Summary
Protokollen giver en pålidelig og optimeret tilgang til isolering af kerner fra faste tumorprøver til multiomsekventering ved hjælp af 10x Genomics-platformen, herunder anbefalinger til vævsdissociationsbetingelser, kryopræservering af enkeltcellesuspensioner og vurdering af isolerede kerner.
Abstract
Multiom-sekventering, som giver samme celle / parret enkeltcelle-RNA- og analysen for transposase-tilgængeligt kromatin med sekventeringsdata (ATAC-sekventering), repræsenterer et gennembrud i vores evne til at skelne tumorcelleheterogenitet - et primært fokus for translationel kræftforskning på dette tidspunkt. Kvaliteten af sekventeringsdata erhvervet ved hjælp af denne avancerede modalitet er imidlertid meget afhængig af inputmaterialets kvalitet.
Fordøjelsesforholdene skal optimeres for at maksimere celleudbyttet uden at ofre kvaliteten. Dette er især udfordrende i forbindelse med solide tumorer med tætte desmoplastiske matricer, der forsigtigt skal nedbrydes til cellefrigivelse. Frisk isolerede celler fra fast tumorvæv er mere skrøbelige end dem, der er isoleret fra cellelinjer. Da de isolerede celletyper desuden er heterogene, bør der vælges betingelser for at understøtte den samlede cellepopulation.
Endelig skal nukleare isolationsbetingelser optimeres ud fra disse kvaliteter med hensyn til lysetider og reagenstyper/-forhold. I denne artikel beskriver vi vores erfaring med nuklear isolering til 10x Genomics multiomsekventeringsplatform fra solide tumorprøver. Vi giver anbefalinger til vævsfordøjelse, opbevaring af enkeltcellesuspensioner (hvis ønsket) og nuklear isolering og vurdering.
Introduction
Efterhånden som vores viden om tumorbiologi vokser, er vigtigheden af at analysere heterogene celler på tværs af tumormikromiljøet også steget 1,2. Evnen til at erhverve enkeltcelle-RNA og analysen for transposase-tilgængeligt kromatin med sekventeringsdata (ATAC-sekventering) fra den samme celle på en parret cellemåde (multiomsekventering) giver et betydeligt fremskridt mod dette formål 3,4. Disse eksperimenter er imidlertid dyre og tidskrævende, og kvaliteten og virkningen af de indsamlede data afhænger i høj grad af kvaliteten af de eksperimentelle betingelser og materialer. Standardiserede protokoller for kerneisolering er blevet offentliggjort 5,6. Friske og heterogene væv kræver protokoloptimering, da frisk isolerede celler fra solide tumorprøver er mere skrøbelige end dem, der er isoleret fra cellelinjer.
En anden overvejelse er, at for solide tumorer er kirurgiske prøver ofte ikke tilgængelige fra operationsstuen før sent på dagen. Som sådan er det generelt ikke muligt at gå direkte fra prøvetagning til kerneindfangning uden et kryopræserveringstrin. Efter vores erfaring giver frysning af en enkeltcellesuspension kerner af højeste kvalitet (snarere end flashfrosset helvæv eller andre konserveringsmetoder). Dette gælder især for enzymatiske vævstyper med højt RNase-indhold såsom bugspytkirtlen.
Vævsfordøjelsesbetingelser skal også designes til at maksimere celleudbyttet uden at ofre kvalitet7. I forbindelse med faste tumortyper med tætte desmoplastiske matricer8 skal den ekstracellulære matrix forsigtigt nedbrydes til cellefrigivelse. Da de isolerede celletyper desuden er heterogene, bør betingelserne justeres for at understøtte den samlede cellepopulation. Humane pancreas cancer (pancreas ductal adenocarcinom) prøver anvendes i den beskrevne protokol. Kræft i bugspytkirtlen repræsenterer en stærkt desmoplastisk tumortype, som viser relativt klæbrigt væv og celler. Da bugspytkirteltumorprøver, der er tilgængelige til forskning, også har tendens til at være relativt små, gøres der desuden en indsats for at maksimere mængden af celler, der fanges.
