Summary
Denne protokol skitserer trinvise instruktioner til udførelse af intratekale injektioner i neonatale mus til genredigering og lægemiddelafgivelse.
Abstract
Intratekal injektion er en almindeligt anvendt procedure i både pædiatriske og voksne klinikker, der tjener som et effektivt middel til at administrere medicin og behandlinger. Ved direkte at levere medicin og behandlinger i cerebrospinalvæsken i centralnervesystemet opnår denne metode højere lokaliserede lægemiddelkoncentrationer, samtidig med at systemiske bivirkninger reduceres sammenlignet med andre ruter såsom intravenøse, subkutane eller intramuskulære injektioner. Dens betydning strækker sig ud over kliniske indstillinger, da intratekal injektion spiller en afgørende rolle i prækliniske undersøgelser med fokus på behandling af neurogenetiske lidelser hos gnavere og andre store dyr, herunder ikke-menneskelige primater. På trods af den udbredte anvendelse udgør intratekal injektion hos unge, især nyfødte hvalpe, betydelige tekniske udfordringer på grund af deres lille størrelse og skrøbelige karakter. Vellykket og pålidelig administration af intratekale injektioner hos nyfødte mus kræver omhyggelig opmærksomhed på detaljer og omhyggelig overvejelse af forskellige faktorer. Der er således et afgørende behov for en standardiseret protokol, der ikke kun giver instruktioner, men også fremhæver vigtige tekniske overvejelser og god laboratoriepraksis for at sikre proceduremæssig konsistens samt dyrenes sikkerhed og velfærd.
For at imødekomme dette uopfyldte behov præsenterer vi en detaljeret og omfattende protokol til udførelse af intratekale injektioner specifikt hos nyfødte hvalpe på postnatal dag 1 (P1). Ved at følge de trinvise instruktioner kan forskere med sikkerhed udføre intratekale injektioner hos nyfødte hvalpe, hvilket muliggør nøjagtig levering af lægemidler, antisense oligoer og vira til genudskiftning eller genomredigeringsbaserede behandlinger. Desuden understreges vigtigheden af at overholde god laboratoriepraksis for at opretholde dyrenes velfærd og sikre pålidelige forsøgsresultater. Denne protokol har til formål at løse de tekniske udfordringer forbundet med intratekale injektioner i nyfødte mus, hvilket i sidste ende letter fremskridt inden for neurogenetisk forskning, der sigter mod at udvikle potentielle terapeutiske interventioner.
Introduction
Intratekal (IT) injektion er en almindelig klinisk procedure, der anvendes til at administrere medicin, opsamle cerebrospinalvæske og opretholde intrakranielt tryk hos både pædiatriske og voksne patienter i klinik 1,2. Administration af medicin via intratekal injektion er en effektiv tilgang til at øge medicinkoncentrationerne i centralnervesystemet (CNS), samtidig med at systemisk eksponering minimeres. Derfor forbedrer denne metode terapeutisk effekt og reducerer bivirkninger, især for temperaturfølsomme og korte halveringstider3.
I prækliniske undersøgelser, der tester nye lægemidler og behandlinger ved hjælp af gnavermodeller, er det bydende nødvendigt at anvende en pålidelig metode til lægemiddeladministration, der giver større præcision og resultatreproducerbarhed 4,5. For prækliniske undersøgelser, der evaluerer nye behandlinger for neurogenetiske og neuroudviklingsforstyrrelser, er tidlig behandling afgørende for indledende proof-of-concept-undersøgelser, fordi tidligere interventioner typisk forudsiges at give mere gunstige resultater 6,7,8.
Sammenlignet med konventionelle intracerebroventrikulære (ICV) injektioner bærer IT-injektioner betydeligt lavere risici, da de undgår behovet for direkte penetration gennem hjernebarken. Denne fordel reducerer væsentligt den potentielle skade på regionalt kortikalt væv og omgivende nerver. Desuden giver IT-injektioner mulighed for mindst en femdobling af den administrative mængde medicin gennem en enkelt injektion, hvilket i høj grad forbedrer gennemførligheden af gentagne administrationer. På grund af den lille størrelse og skrøbelige karakter af nyfødte mus er det imidlertid teknisk udfordrende at udføre intratekale injektioner hos nyfødte hvalpe og kræver specialiserede teknikker, udstyr og omhyggelig håndtering.
