Summary
Protokollen gir en pålitelig og optimalisert tilnærming til isolering av kjerner fra solide tumorprøver for multiomsekvensering ved bruk av 10x Genomics-plattformen, inkludert anbefalinger for vevsdissosiasjonsforhold, kryopreservering av enkeltcellesuspensjoner og vurdering av isolerte kjerner.
Abstract
Multiomsekvensering, som gir samme celle / parret enkeltcelle RNA- og analysen for transposase-tilgjengelig kromatin med sekvensering (ATAC-sekvensering) data, representerer et gjennombrudd i vår evne til å skille tumorcelleheterogenitet - et primært fokus for translasjonell kreftforskning på dette tidspunktet. Imidlertid er kvaliteten på sekvenseringsdata oppnådd ved hjelp av denne avanserte modaliteten svært avhengig av kvaliteten på inngangsmaterialet.
Fordøyelsesforholdene må optimaliseres for å maksimere celleutbyttet uten å ofre kvaliteten. Dette er spesielt utfordrende i sammenheng med solide svulster med tette desmoplastiske matriser som må brytes forsiktig ned for cellefrigjøring. Ferskt isolerte celler fra solid tumorvev er mer skjøre enn de som er isolert fra cellelinjer. I tillegg, da de isolerte celletypene er heterogene, bør forholdene velges for å støtte den totale cellepopulasjonen.
Til slutt må kjernefysiske isolasjonsforhold optimaliseres basert på disse egenskapene når det gjelder lysetider og reagenstyper / forhold. I denne artikkelen beskriver vi vår erfaring med kjernefysisk isolasjon for 10x Genomics multiome sekvenseringsplattform fra solide tumorprøver. Vi gir anbefalinger for vevsfordøyelse, lagring av encellede suspensjoner (om ønskelig), og nukleær isolasjon og vurdering.
Introduction
Etter hvert som vår kunnskap om tumorbiologi vokser, har viktigheten av å analysere heterogene celler på tvers av tumormikromiljøet også økt 1,2. Evnen til å skaffe enkeltcelle-RNA og analysen for transposase-tilgjengelig kromatin med sekvensering (ATAC-sekvensering) data fra samme celle på en parret celle måte (multiomsekvensering) gir et betydelig fremskritt mot dette målet 3,4. Disse eksperimentene er imidlertid dyre og tidkrevende, og kvaliteten og effekten av dataene som er innhentet er svært avhengig av kvaliteten på eksperimentelle forhold og materialer. Standardiserte protokoller for kjerneisolering er publisert 5,6. Friske og heterogene vev krever protokolloptimalisering siden ferskt isolerte celler fra solide tumorprøver er mer skjøre enn de som er isolert fra cellelinjer.
En annen vurdering er at for solide svulster er kirurgiske prøver ofte ikke tilgjengelige fra operasjonssalen før sent på dagen. Som sådan er det generelt ikke mulig å gå direkte fra prøveinnsamling til kjernefangst uten et kryopreserveringstrinn. Etter vår erfaring gir frysing av en enkeltcellesuspensjon kjerner av høyeste kvalitet (i stedet for flashfrosset hele vev eller andre konserveringsmodaliteter). Dette gjelder spesielt for enzymatiske vevstyper med høyt RNase-innhold som bukspyttkjertelen.
Vevsfordøyelsesforhold må også utformes for å maksimere celleutbyttet uten å ofre kvalitet7. I sammenheng med solide tumortyper med tette desmoplastiske matriser8, må den ekstracellulære matrisen brytes forsiktig ned for cellefrigivelse. I tillegg, fordi de isolerte celletypene er heterogene, bør forholdene justeres for å støtte den totale cellepopulasjonen. Prøver av kreft i bukspyttkjertelen (pankreasduktalt adenokarsinom) brukes i den beskrevne protokollen. Kreft i bukspyttkjertelen representerer en svært desmoplastisk tumortype, som gir relativt klebrig vev og celler. Videre, som bukspyttkjerteltumorprøver tilgjengelig for forskning også har en tendens til å være relativt små, blir det gjort en innsats for å maksimere mengden celler fanget.