Isolering af kerner kræver mest optimering med hensyn til cellelysebetingelser og timing samt reagenstyper og forhold. Håndtering af kernerne i løbet af isolationen kræver også stor omhu. I denne artikel beskriver vi vores erfaring med at optimere nuklear isolering til 10x Genomics multiomsekventeringsplatform fra fast tumorvæv (figur 1). Vi giver anbefalinger til vævsfordøjelse, kryopræservering af enkeltcellesuspensioner (hvis ønsket) og nuklear isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøver af human kræft i bugspytkirtlen (pancreas ductal adenocarcinom) blev erhvervet i henhold til en IRB-godkendt protokol i vores laboratorium. Der blev indhentet informeret samtykke fra patienter til vævsindsamling. Væv blev transporteret fra operationsstuen til laboratoriet og derefter behandlet som følger.
1. Vævsdissociation (fordøjelse)
- Forbered fordøjelsesbuffer (se tabel over materialer).
- Få vævet af interesse så hurtigt som muligt efter tumorudskæring og transporter prøven i slukningsbuffer (DMEM F-12 med ~ 5% føtalt kvægserum) eller 1x PBS på is.
- Hak vævet med ren pincet og saks i 3-5 ml Digest Buffer i en 90 mm petriskål (figur 2A).
- Det hakkede væv overføres til et 50 ml konisk rør og dissocieres i ~10 ml fordøjelsesbuffer i 30 minutter ved 37 °C ved hjælp af et vandbad med rystefunktion eller en tør omrører.
- Fjern fra omrøreren og sluk med ~ 20 ml dæmpningsmedium. Opløsningen filtreres gennem en 100 μm cellesil i et rent konisk rør.
- Eventuelt resterende fast væv opsamles fra sien (om nødvendigt hakkes de resterende vævsstykker igen), og anbringes i ~10 ml frisk fordøjelsesbuffer i yderligere 30 minutter ved 37 °C under omrystning. Gentag indtil alt tumorvæv er blevet dissocieret.
- Poolcellesuspension alikvoter og filtreres gennem en 70 μm efterfulgt af en 40 μm cellesil ind i et rent konisk rør på is.
- Der centrifugeres til pelletceller ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C, hvorefter supernatanten dekanteres.
2. Kryopræservering
- Skyl cellerne ved at resuspendere pelleten i 1 ml 1x PBS.
- Overfør cellesuspensionen (~1-10 millioner celler/rør for optimal frysning) til en 1,5 ml kryovial på is.
- Der centrifugeres til pelletceller ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C, hvorefter supernatanten dekanteres.
- Resuspender cellerne i 1 ml Bambanker-opløsning, overfør til en 1,5 eller 2 ml kryovial (figur 2B), og frys ved hjælp af en frysebeholder med -1 °C/min afkølingshastighed (indeholdende 100% isopropylalkohol) ved -80 °C, eller overfør til flydende nitrogen, hvis der forventes længerevarende opbevaring af prøven.
3. Isolering af kerner
- Optø hurtigt kryovialen af cellesuspension og læg den på våd is.
- Overfør optøningscellesuspensionen til et 2 ml mikrocentrifugeglas, og fyld hætteglasset op til 2 ml opløsning med 1x PBS for at skylle cellerne.
- Få et manuelt celletal ved hjælp af et hæmocytometer til at vurdere både mængden og kvaliteten af cellerne (figur 2C).
- Der centrifugeres til pelletceller ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C, hvorefter supernatanten forsigtigt dekanteres ved hjælp af gradvis mindre pipettespidser for at efterlade en tør pille og holde den på is.
- Brug en svingskovlrotor til alle centrifugeringstrin. For at opnå maksimal celleydelse anbringes glassene i centrifugen med hængslet vendt udad og dekanteres derefter med pipettespidsen rettet mod den modsatte side af røret (figur 2D).
BEMÆRK: Til dekantering af supernatanten skal du bruge gradvist mindre pipettespidser til at fjerne væske for at begrænse forstyrrelsen af pelleten, samtidig med at mængden af dekanteret væske maksimeres. Denne strategi er især nyttig senere i protokollen efter kerneekstraktion, da kernepillen generelt ikke er synlig.
- Brug en svingskovlrotor til alle centrifugeringstrin. For at opnå maksimal celleydelse anbringes glassene i centrifugen med hængslet vendt udad og dekanteres derefter med pipettespidsen rettet mod den modsatte side af røret (figur 2D).