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol med trinvise instruktioner til udførelse af intratekale injektioner hos P1 nyfødte hvalpe. De vigtigste overvejelser og god laboratoriepraksis fremhæves her for at sikre ensartet administration og dyrenes sikkerhed og trivsel under forsøget. Ved at følge denne protokol kan forskere trygt udføre eksperimenter med præcision og reproducerbarhed, samtidig med at eventuelle potentielle risici eller ubehag for dyrene minimeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De beskrevne procedurer og protokoller var i overensstemmelse med retningslinjerne i National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Derudover modtog procedurerne godkendelse fra Animal Care and Use Committee ved Yale University School of Medicine. Nyfødte vildtypemus (WT) C57BL/6J han- og hunmus blev anvendt til præsenteret undersøgelse. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel).
1. Forberedelse af arbejdsområdet
- Forbered følgende ting først: våd is til kryobedøvelse, et tomt bur til adskillelse af hvalpene fra dæmningen, et dissekeringsmikroskop, en lyskilde, en ren overflade til placering af dyret under injektionen, vatpinde, en varmepude, en 25/10 μL sprøjte og en 34 G / 0,375 "/ 12 DEG nål (se materialetabel).
BEMÆRK: Kryobedøvelse til museunger, der bruger våd is, er et valgfrit trin, der har til formål at lette håndtering, reducere hvalpens bevægelse og minimere potentielt ubehag for dyr. Dette kryo-anæstesitrin kan også give fordelen ved at sænke intrakranielt tryk og reducere volumenrelaterede komplikationer 9,10. - Flyt hvalpene til et separat bur væk fra dæmningen, mens du håndterer dem.
- Vej hver hvalp og dokumentér deres vægt.
- Tør bagsiden af musen af med gasbind og ethanol. Bekræft det intervertebrale rum eller i det mindste rygmarvskanalens midterlinje (som skal vises rødt i P1-hvalpe) ved hjælp af dissekeringsmikroskopet (supplerende video 1).
2. Procedure for injektion
- For at bedøve en enkelt hvalp skal du forsigtigt placere den på en vandtæt barriere, såsom en latexhylster eller aluminiumsfolie på et isbad i 3-5 minutter. Det er vigtigt at undgå at efterlade dyret på isen i en længere periode, da det kan udgøre potentielle risici for hypotermirelaterede komplikationer, herunder ventrikelflimmer, vævshypoxi og metabolisk acidose.
BEMÆRK: Varigheden på 3-5 min kan variere fra sag til sag. Vurder tegn på anæstesi, såsom manglende reaktion på en tåklemme, for at bestemme den passende varighed. - Mens dyret er på isen, skal du fylde sprøjten med 10 μL af lægemiddelformuleringen, viruspræparatet eller kontrollere kunstig rygmarvsvæske osv.
BEMÆRK: I læringsfasen skal du overveje muligheden for at injicere det samme volumen blandet 1% Fast Green-farvestof med leveringsmaterialerne (se materialetabel). Dette kan hjælpe med at visualisere injektionsprocessen og hjælpe med at lære og forfine teknikken. Hvalpe injiceret med Fast Green Dye eller lignende materialer bør aflives kort efter injektion i henhold til den godkendte protokol, da disse materialer kan resultere i inflammatoriske reaktioner eller andre bivirkninger hos dyr. - Når dyret er fuldt bedøvet, som bekræftet af nedsat eller fraværende kropsbevægelse, skal du forsigtigt placere hvalpene under mikroskopet.
- Med venstre pegefinger og tommelfinger palperes forsigtigt det intervertebrale rum langs midterlinjen, der ligger mellem de bilaterale bækkenbælter (supplerende video 1). Drej forsigtigt bunden af halen lidt for at hjælpe med at identificere rygsøjlens midterlinje.
- Juster nålen skrå mod dyrets hoved før injektion.
- Indsæt forsigtigt kanylen, vip den let til en vinkel på 70°-80° på det sted, hvor fordybningen skærer hinanden, samtidig med at sprøjten forbliver på linje med det centrale sagittale plan. Når nålen kommer i kontakt med knoglen, sænkes vinklen gradvist til ca. 30°, og nålen føres derefter ca. 2 mm ind i det intervertebrale rum.
BEMÆRK: Nålens evne til let at løfte hele kroppen er et tegn på vellykket indtræden i det intradurale rum. - Injicer langsomt op til 10 μL volumen inden for 50-60 s. Hold nålen på plads i 10-20 s efter fødslen er afsluttet. Træk kanylen ud med en let rotation for at undgå lækage.
BEMÆRK: Lillehjernen bliver grøn, før nålen trækkes ud. Det langsomme skub er også afgørende for at forhindre en stigning i intrakranielt tryk forbundet med levering og for at minimere potentielle komplikationer. Baseret på vores erfaring med injektioner i mere end 500 hvalpe er det optimalt at levere et volumen på 10 μL over 50-60 s.
3. Efter injektion
- Påfør en vatpind på injektionsstedet, hvis der lækker eller er blod.
