNF-α e IL-17 em camundongos com EA foram observados. Este estudo forneceu a base experimental mais básica para o estudo do mecanismo da Du-moxabustão no tratamento da EA. Este estudo ainda apresenta algumas limitações. Por exemplo, em estudos futuros, estaremos atentos à avaliação de diferentes parâmetros, como moxabustão com placebo, dose, intervalo e tempo de tratamento para obter os esquemas de combinação mais eficazes. Em estudos posteriores, métodos de imagem podem ser utilizados para avaliar os resultados do tratamento de forma mais intuitiva.
A perspectiva de aplicação da terapia com Du-moxabustão é promissora. O meridiano Du, conhecido como o Vaso Governador, desempenha um papel crucial na regulação do fluxo de Qi e sangue por todo o corpo. A moxabustão, uma terapia tradicional chinesa, envolve a queima de erva-caneca em acupontos específicos para estimular os meridianos e promover o mecanismo de auto-cura do corpo. Comparada com a acupuntura, a Dumoxabustão é uma combinação de várias técnicas que atuam na superfície corporal, que tem as características de conforto e uma forte e ampla gama de ação. Além disso, a terapia de Du-moxabustão se concentra na área das costas e da coluna vertebral, visando o caminho do meridiano de Du. Pode melhorar o sistema imunológico do corpo, melhorar a circulação sanguínea, e aliviar várias condições físicas e mentais. A terapia demonstrou sua eficácia no tratamento de doenças como distúrbios musculoesqueléticos, condições neurológicas, distúrbios ginecológicos e problemas de saúde mental. Com os avanços na pesquisa e na tecnologia, espera-se que a aplicação da terapia de dumoxabustão se expanda ainda mais. Estudos futuros podem explorar seu potencial em áreas como controle da dor, redução do estresse, distúrbios digestivos e condições respiratórias. A combinação do conhecimento tradicional e da compreensão científica moderna poderia levar a uma melhor integração da terapia de Du-moxabustão nas práticas de saúde convencionais. Em conclusão, a terapia com dumoxabustão é uma grande promessa em sua aplicação e integração em vários campos da saúde. Mais pesquisas, ensaios clínicos e colaboração entre profissionais de medicina tradicional chinesa e profissionais de saúde modernos são essenciais para desbloquear todo o seu potencial.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Geral da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.82174491) e pelo Projeto de Herança da Escola Acadêmica de Medicina Tradicional Chinesa da Qilu (No. Lu Weihan [2020]132). Obrigado ao Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong por nos fornecer condições experimentais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% EDTA | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| alcohol pads | HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China | ||
| anesthesia machine | Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK | ||
| centrifuge tubes | Axygen, Corning, NewYork, UAS | ||
| complete Frech's adjuvant (CFA) | aladdin,Shanghai, China | F393378 | |
| cotton ball | Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China | ||
| cotton gauze | Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China | ||
| cutting board | self-preparation | ||
| decorin from bovine articular cartilage | Sigma-Aldrich, MO, USA | D8428 | |
| depilatory cream | Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China | ||
| electronic scale | Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| Eppendorf tube | Axygen, Corning, NewYork, UAS | ||
| eye lubricant | Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China | ||
| ginger | self-preparation | ||
| GraphPad Prism 7 software | GraphPad Software,Boston, USA | ||
| hair clipper | Super human Group CO LTD, Jinhua, China | ||
| heating pads | Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China | ||
| incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | aladdin,Shanghai, China | F393371 | |
| injection syringe | Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China | ||
| isoflurane | Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China | R510-22-10 | |
| joss stick | Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China | ||
| juicer | Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| knife | self-preparation | ||
| lighter | Zhejiang tiger-lighter Co. LTD | ||
| mortar | Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China | ||
| Mouse IL-17 ELISA Kit | absin, Shanghai, China | abs520009-96T | |
| Mouse TNF-α ELISA Kit | Wuhan Sanying, Wuhan, China | KE10002 | |
| mulberry paper | Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China | ||
| OFT | Xinruan,Shanghai, China | XR-XZ301 | |
| paper cup | self-preparation | ||
| pipettes | OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK | ||
| refined moxa velvet | self-preparation | ||
| rotarod | Xinruan,Shanghai, China | XR-6C | |
| scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder | Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD | ||
| scissors | Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China | ||
| semi-automatic paraffin sectioning machine | Leica Camera AG, Watznach, Germany | ||
| SPSS 25.0 software | International Business Machines Corporation, NewYork, UAS | ||
| TCM powder | self-preparation | ||
| tips | Biosharp, Labgic, Beijing, China | ||
| writing brush | Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China |
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