Summary
Протокол обеспечивает надежный и оптимизированный подход к выделению ядер из солидных образцов опухолей для мультиомного секвенирования с использованием платформы 10x Genomics, включая рекомендации по условиям диссоциации тканей, криоконсервации одноклеточных суспензий и оценке изолированных ядер.
Abstract
Мультиомное секвенирование, которое обеспечивает одноклеточные/парные одноклеточные РНК и анализ на доступный транспозазе хроматин с данными секвенирования (ATAC-секвенирование), представляет собой прорыв в нашей способности различать гетерогенность опухолевых клеток, что является основным направлением трансляционных исследований рака в настоящее время. Однако качество данных секвенирования, полученных с помощью этого усовершенствованного метода, сильно зависит от качества входного материала.
Условия пищеварения должны быть оптимизированы, чтобы максимизировать выход клеток без ущерба для качества. Это особенно сложно в контексте солидных опухолей с плотными десмопластическими матрицами, которые должны быть аккуратно разрушены для высвобождения клеток. Свежевыделенные клетки из солидной опухолевой ткани более хрупкие, чем клетки, выделенные из клеточных линий. Кроме того, поскольку выделенные типы клеток неоднородны, следует выбирать условия, поддерживающие общую клеточную популяцию.
Наконец, на основе этих качеств необходимо оптимизировать условия ядерной изоляции с точки зрения времени лизиса и типов/соотношений реагентов. В этой статье мы опишем наш опыт ядерной изоляции для платформы секвенирования мультиома 10x Genomics из солидных образцов опухолей. Мы даем рекомендации по расщеплению тканей, хранению одноклеточных суспензий (при желании), а также по выделению и оценке ядер.
Introduction
По мере того, как наши знания о биологии опухолей растут, важность анализа гетерогенных клеток в микроокружении опухоли также возрастает 1,2. Возможность получения одноклеточной РНК и анализа транспозазного хроматина с данными секвенирования (ATAC-секвенирование) из одной и той же клетки в парном клеточном режиме (мультиомное секвенирование) обеспечивает значительный прогресс в достижении этой цели 3,4. Однако эти эксперименты являются дорогостоящими и трудоемкими, а качество и влияние полученных данных в значительной степени зависят от качества экспериментальных условий и материалов. Опубликованы стандартизированные протоколы выделения ядер 5,6. Свежие и гетерогенные ткани требуют оптимизации протокола, поскольку свежевыделенные клетки из солидных образцов опухолей более хрупкие, чем клетки, выделенные из клеточных линий.
Еще одно соображение заключается в том, что при солидных опухолях хирургические образцы часто недоступны в операционной до позднего вечера. Таким образом, как правило, невозможно перейти непосредственно от отбора пробы к захвату ядер без этапа криоконсервации. По нашему опыту, замораживание одноклеточной суспензии дает ядра самого высокого качества (в отличие от мгновенной заморозки цельной ткани или других способов консервации). Это особенно верно для ферментативных типов тканей с высоким содержанием РНКазы, таких как поджелудочная железа.
Условия переваривания тканей также должны быть спроектированы таким образом, чтобы максимизировать выход клеток без ущерба для качества7. В контексте солидных опухолей с плотными десмопластическими матрицами8 внеклеточный матрикс должен быть аккуратно разрушен для высвобождения клеток. Кроме того, поскольку выделенные типы клеток неоднородны, условия должны быть скорректированы для поддержания общей популяции клеток. В описанном протоколе используются образцы рака поджелудочной железы человека (протоковая аденокарцинома поджелудочной железы). Рак поджелудочной железы представляет собой высокодесмопластический тип опухоли, который предвещает относительно липкую ткань и клетки. Более того, поскольку образцы опухолей поджелудочной железы, доступные для исследования, также имеют тенденцию быть относительно небольшими, предпринимаются усилия для максимального увеличения количества захваченных клеток.
Выделение ядер требует максимальной оптимизации с точки зрения условий и времени лизиса клеток, а также типов и соотношений реагентов. Обращение с ядрами в процессе изоляции также требует большой осторожности. В этой статье мы опишем наш опыт оптимизации ядерной изоляции для платформы 10-кратного секвенирования Genomics multiome из солидной опухолевой ткани (рис. 1). Мы даем рекомендации по расщеплению тканей, криоконсервации одноклеточных суспензий (при желании) и ядерной изоляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы рака поджелудочной железы человека (протоковая аденокарцинома поджелудочной железы) были получены в нашей лаборатории в соответствии с протоколом, одобренным IRB. От пациентов было получено информированное согласие на забор тканей. Ткань транспортировалась из операционной в лабораторию, а затем обрабатывалась следующим образом.
