Summary
Le protocole fournit une approche fiable et optimisée de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides pour le séquençage multiome à l’aide de la plate-forme 10x Genomics, y compris des recommandations pour les conditions de dissociation des tissus, la cryoconservation des suspensions unicellulaires et l’évaluation des noyaux isolés.
Abstract
Le séquençage multiome, qui fournit des données de séquençage (séquençage ATAC), qui fournit des données de séquençage de l’ARN unicellulaire identique ou apparié et le test de la chromatine accessible par transposase (séquençage ATAC), représente une percée dans notre capacité à discerner l’hétérogénéité des cellules tumorales, un objectif principal de la recherche translationnelle sur le cancer à l’heure actuelle. Cependant, la qualité des données de séquençage acquises à l’aide de cette modalité avancée dépend fortement de la qualité du matériau d’entrée.
Les conditions de digestion doivent être optimisées pour maximiser le rendement cellulaire sans sacrifier la qualité. Ceci est particulièrement difficile dans le contexte des tumeurs solides avec des matrices desmoplastiques denses qui doivent être décomposées doucement pour la libération cellulaire. Les cellules fraîchement isolées du tissu tumoral solide sont plus fragiles que celles isolées des lignées cellulaires. De plus, comme les types de cellules isolées sont hétérogènes, les conditions doivent être sélectionnées pour soutenir la population cellulaire totale.
Enfin, les conditions d’isolement nucléaire doivent être optimisées en fonction de ces qualités en termes de temps de lyse et de types/ratios de réactifs. Dans cet article, nous décrivons notre expérience de l’isolement nucléaire pour la plate-forme de séquençage multiome 10x Genomics à partir d’échantillons de tumeurs solides. Nous fournissons des recommandations pour la digestion des tissus, le stockage des suspensions unicellulaires (si désiré), ainsi que l’isolement et l’évaluation nucléaires.
Introduction
Au fur et à mesure que nos connaissances sur la biologie des tumeurs augmentent, l’importance de l’analyse des cellules hétérogènes dans le microenvironnement tumoral a également augmenté 1,2. La possibilité d’acquérir de l’ARN unicellulaire et le dosage de la chromatine accessible par transposase avec des données de séquençage (séquençage ATAC) à partir de la même cellule à la manière d’une cellule appariée (séquençage multiome) constitue une avancée significative vers cette fin 3,4. Cependant, ces expériences sont coûteuses et prennent beaucoup de temps, et la qualité et l’impact des données acquises dépendent fortement de la qualité des conditions expérimentales et des matériaux. Des protocoles normalisés pour l’isolement des noyaux ont été publiés 5,6. Les tissus frais et hétérogènes nécessitent une optimisation du protocole, car les cellules fraîchement isolées à partir d’échantillons de tumeurs solides sont plus fragiles que celles isolées à partir de lignées cellulaires.
Une autre considération est que pour les tumeurs solides, les échantillons chirurgicaux ne sont souvent pas disponibles de la salle d’opération avant la fin de la journée. Ainsi, il n’est généralement pas possible de passer directement de l’acquisition de l’échantillon à la capture des noyaux sans une étape de cryoconservation. D’après notre expérience, la congélation d’une suspension unicellulaire permet d’obtenir des noyaux de la plus haute qualité (plutôt que des tissus entiers surgelés ou d’autres modalités de conservation). Cela est particulièrement vrai pour les types de tissus enzymatiques à forte teneur en RNase tels que le pancréas.
Les conditions de digestion des tissus doivent également être conçues pour maximiser le rendement cellulaire sans sacrifier la qualité7. Dans le contexte des types de tumeurs solides avec des matrices desmoplastiques denses8, la matrice extracellulaire doit être décomposée en douceur pour la libération cellulaire. De plus, étant donné que les types de cellules isolées sont hétérogènes, les conditions doivent être ajustées pour soutenir la population cellulaire totale. Des échantillons de cancer du pancréas humain (adénocarcinome canalaire pancréatique) sont utilisés dans le protocole décrit. Le cancer du pancréas représente un type de tumeur hautement desmoplastique, ce qui laisse présager des tissus et des cellules relativement collants. De plus, comme les échantillons de tumeurs pancréatiques disponibles pour la recherche ont également tendance à être relativement petits, des efforts sont faits pour maximiser la quantité de cellules capturées.