- Forbered 1x cellelysebuffer, cellelysefortyndingsbuffer og vaskebuffer (figur 3A) i henhold til den offentliggjorte protokol med følgende ændringer (se tabel 1, materialetabel):
BEMÆRK: Placer Digitonin på en varmeblok ved 65 °C før brug for at opløse bundfaldet (figur 3B). Dette tager typisk ca. 10 min. - Forbered 0,1x cellelysebufferen ved at kombinere 100 μL 1x cellelysebuffer og 900 μL cellelysefortyndingsbuffer, pipette forsigtigt for at blande og læg den på is.
- Resuspender cellepellet i 100 μL afkølet 0,1x cellelysebuffer og pipette forsigtigt for at blande 5x.
- Inkuber på is i 3 minutter (figur 3C).
- Tilsæt 1 ml kølet vaskebuffer og pipette op og ned for forsigtigt at blande 5x.
- Der centrifugeres for at pelletere kernerne ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C, supernatanten dekanteres forsigtigt til en tør pille og holdes på is.
BEMÆRK: Hvis startcellenummeret er lavt (100.000-200.000 celler), skal du udføre cellelysen og vasketrinnene i et 200 μL PCR-rør i stedet for et 2 ml mikrocentrifugerør for at reducere rørets overfladeareal og minimere tab. I dette tilfælde skal du justere vaskebuffervolumen ned for at give plads til det mindre rørvolumen. - Gentag trin 3.9-3.10 2x for i alt tre vaske.
- Tæl kernerne manuelt ved hjælp af et hæmocytometerglas under mikroskopet. Brug trypanblåt farvestof, hvis det ønskes for at give kontrast til visning af kernerne og for at hjælpe med at skelne kerner fra ulyserede celler.
- Forbered 1x Nuclei Buffer i henhold til den offentliggjorte protokol: 20x Nuclei Buffer stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase-hæmmer i nukleasefrit vand og hold på is (se Tabel over materialer).
- Resuspender kernepillen i 1x Nuclei Buffer baseret på målrettet kernegenvinding.
BEMÆRK: Hvis koncentrationen er høj nok, skal du sigte mod en målrettet genfinding på 10.000 eller lidt højere på dette trin (3.230-8.060 kerner/μL) ved bestemmelse af startresuspensionsvolumenet i betragtning af det forventede volumentab på 25 μL og 20% faldet i koncentration med filtrering (trin 3.15). - De resuspenderede kerners volumen ledes forsigtigt gennem en 40 μm pipettespidscellesi, og kernerne lægges på is (figur 3D).
- Fortæl kernerne igen (figur 4A-C). Den endelige opløsning fortyndes yderligere med Nuclei Buffer, hvis det er nødvendigt.
- Transport kernerne på is og fortsæt straks med kerneindfangning i henhold til offentliggjorte protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at isolere kerner af høj kvalitet fra patientens faste tumorprøver til multiomsekventering (figur 1) blev tumorvævet dissocieret, og en enkeltcellesuspension blev kryopræserveret (figur 2A-D). Cellesuspensionen blev derefter optøet på tidspunktet for planlagt multiomoptagelse. Kerneindfangning blev udført med optimerede lysisbufferreagenser og timing for at maksimere både kvalitet og udbytte (figur 3A-D). Repræsentative kernebilleder viser passende størrelse og form (figur 4A-C). Kernerne cirklet i lysegrå viser mild stippling af konvolutten.