BEMÆRK: Der bør ikke være nogen i de fleste tilfælde. Fra vores erfaring er hvalpe behandlet med spor af lækage eller blod stadig brugbare, men overvejelse af en reduceret dosis medicin eller behandlinger kan være nødvendig under dataanalyse. - Placer hvalpen på en varmepude, og lad hvalpene komme sig helt og varme op igen. Overhold omhyggeligt hvalpene for at sikre, at de er opmærksomme og aktivt bevæger sig, før du returnerer dem til deres hjemmebur. Tilstrækkelig genopretning af en mus er indikeret ved restaurering af lyserød hudfarve, øget spontan kropsbevægelse og lydhøre reaktioner på berøring.
- Placer hvalpen tilbage i hjemmeburet, og sørg for, at hvalpen er ordentligt dækket med strøelse, nestlet eller begge dele. Dette sikrer, at hvalpen modtager den nødvendige moderpleje fra dæmningen.
- Vurder det generelle udseende og aktivitet dagligt i mindst 3 dage efter injektionen. Et sygt udseende og nedsat aktivitet kan øge muligheden for infektion, behandlingsrelaterede bivirkninger eller andre komplikationer mv. Rådfør dig om nødvendigt med dyrlægen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket intratekal injektion resulterede straks i den udbredte distribution af den administrerede opløsning, selvom den faktiske cellulære penetration afhang af arten af de leverede lægemidler og materialer. I denne undersøgelse brugte vi Fast Green til at visualisere de umiddelbare resultater efter intratekal injektion (IT) hos vildtype nyfødte (figur 1A-K) og sammenlignede det med konventionel intracerebroventrikulær (ICV) injektion (figur 1L-N). De langsigtede resultater (10 dage efter injektion) blev også undersøgt ved hjælp af YFP-reportermus aktiveret ved levering af CRISPR/Cas9-baseret genredigering7. YFP-ekspression blev observeret bredt på tværs af hele musehjernen sammenlignet med ikke-CRISPR/Cas9-behandlede mus (figur 2). Ekspressionen af YFP blev observeret i størstedelen af cellerne under højere forstørrelse. Injektioner blev udført på mere end 500 nyfødte hvalpe, og over 98% af de injicerede hvalpe overlevede proceduren. Der blev ikke observeret skadelige virkninger på behandlede ungers overlevelse og sundhed på lang sigt (supplerende figur 1).
Figur 1: Tidsmæssig og rumlig fordeling af Fast Green-farvestof i musehjerner. (A) Grov observation af mus, sammenligning af injicerede og ikke-injicerede mus 5 minutter efter intratekal injektion. (B) Visualisering af fordelingen af Fast Green farvestof i musehjernen før dissektion. (C-E) Fordeling af farvestoffet i dissekerede hjerner 5 min efter intratekal administration. (F-H) Fordeling af farvestoffet i dissekerede hjerner 30 min efter intratekal administration. (I-K) Fordeling af farvestoffet i dissekerede hjerner 60 min efter intratekal administration. (L-N) Til sammenligning fordelingen af farvestoffet i dissekerede hjerner 40 minutter efter intracerebroventrikulær administration. Vægtstang: 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Langtidseffekter af intratekalt administreret CRISPR/Cas9 genredigering. Udbredt ekspression af YFP-reporteren i musehjernen efter intratekal injektion af CRISPR/Cas9-genredigering: cerebellum (A-F), posterior cortex (D-F) og præfrontal cortex (G-I). Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Overlevelseskurve for Angelman syndrom mus efter intratekal CRISPR genredigering. Overlevelseskurve, der viser resultaterne af Angelman syndrom-mus, der modtager CRISPR-genredigering gennem intratekal administration, sammenlignet med ikke-behandlede mus og vildtypemus. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video 1: Intratekal injektionsprocedure hos nyfødte mus. Video, der demonstrerer processen med at levere intratekale injektioner til neonatale mus. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet er en trin-for-trin procedure for intratekal injektion i neonatale mus (P1), hvilket resulterer i udbredt lægemiddelfordeling i deres hjerner. I sammenligning med den almindelige intracerebroventrikulære injektionsmetode til levering af medicin til neonatale mus, som indebærer piercing af hjernebarken11, undgår intratekal injektion direkte skade på neonatal musehjerne på grund af nåleindtrængning. På grund af minimal invasivitet kan intratekal injektion udføres gentagne gange, når det er nødvendigt, hvilket simulerer gentagne administrationer hos mennesker i kliniske omgivelser12.