L’isolement des noyaux nécessite le plus d’optimisation en termes de conditions et de temps de lyse cellulaire, ainsi que de types et de ratios de réactifs. La manipulation des noyaux au cours de l’isolement nécessite également une grande prudence. Dans cet article, nous décrivons notre expérience dans l’optimisation de l’isolement nucléaire pour la plateforme de séquençage multiome 10x Genomics à partir de tissus tumoraux solides (Figure 1). Nous fournissons des recommandations pour la digestion des tissus, la cryoconservation des suspensions unicellulaires (si vous le souhaitez) et l’isolement nucléaire.
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Protocol
Des échantillons de cancer du pancréas humain (adénocarcinome canalaire pancréatique) ont été prélevés dans notre laboratoire selon un protocole approuvé par l’IRB. Le consentement éclairé des patients a été obtenu pour le prélèvement de tissus. Les tissus ont été transportés de la salle d’opération au laboratoire, puis traités comme suit.
1. Dissociation tissulaire (digestion)
- Préparez le tampon de synthèse (voir le tableau des matériaux).
- Obtenir le tissu d’intérêt dès que possible après l’exérèse de la tumeur et transporter l’échantillon dans un tampon de trempe (DMEM F-12 avec ~5% de sérum de veau fœtal) ou 1x PBS sur glace.
- Hacher le tissu à l’aide d’une pince propre et de ciseaux dans 3 à 5 mL de tampon de digestion dans une boîte de Pétri de 90 mm (Figure 2A).
- Transférez le tissu haché dans un tube conique de 50 mL et dissociez-le dans ~10 mL de tampon digéré pendant 30 min à 37 °C à l’aide d’un bain-marie avec fonction d’agitation ou d’un agitateur sec.
- Retirer de l’agitateur et tremper avec ~20 mL de milieu de trempe. Filtrez la solution à travers une crépine cellulaire de 100 μm dans un tube conique propre.
- Récupérez les tissus solides restants de la passoire (émincez à nouveau les morceaux de tissu restants si nécessaire) et placez-les dans ~10 mL de tampon Digest frais pendant encore 30 minutes à 37 °C en agitant. Répétez l’opération jusqu’à ce que tout le tissu tumoral ait été dissocié.
- Aliquotes de suspension de cellules de piscine et filtre à travers une crépine de 70 μm suivie d’une crépine de cellules de 40 μm dans un tube conique propre sur de la glace.
- Centrifuger dans des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, puis décanter le surnageant.
2. Cryoconservation
- Rincez les cellules en remettant la pastille en suspension dans 1 mL de PBS 1x.
- Transférez la suspension cellulaire (~1 à 10 millions de cellules/tube pour une congélation optimale) dans un flacon cryogénique de 1,5 ml sur glace.
- Centrifuger dans des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, puis décanter le surnageant.
- Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de solution de Bambanker, les transférer dans un flacon cryogénique de 1,5 ou 2 mL (figure 2B) et les congeler à l’aide d’un récipient de congélation à vitesse de refroidissement de -1 °C/min (contenant de l’alcool isopropylique à 100 %) à -80 °C, ou les transférer à l’azote liquide si l’on prévoit un stockage à plus long terme de l’échantillon.
3. Isolement des noyaux
- Décongelez rapidement le cryofiole de suspension cellulaire et placez-le sur de la glace humide.
- Transférez la suspension cellulaire décongelée dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et complétez le flacon dans une solution de 2 mL avec 1x PBS pour rincer les cellules.
- Obtenir une numération cellulaire manuelle à l’aide d’un hémocytomètre pour évaluer à la fois la quantité et la qualité des cellules (figure 2C).
- Centrifuger sur des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, puis décanter doucement le surnageant à l’aide d’embouts de pipette de plus en plus petits pour laisser une pastille sèche et la maintenir sur de la glace.
- Utilisez un rotor à godets oscillants pour toutes les étapes de centrifugation. Pour un rendement maximal des cellules, placez les tubes dans la centrifugeuse avec la charnière tournée vers l’extérieur, puis décantez avec l’embout de pipette dirigé vers le côté opposé du tube (Figure 2D).
REMARQUE : Pour décanter le surnageant, utilisez des pointes de pipette de plus en plus petites pour éliminer le liquide afin de limiter la perturbation de la pastille tout en maximisant le volume de fluide décanté. Cette stratégie est particulièrement utile plus tard dans le protocole suivant l’extraction des noyaux, car la pastille des noyaux n’est généralement pas visible.
- Utilisez un rotor à godets oscillants pour toutes les étapes de centrifugation. Pour un rendement maximal des cellules, placez les tubes dans la centrifugeuse avec la charnière tournée vers l’extérieur, puis décantez avec l’embout de pipette dirigé vers le côté opposé du tube (Figure 2D).