Isolering av kjerner krever mest optimalisering når det gjelder cellelyseforhold og timing, samt reagenstyper og forhold. Håndtering av kjernene i løpet av isolasjon krever også stor forsiktighet. I denne artikkelen beskriver vi vår erfaring med å optimalisere kjernefysisk isolasjon for 10x Genomics multiome sekvenseringsplattform fra solid tumorvev (figur 1). Vi gir anbefalinger for vevsfordøyelse, kryopreservering av encellede suspensjoner (hvis ønskelig) og nukleær isolasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøver fra human bukspyttkjertelkreft (pankreasduktalt adenokarsinom) ble innhentet i henhold til en IRB-godkjent protokoll i vårt laboratorium. Informert samtykke ble innhentet fra pasienter for vevsinnsamling. Vev ble transportert fra operasjonssalen til laboratoriet og deretter behandlet som følger.
1. Vev dissosiasjon (fordøyelse)
- Forbered fordøyelsesbuffer (se materialtabell).
- Få vevet av interesse så snart som mulig etter tumoreksisjon og transporter prøven i slukkebuffer (DMEM F-12 med ~ 5% føtalt bovint serum) eller 1x PBS på is.
- Hakk vevet med ren tang og saks i 3-5 ml fordøyelsesbuffer i en 90 mm petriskål (figur 2A).
- Overfør hakket vev til et 50 ml konisk rør og dissosiere i ~ 10 ml fordøyelsesbuffer i 30 minutter ved 37 ° C ved hjelp av et vannbad med ristefunksjon eller en tørr agitator.
- Fjern fra omrøreren og slukk med ~ 20 ml slukkemedium. Filtrer oppløsningen gjennom en 100 μm cellesil til et rent konisk rør.
- Samle eventuelt gjenværende fast vev fra silen (hakk gjenværende vevsstykker om nødvendig), og legg i ~ 10 ml fersk fordøyelsesbuffer i ytterligere 30 minutter ved 37 ° C med omrøring. Gjenta til alt tumorvev er dissosiert.
- Bassengcellesuspensjon alikoter og filtrer gjennom en 70 μm etterfulgt av en 40 μm cellesil til et rent konisk rør på is.
- Sentrifuge til pelletsceller ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C og deretter dekantere supernatanten.
2. Kryopreservering
- Skyll cellene ved å resuspendere pelleten i 1 ml 1x PBS.
- Overfør cellesuspensjonen (~1-10 millioner celler/rør for optimal frysing) til en 1,5 ml kryovial på is.
- Sentrifuge til pelletsceller ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C og deretter dekantere supernatanten.
- Resuspender cellene i 1 ml Bambanker-oppløsning, overfør til en 1,5 eller 2 ml kryovial (figur 2B), og frys ned ved hjelp av en frysebeholder med -1 °C/min kjølehastighet (inneholdende 100 % isopropylalkohol) ved -80 °C, eller overfør til flytende nitrogen hvis langvarig lagring av prøven forventes.
3. Kjerner isolasjon
- Tine raskt kryovialen av cellesuspensjon og legg den på våt is.
- Overfør den tinte cellesuspensjonen til et 2 ml mikrosentrifugerør og fyll på hetteglasset til 2 ml oppløsning med 1x PBS for å skylle cellene.
- Få en manuell celletelling ved hjelp av et hemocytometer for å vurdere både mengden og kvaliteten på cellene (figur 2C).
- Sentrifuger til pelletsceller ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C og dekanter deretter supernatanten forsiktig ved hjelp av gradvis mindre pipettespisser for å etterlate en tørr pellet og holde den på is.
- Bruk en svingbøtterotor for alle sentrifugeringstrinn. For maksimalt celleutbytte, plasser rørene i sentrifugen med hengslet vendt utover og dekanter deretter med pipettespissen rettet mot motsatt side av røret (figur 2D).
MERK: For dekantering av supernatanten, bruk gradvis mindre pipettespisser for å fjerne væske for å begrense forstyrrelse av pelleten mens du maksimerer volumet av væske dekantert. Denne strategien er spesielt nyttig senere i protokollen etter kjerneutvinning siden kjernepelleten generelt ikke er synlig.
- Bruk en svingbøtterotor for alle sentrifugeringstrinn. For maksimalt celleutbytte, plasser rørene i sentrifugen med hengslet vendt utover og dekanter deretter med pipettespissen rettet mot motsatt side av røret (figur 2D).