Ændringer i intrakranielt tryk er almindeligvis forbundet med intratekal injektion13, hvilket potentielt fører til dæmningens afvisning og afvisning af fodring på grund af adfærdsændringer hos hvalpene. Imidlertid er der ikke observeret akutte ændringer i adfærd eller nedsat overlevelse blandt injicerede hvalpe. Tilsvarende er usædvanlig eller unormal adfærd forbundet med intratekale injektioner hos voksne ikke blevet bemærket (data ikke vist).
Flere tekniske tips kan have bidraget til succesen og er værd at understrege. Den langsommere injektionshastighed er sandsynligvis en vigtig faktor. Derudover kan kryo-anæstesi reducere intrakranielt tryk før injektionen, minimere tilbagestrømning under intratekal injektion og reducere andre komplikationer. Endelig kan præcisionen af injektionsstedet også påvirke succesraten.
For at opnå den bedste effektivitet via intratekal administration er det afgørende at udføre proceduren så hurtigt som muligt efter, at hvalpene er leveret. Narkotika og andre stoffer, der leveres via intratekal injektion, kommer ind i det intratekale rum, hvilket er rummet mellem arachnoid mater og pia mater lag af meninges, der omgiver hjernen og rygmarven. Derfor passerer lægemidlerne leveret via intratekal injektion gennem disse lag af meninges12. Hos gnavere, som hos mennesker, består meninges af tre lag: dura mater, arachnoid mater og pia mater14. Disse membraner dannes under embryonal udvikling og er fuldt modne på postnatal dag 2 (P2)15. Derfor anbefales det at bruge en hurtig genotypeprotokol til at tildele hvalpene til eksperimentelle grupper inden for få timer, især til forsøg, der involverer dyregenotyper, såsom genredigeringseksperimenter. Jo tidligere hvalpene injiceres, jo bedre er resultatet. Injektionerne afsluttes typisk inden for 3 timer efter fødslen. Dette tidsvindue gør det muligt for de injicerede lægemidler at følge strømmen af cerebrospinalvæske ind i hjernens parenchyma, mens den ependymale foring stadig er umoden og mindre påvirket af størrelsen af lægemiddelpartikler. Det er værd at bemærke udviklingsforskellene mellem mennesker og mus. P1 neonatale mus svarer til det sene svangerskabsstadium af menneskelig hjerneudvikling16. Resultater fra forsøg på P1 neonatale mus tjener som værdifuldt bevis på konceptet, men der bør udvises forsigtighed, når man ekstrapolerer disse resultater til mennesker i translationelle undersøgelsesdesign.
Denne teknik udfordres af et begrænset administrationstidsvindue og kravet om højt kvalificerede eksperimenter. Høj dødelighed kan være forbundet med proceduren, hvis eksperimentatoren mangler erfaring. Den snævre tidsramme kræver imidlertid et øget niveau af præcision og repeterbarhed inden for og mellem undersøgelser. Desuden kan denne metodes færdigheder og succesrate forbedres betydeligt med passende praksis.
Hvis injektionerne udføres korrekt, påvirkes overlevelsen af injicerede hvalpe primært af moderpleje. Det anbefales at forberede plejehunpar til dine mål. Hvis de målrettede hvalpe ikke har en mælkeplet på maven om eftermiddagen på injektionsdagen, skal de straks overføres til plejehunnen. Hunmus genkender deres babyer ved lugt. Derfor er det vigtigt at undgå at introducere ukendte lugte fra eksperimenter eller ikke-relaterede dæmninger til hvalpene under og efter proceduren. Nødvendigheden af at anvende plejehunner bør dog vurderes i forbindelse med individuelle forsøg. Det anbefales også at udføre proceduren i et godt ventileret rum, ideelt i en biologisk damphætte. Det er også nyttigt at blande hvalpene med dæmningens strøelse og ekskrementer. Efter den indledende kontrol efter proceduren anbefales det at minimere forstyrrelse af dæmningen i mindst 3 dage for at reducere stress. Som enhver kirurgisk procedure bør risikoen for infektion efter proceduren overvejes. Derfor bør streng overholdelse af god laboratoriepraksis for sterile procedurer følges under injektionen. Det skal bemærkes, at intratekalt tryk er højere end det ydre miljø, hvilket giver naturlig beskyttelse mod infektion. Erfaringen viser, at infektionshastigheden efter injektion er sjælden. Det anbefales dog at overvåge ungernes generelle udseende og aktivitet i mindst 3 dage efter injektionen for at påvise tegn og symptomer på infektion eller andre komplikationer. I særlige tilfælde kan konsultation med veterinærtjenester være berettiget i stedet for at aflive hvalpe med betydelige komplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
YHJ er medstifter af Couragene, men ingen interessekonflikt for dette projekt.
Acknowledgments
XNL er støttet af Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoc Fellowship. YHJ er også støttet af FAST og NIH Grant R01HD110195 og R01MH117289.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
References
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