- Préparez 1x tampon de lyse cellulaire, tampon de dilution de lyse cellulaire et tampon de lavage (Figure 3A) selon le protocole publié avec les modifications suivantes (voir Tableau 1, Tableau des matériaux) :
REMARQUE : Placez la digitonine sur un bloc chauffant à 65 °C avant utilisation pour dissoudre le précipité (Figure 3B). Cela prend généralement environ 10 minutes. - Préparez le tampon de lyse cellulaire 0,1x en combinant 100 μL de tampon de lyse cellulaire 1x et 900 μL de tampon de dilution de lyse cellulaire, pipetez doucement pour mélanger et placez-le sur de la glace.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de tampon de lyse cellulaire 0,1x refroidi et pipeter doucement pour mélanger 5x.
- Incuber sur de la glace pendant 3 minutes (figure 3C).
- Ajouter 1 mL de tampon de lavage réfrigéré et pipeter de haut en bas pour mélanger délicatement 5 fois.
- Centrifuger pour granuler les noyaux à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, décanter doucement le surnageant en pastille sèche et maintenir sur glace.
REMARQUE : Si le nombre de cellules de départ est faible (100 000 à 200 000 cellules), effectuez les étapes de lyse et de lavage des cellules dans un tube PCR de 200 μL au lieu d’un tube de microcentrifugation de 2 mL pour réduire la surface du tube et minimiser les pertes. Dans ce cas, ajustez le volume du tampon de lavage vers le bas pour s’adapter au plus petit volume du tube. - Répétez les étapes 3.9-3.10 2x pour un total de trois lavages.
- Comptez manuellement les noyaux à l’aide d’une lame d’hémocytomètre sous le microscope. Utilisez un colorant bleu trypan si vous le souhaitez pour fournir un contraste permettant de visualiser les noyaux et d’aider à distinguer les noyaux des cellules non lysées.
- Préparez le tampon 1x noyaux selon le protocole publié : 20x stock tampon de noyaux, 1 mM DTT, 1 inhibiteur U/μL de la RNase dans de l’eau sans nucléase et conservez-le sur glace (voir le tableau des matériaux).
- Remettre en suspension la pastille de noyaux dans 1x Nuclei Buffer en fonction de la récupération des noyaux ciblés sur l’objectif.
NOTA : Si la concentration est suffisamment élevée, viser une récupération ciblée de 10 000 ou légèrement plus à cette étape (3 230 à 8 060 noyaux/μL) lors de la détermination du volume de remise en suspension de départ, compte tenu de la perte de volume prévue de 25 μL et de la diminution de 20 % de la concentration avec filtration (étape 3.15). - Passez doucement le volume des noyaux remis en suspension à travers une crépine cellulaire à pointe de pipette de 40 μm et placez les noyaux sur de la glace (Figure 3D).
- Comptez les noyaux (Figure 4A-C). Diluez davantage la solution finale avec Nuclei Buffer si nécessaire.
- Transportez les noyaux sur de la glace et procédez immédiatement à la capture des noyaux selon les protocoles publiés.
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Representative Results
Pour isoler des noyaux de haute qualité à partir d’échantillons de tumeurs solides de patients pour le séquençage multiome (Figure 1), le tissu tumoral a été dissocié et une suspension unicellulaire a été cryopréservée (Figure 2A-D). La suspension cellulaire a ensuite été décongelée au moment de la capture planifiée du multiome. La capture des noyaux a été effectuée à l’aide de réactifs tampons de lyse et d’un timing optimisés afin de maximiser à la fois la qualité et le rendement (Figure 3A-D). Les images représentatives des noyaux montrent la taille et la forme appropriées (Figure 4A-C). Les noyaux entourés de gris pâle présentent de légers pointillés de l’enveloppe.