- Klargjør 1x cellelysebuffer, cellelysisfortynningsbuffer og vaskebuffer (figur 3A) i henhold til den publiserte protokollen med følgende modifikasjoner (se tabell 1, materialfortegnelse):
MERK: Plasser digitoninet på en varmeblokk ved 65 °C før bruk for å løse opp bunnfallet (figur 3B). Dette tar vanligvis ca 10 min. - Klargjør 0,1x cellelysebuffer ved å kombinere 100 mikrol 1x cellelysebuffer og 900 mikroliter cellelysisfortynningsbuffer, pipette forsiktig for å blande og legg den på is.
- Resuspender cellepelleten i 100 mikrol kjølt 0,1x cellelysebuffer og pipetter forsiktig for å blande 5x.
- Inkuber på is i 3 minutter (figur 3C).
- Tilsett 1 ml kjølt vaskebuffer og pipette opp og ned for å blande 5x forsiktig.
- Sentrifuge for å pelletere kjernene ved 500 × g i 5 minutter ved 4 °C, dekantere supernatanten forsiktig til en tørr pellet, og vedlikeholde på is.
MERK: Hvis startcellenummeret er lavt (100 000-200 000 celler), utfør cellelysen og vask trinnene i et 200 μL PCR-rør i stedet for et 2 ml mikrosentrifugerør for å redusere røroverflaten og minimere tap. I dette tilfellet justerer du vaskebuffervolumet ned for å imøtekomme det mindre rørvolumet. - Gjenta trinn 3.9-3.10 2x for totalt tre vasker.
- Telle kjernene manuelt ved hjelp av et hemocytometer-lysbilde under mikroskopet. Bruk trypanblått fargestoff hvis ønskelig for å gi kontrast for å se kjernene og for å hjelpe til med å skille kjerner fra ulyserte celler.
- Forbered 1x kjernebuffer i henhold til den publiserte protokollen: 20x kjernebufferlager, 1 mM DTT, 1 U / μL RNase-hemmer i nukleasefritt vann og hold på is (se materialtabell).
- Resuspender kjernepelleten i 1x kjernebuffer basert på målrettet kjerneutvinning.
MERK: Hvis konsentrasjonen er høy nok, må du sikte på en målrettet utvinning på 10 000 eller litt høyere ved dette trinnet (3 230-8 060 kjerner / μL) når du bestemmer startresuspensjonsvolumet, gitt forventet volumtap på 25 μL og 20% reduksjon i konsentrasjon med filtrering (trinn 3.15). - Før det resuspenderte kjernevolumet forsiktig gjennom en 40 μm pipettespisscellesil og legg kjernene på is (figur 3D).
- Fortell kjernene på nytt (figur 4A-C). Fortynn den endelige løsningen ytterligere med kjernebuffer om nødvendig.
- Transporter kjernene på is og fortsett umiddelbart med kjernefangst i henhold til publiserte protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å isolere kjerner av høy kvalitet fra solide tumorprøver fra pasienter for multiomsekvensering (figur 1) ble tumorvevet dissosiert og en encellesuspensjon ble kryopreservert (figur 2A-D). Cellesuspensjonen ble deretter tint på tidspunktet for planlagt multiomfangst. Kjernefangst ble utført med optimaliserte lysisbufferreagenser og timing for å maksimere både kvalitet og utbytte (figur 3A-D). Representative kjernebilder viser passende størrelse og form (figur 4A-C). Kjernene sirklet i lysegrått viser mild stippling av konvolutten.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av arbeidsflyt for kjerneisolasjon. Skjematisk viser den grunnleggende arbeidsflyten fra en hel tumorvevsprøve til en enkeltkjernesuspensjon klar for innsending for kjernefangst, multiombibliotekforberedelse og til slutt scRNA- og ATAC-sekvensering. Forkortelser: scRNA = encellet RNA; ATAC-seq = analyse for transposase-tilgjengelig kromatin med sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vevsfordøyelse, kryopreservering, cellevurdering og sentrifugeringstrinn. (A) Utstyrsoppsett for hakking av tumorvevsprøver; (B) cellesuspensjonskryopreservering; (C) mikroskopisk evaluering av cellesuspensjon; (D) tilnærming til sentrifugering for denne protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fremstilling av reagenser, kjerneekstraksjon og filtrering. (A) Fremstilling av kjerneekstraksjonsreagenser; b) oppløsning av digitonin ved 65 °C før bruk, (C) inkubasjon av prøver for cellelyse på is; (D) filtrering av ekstraherte kjerner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative mikroskopiske bilder av kjerner høstet fra komplekse tumorvevsprøver. (A-C) Representative bilder av kjerner høstet med og uten Trypan Blue-farging. (B,C) Kjernene sirklet i lysegrått viser mild stippling av atomhylsteret. 10x og 40x mål brukt. Skalastenger = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på løsning | Komponenter | ||