Figur 1: Skematisk oversigt over arbejdsgangen for kerneisolering. Skematisk visning af den grundlæggende arbejdsgang fra en hel tumorvævsprøve til en enkeltkernesuspension klar til indsendelse til kerneindfangning, multiombiblioteksforberedelse og i sidste ende scRNA- og ATAC-sekventering. Forkortelser: scRNA = enkeltcelle RNA; ATAC-seq = assay for transposase-tilgængeligt kromatin med sekventering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vævsfordøjelse, kryopræservering, cellevurdering og centrifugeringstrin. (A) Opsætning af udstyr til hakning af tumorvævsprøver; B) kryopræservering af cellesuspension C) mikroskopisk evaluering af cellesuspension D) fremgangsmåden ved centrifugering i forbindelse med denne protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fremstilling af reagenser, kerneekstraktion og filtrering. A) Fremstilling af kernerekstraktionsreagenser; B) opløsning af digitonin ved 65 °C før anvendelse C) inkubation af prøver til cellelyse på is D) filtrering af ekstraherede kerner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative mikroskopiske billeder af kerner høstet fra komplekse tumorvævsprøver. (A-C) Repræsentative billeder af kerner høstet med og uden Trypan Blue-farvning. (B,C) Kernerne cirklet i lysegrå viser mild stippling af den nukleare kappe. 10x og 40x anvendte mål. Skalabjælker = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Navn på løsning | Komponenter | ||
| Digest Buffer | 0,5-1 mg/ml kollagenase type IV | ||
| 100 U/ml DNase I | |||
| 0,1% Poloxamer 188 | |||
| 20 mM HEPES | |||
| 1 mM CaCl2 | |||
| 3-5% føtalt bovint serum (FBS) i medium 199 | |||
| 1X celle lysebuffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA (i stedet for 1%) | |||
| 0,10% Tween-20 | |||
| 0.1% Nonident P40 erstatning | |||
| 0,01% Digitonin | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAsehæmmer i nukleasefrit vand | |||
| Cellelysefortyndingsbuffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAsehæmmer i nukleasefrit vand | |||
| Vask buffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 0,10% Tween-20 | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAsehæmmer i nukleasefrit vand | |||
Tabel 1: Opløsninger anvendt i denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Untangling af de heterogene cellepopulationer, der er til stede i tumormikromiljøet, er et aktivt fokusområde inden for kræftbiologi. Tilsvarende findes komplekse væv i godartede patologier som sårheling og fibrose. Multiomsekventering har vist sig at være et kraftfuldt værktøj, der tillader erhvervelse af scraRNA- og ATAC-seq-data med samme celle. Denne protokol beskriver isoleringen af kerner, hvilket kræver optimering i indstillingen af behandling af friske, skrøbelige, små tumorprøver. Her giver vi en protokol til kerneisolering fra desmoplastiske faste tumorvævsprøver. Vi har fundet, at denne tilgang giver pålidelige data af høj kvalitet, selv når cellesuspensioner fryses før kerneisolering og indfangning.
Forøgelse af albuminkoncentrationen gennem analysen er nyttig til at begrænse celle- og nedstrømskerner, der klumper, hvilket kan være et problem, når man arbejder med tumorprøver. Med hensyn til vævsfordøjelse kan nedbrydningssætreagenser også bruges sammen med denne protokol, hvis det ønskes (se materialetabel). Hvis det bruges, vil vi stadig anbefale at følge hver 30-minutters fordøjelse / slukning og bufferudveksling for at maksimere udbyttet af levedygtige celler. Efter vævsdissociation kan lyse af røde blodlegemer udføres i henhold til producentens protokol. En gradientcelleseparationsprotokol kan også udføres efter forskerens skøn (se materialetabel). Vi udfører ikke disse protokoller rutinemæssigt, men vi har anvendt sådanne protokoller på lignende prøver uden bemærkelsesværdige forskelle i resultaterne. Hvis der konstateres signifikant, lille snavs efter kernefiltrering, kan fluorescensaktiveret kernesortering (FANS) overvejes til yderligere rensning. En detaljeret diskussion af FANS, herunder protokolanbefalinger, er tilgængelig, men uden for denne protokols anvendelsesområde. Bemærk, at der er protokoller i litteraturen, der overvejer et fikseringstrin før cellelyse. Vi foretrækker dog at fortsætte med ikke-fikseret væv og kerner, da scATAC-seq fungerer bedst på ikke-fikseret væv9.
For cellelyse, da RNase-hæmmeren er ret dyr, er det rimeligt at nedskalere det forberedte volumen af cellelysebufferen (og cellelysefortyndingsbufferen) sammenlignet med de mængder, der er angivet i den offentliggjorte protokol, hvis det ønskes, så længe forholdet mellem reagenser forbliver proportionalt. Ved vurdering og tælling af de høstede kerner kan et LIVE / DEAD levedygtighed / cytotoksicitetssæt anvendes efter forskerens skøn. Trypanblåt farvestof kan også bruges til at give kontrast til visning af kernerne og til at hjælpe med at skelne kerner fra ulyserede celler, hvis det er nødvendigt. Endelig er det værd at bemærke, at vi har anvendt de samme cellelysebetingelser med justerede reagenser pr. Protokol for enkeltcelle ATAC-seq med fremragende resultater10.