Figure 1 : Schéma du flux de travail d’isolement des noyaux. Schéma montrant le flux de travail de base d’un échantillon de tissu tumoral entier à une suspension à noyau unique prête à être soumise pour la capture de noyaux, la préparation de banques multiomes et, finalement, le séquençage de l’ARNsc et de l’ATAC. Abréviations : scRNA = ARN unicellulaire ; ATAC-seq = test de chromatine accessible par transposase avec séquençage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Étapes de digestion des tissus, de cryoconservation, d’évaluation des cellules et de centrifugation. (A) Installation de l’équipement pour le hachage des échantillons de tissus tumoraux ; (B) cryoconservation des suspensions cellulaires ; (C) évaluation microscopique de la suspension cellulaire ; (D) approche de la centrifugation pour ce protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Préparation des réactifs, extraction des noyaux et filtrage. (A) Préparation des réactifs d’extraction des noyaux ; (B) dissolution de la digitonine à 65 °C avant utilisation ; (C) l’incubation d’échantillons pour la lyse cellulaire sur glace ; (D) filtrage des noyaux extraits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images microscopiques représentatives de noyaux prélevés sur des échantillons complexes de tissus tumoraux. (A-C) Images représentatives de noyaux prélevés avec et sans coloration au bleu trypan. (B,C) Les noyaux entourés de gris pâle montrent de légers pointillés de l’enveloppe nucléaire. Objectifs 10x et 40x utilisés. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom de la solution | Composants | ||
| Tampon de synthèse | 0,5 à 1 mg/mL de collagénase de type IV | ||
| 100 U/mL de DNase I | |||
| 0,1 % de Poloxamère 188 | |||
| 20 mM HEPES | |||
| 1 mM de CaCl2 | |||
| 3 à 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) en milieu 199 | |||
| 1X tampon de lyse cellulaire | 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM de NaCl | |||
| 3 mM de MgCl2 | |||
| 2 % d’ASB (au lieu de 1 %) | |||
| 0,10 % De l’adolescent à 20 ans | |||
| 0,1 % de substitut P40 non ident | |||
| 0,01 % de digitonine | |||
| 1 mM TNT | |||
| 1 inhibiteur de l’ARNase U/μL dans de l’eau exempte de nucléases | |||
| Tampon de dilution de lyse cellulaire | 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM de NaCl | |||
| 3 mM de MgCl2 | |||
| 2 % BSA | |||
| 1 mM TNT | |||
| 1 inhibiteur de l’ARNase U/μL dans de l’eau exempte de nucléases | |||
| Tampon de lavage | 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM de NaCl | |||
| 3 mM de MgCl2 | |||
| 2 % BSA | |||
| 0,10 % De l’adolescent à 20 ans | |||
| 1 mM TNT | |||
| 1 inhibiteur de l’ARNase U/μL dans de l’eau exempte de nucléases | |||
Tableau 1 : Solutions utilisées dans ce protocole.
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Discussion
Démêler les populations cellulaires hétérogènes présentes dans le microenvironnement tumoral est un domaine d’intérêt actif en biologie du cancer. De même, des tissus complexes existent dans les pathologies bénignes telles que la cicatrisation des plaies et la fibrose. Le séquençage multiome est apparu comme un outil puissant permettant l’acquisition de données de séquençage de l’ARNsc et de l’ATAC appariés de cellules identiques. Ce protocole décrit l’isolement des noyaux, ce qui exige une optimisation dans le cadre du traitement d’échantillons tumoraux frais, fragiles et de petite taille. Nous fournissons ici un protocole pour l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tissus tumoraux solides desmoplastiques. Nous avons constaté que cette approche permet d’obtenir des données fiables et de haute qualité, même lorsque les suspensions cellulaires sont congelées avant l’isolement et la capture des noyaux.
L’augmentation de la concentration d’albumine tout au long du test est utile pour limiter l’agglutination des cellules et des noyaux en aval, ce qui peut être un problème lorsque l’on travaille avec des échantillons tumoraux. En ce qui concerne la digestion des tissus, les réactifs du kit de digestion peuvent également être utilisés avec ce protocole si vous le souhaitez (voir le tableau des matériaux). S’il est utilisé, nous recommandons toujours de suivre les échanges digest/trempe et tampon toutes les 30 minutes pour maximiser le rendement des cellules viables. Après dissociation des tissus, la lyse des globules rouges peut être effectuée selon le protocole du fabricant. Un protocole de séparation cellulaire par gradient peut également être effectué à la discrétion du chercheur (voir le tableau des matériaux). Nous n’effectuons pas ces protocoles de manière routinière, mais nous les avons appliqués à des échantillons similaires sans différences notables dans les résultats. Si de petits débris importants sont observés après le filtrage des noyaux, le tri des noyaux activés par fluorescence (FANS) peut être envisagé pour une purification plus approfondie. Une discussion détaillée de FANS, y compris les recommandations de protocole, est disponible, mais dépasse le cadre de ce protocole. Il convient de noter qu’il existe des protocoles dans la littérature qui envisagent une étape de fixation avant la lyse cellulaire. Cependant, nous préférons procéder avec des tissus et des noyaux non fixés car le scATAC-seq fonctionne mieux sur les tissus non fixés9.