| Fordøye buffer | 0,5-1 mg/ml kollagenase type IV | ||
| 100 U/ml DNase I | |||
| 0,1% Poloxamer 188 | |||
| 20 mM HEPES | |||
| 1 mM CaCl2 | |||
| 3-5% føtal bovint serum (FBS) i Medium 199 | |||
| 1X cellelysebuffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA (i stedet for 1%) | |||
| 0,10% Tween-20 | |||
| 0,1% nonident P40 erstatning | |||
| 0,01% Digitonin | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAse-hemmer i nukleasefritt vann | |||
| Buffer for fortynning av cellelyse | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAse-hemmer i nukleasefritt vann | |||
| Vask buffer | 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 0,10% Tween-20 | |||
| 1 mM DTT | |||
| 1 U/μL RNAse-hemmer i nukleasefritt vann | |||
Tabell 1: Løsninger som brukes i denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Untangling de heterogene cellepopulasjonene som er tilstede i tumormikromiljøet er et aktivt fokusområde i kreftbiologi. På samme måte finnes komplekse vev i godartede patologier som sårheling og fibrose. Multiom-sekvensering har dukket opp som et kraftig verktøy som tillater innsamling av samme celleparede scRNA- og ATAC-seq-data. Denne protokollen beskriver isolering av kjerner, noe som krever optimalisering i innstillingen av behandling av friske, skjøre, små tumorprøver. Her gir vi en protokoll for kjerneisolering fra desmoplastiske faste tumorvevsprøver. Vi har funnet ut at denne tilnærmingen gir pålitelige data av høy kvalitet selv når cellesuspensjoner fryses før kjerner isoleres og fanges.
Å øke albuminkonsentrasjonen gjennom analysen er nyttig for å begrense celle- og nedstrøms kjerneklumping, noe som kan være et problem når du arbeider med tumorprøver. Når det gjelder vevsfordøyelse, kan fordøyelsessettreagenser også brukes med denne protokollen hvis ønskelig (se materialtabell). Hvis det brukes, vil vi fortsatt anbefale å følge hver 30-minutters fordøyelse / slukking og bufferutveksling for å maksimere utbyttet av levedyktige celler. Etter vevsdissosiasjon kan lyse av røde blodlegemer utføres i henhold til produsentens protokoll. En gradientcelleseparasjonsprotokoll kan også utføres etter forskerens skjønn (se materialtabell). Vi utfører ikke disse protokollene rutinemessig, men vi har brukt slike protokoller på lignende prøver uten merkbare forskjeller i resultatene. Hvis det oppdages betydelig, lite rusk etter kjernefiltrering, kan fluorescensaktiverte kjernesortering (FANS) vurderes for ytterligere rensing. En detaljert diskusjon av FANS, inkludert protokollanbefalinger, er tilgjengelig, men utenfor omfanget av denne protokollen. Merk at det er protokoller i litteraturen som vurderer et fikseringstrinn før cellelyse. Vi foretrekker imidlertid å fortsette med ikke-fiksert vev og kjerner, da scATAC-seq fungerer best på ufiksert vev9.
For cellelyse, da RNase-hemmeren er ganske kostbar, er det rimelig å skalere ned det forberedte volumet av cellelysebufferen (og cellelysisfortynningsbufferen) sammenlignet med volumene gitt i den publiserte protokollen, om ønskelig, så lenge forholdet mellom reagenser forblir proporsjonale. Ved vurdering og telling av de høstede kjernene, kan et LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit brukes etter forskerens skjønn. Trypanblå fargestoff kan også brukes til å gi kontrast for visning av kjernene og for å hjelpe til med å skille kjerner fra ulyserte celler om nødvendig. Til slutt er det verdt å merke seg at vi har anvendt de samme cellelysebetingelsene med justerte reagenser per protokoll for encellede ATAC-seq med gode resultater10.