Kritiske trin i protokollen er præcis timing af lysis og skånsom, men hensigtsmæssig håndtering af kernerne. Underblanding vil føre til ufuldstændig eller inkonsekvent cellelyse; Overblanding vil dog forskyde kromatinet. Som nævnt i andre kerneisoleringsprotokoller bør kerneblanding opnås ved pipettering snarere end hvirvelskæring af prøven, da forskydningskræfterne kan beskadige de skrøbelige kerner11. I denne henseende er det vigtigt, at cellelysebufferen tilberedes frisk lige før brug ved hver lejlighed. Pipettespidscellebelastning (filtrering) efter det sidste centrifugeringstrin er nøglen i vores erfaring for at forhindre kerneklumpning før indfangning. Denne filtrering kan gentages før pålæsning, hvis der stadig påvises klumper ved den endelige optælling eller udvikles under transport af prøven inden pålæsning, idet der tages hensyn til det yderligere volumen- og koncentrationstab ved hvert filtreringstrin, der tilføjes. Bemærk, at der ikke bør være nogen signifikant tidspause mellem kerneisolering og indfangning.
Begrænsninger i denne protokol er, at vævsdissociation og især cellelyseinkubationstidspunktet og betingelserne muligvis skal optimeres til forskellige faste tumortyper12. Denne protokol er optimeret til desmoplastiske faste tumorer såsom brystkarcinom og pancreas adenocarcinom og er også blevet anvendt med succes på ikke-tumor desmoplastisk væv såsom parenkymal fibrose, men andre tumortyper kan kræve yderligere justeringer. Det er optimeret til både friske cellesuspensioner såvel som frosne cellesuspensioner med fremragende kerneudbytte fra begge disse. Vi anbefaler at forfølge en sådan optimering sekventielt startende med vævsdissociation, og når en optimal enkeltcellesuspension er opnået, gå videre til optimering af cellelysebetingelserne for at give en optimal enkeltkernesuspension.
Enkeltcelle ATAC-sekventering og for nylig multiomsekventering præsenterer et enormt gennembrudsværktøj til udredning af solid tumorcellulær heterogenitet. Celleundertyper kan afgrænses baseret på både deres kromatintilgængelighed og genekspressionsegenskaber, og indflydelsen af transkriptionsfaktortilgængelighed og ekspression på tumoradfærd kan undersøges direkte. Disse metodologiske fremskridt anvendes bredt i betragtning af deres enorme potentiale til at afdække nye terapeutiske mål. Som sådan er udviklingen af optimerede protokoller for at opnå disse data af største betydning. Her deler vi denne protokol for kerneisolering i forbindelse med kræft i bugspytkirtlen væv - en kræfttype, for hvilken der kun findes få terapier, og alle med begrænset effekt til dato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), især Dhananjay Wagh og John Coller, og 10x Genomics for deres hjælp med at optimere vores eksperimenter. Vi vil også gerne takke Dr. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser og Byrne Lee for deres hjælp med at erhverve patientprøver. Vi vil gerne takke Art og Elaine Taylor, Rantz Foundation og Warren og Judy Kaplan for deres generøse støtte til vores forskningsindsats. Finansieringskilder omfatter NIH-tilskud 1F32CA23931201A1 (DSF), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Damon Runyon Cancer Research Foundation (D.D., M.T.L.), Gunn / Olivier Fund, California Institute for Regenerative Medicine, Stinehart / Reed Foundation og Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Sekventering blev opnået ved hjælp af maskiner købt med NIH-midler (S10OD025212, S10OD018220 og 1S10OD01058001A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
References
- Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087 (2023).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
- Foster, D. S., et al. Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin. Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).
- Hasan, S., Buechler, M. B. What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts. Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).
- Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
- Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
- Januszyk, M., et al. Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing. Micromachines (Basel). 11 (9), 815 (2020).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. JCI Insight. 3 (18), e99911 (2018).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118 (2021).
- Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. J Vis Exp. (175), (2021).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J Vis Exp. (162), e61542 (2020).