Pour la lyse cellulaire, comme l’inhibiteur de la RNase est assez coûteux, il est raisonnable de réduire le volume préparé du tampon de lyse cellulaire (et du tampon de dilution de lyse cellulaire) par rapport aux volumes fournis dans le protocole publié, si vous le souhaitez, tant que les rapports de réactifs restent proportionnels. Lors de l’évaluation et du comptage des noyaux récoltés, une trousse de viabilité/cytotoxicité LIVE/DEAD peut être appliquée à la discrétion du chercheur. Le colorant bleu trypan peut également être utilisé pour fournir un contraste permettant de visualiser les noyaux et pour aider à distinguer les noyaux des cellules non lysées si nécessaire. Enfin, il est intéressant de noter que nous avons appliqué les mêmes conditions de lyse cellulaire avec des réactifs ajustés par protocole pour le séquençage ATAC unicellulaire avec d’excellents résultats10.
Les étapes critiques du protocole sont le moment précis de la lyse et la manipulation douce mais rapide des noyaux. Un mélange insuffisant entraînera une lyse cellulaire incomplète ou incohérente ; Cependant, un mélange excessif cisaillera la chromatine. Comme indiqué dans d’autres protocoles d’isolement des noyaux, le mélange des noyaux doit être effectué par pipetage plutôt que par vortex de l’échantillon, car les forces de cisaillement peuvent endommager les noyaux fragiles11. À cet égard, il est important que le tampon de lyse cellulaire soit préparé frais juste avant l’utilisation à chaque occasion. D’après notre expérience, la filtration des cellules à pointe de pipette après l’étape finale de centrifugation est essentielle pour éviter l’agglutination des noyaux avant la capture. Ce filtrage peut être répété avant le chargement si des amas sont encore détectés lors du comptage final ou s’ils se développent pendant le transport de l’échantillon avant le chargement, en gardant à l’esprit la perte supplémentaire de volume et de concentration à chaque étape de filtrage ajoutée. Il convient de noter qu’il ne devrait pas y avoir de pause significative entre l’isolement des noyaux et la capture.
Les limites de ce protocole sont que la dissociation tissulaire et, en particulier, le moment et les conditions d’incubation de la lyse cellulaire peuvent avoir besoin d’être optimisés pour différents types de tumeurs solides12. Ce protocole a été optimisé pour les tumeurs solides desmoplastiques telles que le carcinome mammaire et l’adénocarcinome pancréatique et a également été appliqué avec succès aux tissus desmoplastiques non tumoraux tels que la fibrose parenchymateuse, mais d’autres types de tumeurs peuvent nécessiter des ajustements supplémentaires. Il est optimisé à la fois pour les suspensions de cellules fraîches et les suspensions de cellules congelées avec un excellent rendement en noyaux à partir de ces deux éléments. Nous recommandons de poursuivre cette optimisation séquentiellement en commençant par la dissociation tissulaire, et une fois qu’une suspension unicellulaire optimale a été obtenue, en passant à l’optimisation des conditions de lyse cellulaire pour obtenir une suspension optimale à noyau unique.
Le séquençage ATAC unicellulaire et, plus récemment, le séquençage multiome constituent un formidable outil révolutionnaire pour démêler l’hétérogénéité cellulaire des tumeurs solides. Les sous-types cellulaires peuvent être délimités en fonction de leur accessibilité à la chromatine et de leurs caractéristiques d’expression génique, et l’influence de l’accessibilité et de l’expression des facteurs de transcription sur le comportement de la tumeur peut être examinée directement. Ces avancées méthodologiques sont largement appliquées compte tenu de leur énorme potentiel pour découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. À ce titre, le développement de protocoles optimisés pour obtenir ces données est de la plus haute importance. Nous partageons ici ce protocole pour l’isolement des noyaux dans le contexte du tissu cancéreux du pancréas, un type de cancer pour lequel il existe peu de thérapies et dont l’efficacité est limitée à ce jour.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), en particulier Dhananjay Wagh et John Coller, ainsi que 10x Genomics pour leur aide dans l’optimisation de nos expériences. Nous tenons également à remercier les Drs George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser et Byrne Lee pour leur aide dans l’acquisition d’échantillons de patients. Nous tenons à remercier Art et Elaine Taylor, la Fondation Rantz, ainsi que Warren et Judy Kaplan pour leur généreux soutien à nos efforts de recherche. Les sources de financement comprennent les subventions des NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L), la Fondation Goldman Sachs (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), la Fondation Damon Runyon pour la recherche sur le cancer (D.D., M.T.L.), le Fonds Gunn/Olivier, le California Institute for Regenerative Medicine, la Fondation Stinehart/Reed et le Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Le séquençage a été obtenu à l’aide de machines achetées avec des fonds du NIH (S10OD025212, S10OD018220 et 1S10OD01058001A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
References
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