Kritiske trinn i protokollen er presis timing av lysis og skånsom, men hensiktsmessig håndtering av kjernene. Underblanding vil føre til ufullstendig eller inkonsistent cellelyse; Imidlertid vil overblanding skjære kromatinet. Som nevnt i andre kjerneisolasjonsprotokoller, bør kjerneblanding oppnås ved pipettering i stedet for vortexing av prøven, da skjærkreftene kan skade de skjøre kjernene11. I denne forbindelse er det viktig at cellelysebufferen tilberedes fersk rett før bruk ved hver anledning. Celleanstrengelse (filtrering av pipettespisser) etter det siste sentrifugeringstrinnet er nøkkelen i vår erfaring for å forhindre at kjerner klumper seg før fangst. Denne filtreringen kan gjentas før lasting hvis klumper fortsatt oppdages på den endelige tellingen eller utvikles under transport av prøven før lasting, med tanke på det ekstra tapet i volum og konsentrasjon med hvert filtreringstrinn lagt til. Merk at det ikke bør være noen betydelig tidspause mellom kjerneisolering og fangst.
Begrensninger i denne protokollen er at vevsdissosiasjon og spesielt cellelysens inkubasjonstid og forhold kanskje må optimaliseres for forskjellige solide tumortyper12. Denne protokollen er optimalisert for desmoplastiske solide svulster som brystkarsinom og bukspyttkjerteladenokarsinom, og har også blitt brukt på ikke-tumor desmoplastisk vev som parenkymal fibrose, men andre tumortyper kan kreve ytterligere justeringer. Den er optimalisert for både ferskcellesuspensjoner samt frosne cellesuspensjoner med utmerket kjerneutbytte fra begge disse. Vi anbefaler å forfølge en slik optimalisering sekvensielt med å starte med vevsdissosiasjon, og når en optimal enkeltcellesuspensjon er oppnådd, gå videre til optimalisering av cellelyseforholdene for å gi en optimal enkeltkjernesuspensjon.
Enkeltcelle ATAC-sekvensering og mer nylig multiomsekvensering presenterer et enormt gjennombruddsverktøy for å løsne solid tumorcellulær heterogenitet. Cellesubtyper kan avgrenses basert på både deres kromatintilgjengelighet og genuttrykksegenskaper, og påvirkningen av transkripsjonsfaktortilgjengelighet og uttrykk på tumoradferd kan undersøkes direkte. Disse metodologiske fremskrittene blir bredt anvendt gitt deres enorme potensial for å avdekke nye terapeutiske mål. Som sådan er utviklingen av optimaliserte protokoller for å skaffe disse dataene av største betydning. Her deler vi denne protokollen for kjerneisolering i sammenheng med kreftvev i bukspyttkjertelen - en krefttype som det finnes få terapier for, og alle med begrenset effekt til dags dato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), spesielt Dhananjay Wagh og John Coller, og 10x Genomics for deres hjelp med å optimalisere våre eksperimenter. Vi vil også takke Dr. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser og Byrne Lee for deres hjelp med å skaffe pasientprøver. Vi ønsker å anerkjenne Art og Elaine Taylor, Rantz Foundation, og Warren og Judy Kaplan for deres sjenerøse støtte til vår forskningsinnsats. Finansieringskilder inkluderer NIH-tilskudd 1F32CA23931201A1 (DSF), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Damon Runyon Cancer Research Foundation (D.D., M.T.L.), Gunn / Olivier Fund, California Institute for Regenerative Medicine, Stinehart / Reed Foundation og Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Sekvensering ble oppnådd ved hjelp av maskiner kjøpt med NIH-midler (S10OD025212, S10OD018220 og 1S10OD01058001A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
References
- Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087 (2023).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
- Foster, D. S., et al. Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin. Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).
- Hasan, S., Buechler, M. B. What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts. Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).
- Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
- Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
- Januszyk, M., et al. Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing. Micromachines (Basel). 11 (9), 815 (2020).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. JCI Insight. 3 (18), e99911 (2018).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118 (2021).
- Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. J Vis Exp. (175), (2021).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J Vis Exp. (162), e61542 (2020).