1. Диссоциация тканей (пищеварение)
- Подготовьте буфер дайджеста (см. Таблицу материалов).
- Получить интересующую ткань как можно скорее после иссечения опухоли и транспортировать образец в буфере для закалки (DMEM F-12 с ~5% фетальной бычьей сыворотки) или 1x PBS на льду.
- Измельчите ткань с помощью чистых щипцов и ножниц в 3-5 мл Digest Buffer в чашке Петри диаметром 90 мм (Рисунок 2A).
- Переложите измельченную ткань в коническую пробирку объемом 50 мл и диссоциируйте в ~10 мл пищеварительного буфера в течение 30 минут при 37 °C, используя водяную баню с функцией встряхивания или сухую мешалку.
- Выньте из мешалки и заглушите ~20 мл закалочной среды. Процедите раствор через ситечко с ячейками 100 мкм в чистую коническую пробирку.
- Соберите оставшуюся твердую ткань из ситечка (при необходимости повторно измельчите оставшиеся кусочки ткани) и поместите в ~10 мл свежего буфера для переваривания еще на 30 минут при температуре 37 °C при перемешивании. Повторяйте до тех пор, пока вся опухолевая ткань не будет диссоциирована.
- Суспензию ячейки пула аликвотируют и фильтруют через 70 мкм, а затем через сетчатое ситечко 40 мкм в чистую коническую трубку на льду.
- Центрифугу для гранулированных ячеек при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C, а затем сцеживают надосадочную жидкость.
2. Криоконсервация
- Промойте клетки, повторно суспендировав гранулы в 1 мл 1x PBS.
- Перенесите клеточную суспензию (~1-10 миллионов клеток/пробирка для оптимального замораживания) в криовиальную камеру объемом 1,5 мл на льду.
- Центрифугу для гранулированных ячеек при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C, а затем сцеживают надосадочную жидкость.
- Ресуспендант клеток в 1 мл раствора Bambanker, переложить в криовиальную камеру объемом 1,5 или 2 мл (рис. 2B) и заморозить в морозильном контейнере со скоростью охлаждения -1 °C/мин (содержащем 100% изопропиловый спирт) при -80 °C, или перенести в жидкий азот, если предполагается более длительное хранение образца.
3. Выделение ядер
- Быстро разморозьте криовиальную клеточную суспензию и поместите ее на влажный лед.
- Перелейте размороженную клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и долейте флакон до 2 мл раствора 1x PBS для промывки клеток.
- Получите ручной подсчет клеток с помощью гемоцитометра, чтобы оценить как количество, так и качество клеток (рис. 2C).
- Центрифугу в грануляторах при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C, а затем осторожно сцеживают надосадочную жидкость с помощью постепенно уменьшающихся наконечников пипетки, чтобы оставить сухие гранулы и держать их на льду.
- Используйте ротор с поворотным ковшом для всех этапов центрифугирования. Для максимального выхода клеток поместите пробирки в центрифугу шарниром наружу, а затем сцедите наконечник пипетки, направленный на противоположную сторону пробирки (рис. 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для декантации надосадочной жидкости используйте постепенно уменьшающиеся наконечники пипетки для удаления жидкости, чтобы ограничить разрушение гранул и при этом максимизировать объем сцеживаемой жидкости. Эта стратегия особенно полезна на более поздних этапах протокола после экстракции ядер, поскольку гранула ядра, как правило, не видна.
- Используйте ротор с поворотным ковшом для всех этапов центрифугирования. Для максимального выхода клеток поместите пробирки в центрифугу шарниром наружу, а затем сцедите наконечник пипетки, направленный на противоположную сторону пробирки (рис. 2D).
- Приготовьте 1x буфер для лизиса клеток, буфер для разбавления лизиса клеток и буфер для промывки (рисунок 3A) в соответствии с опубликованным протоколом со следующими изменениями (см. таблицу 1, таблицу материалов):
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием поместите Digitonin на нагревательный блок при температуре 65 °C, чтобы растворить осадок (Рисунок 3B). Обычно это занимает около 10 минут. - Приготовьте буфер для лизиса клеток 0,1x, смешав 100 мкл 1x буфера для лизиса клеток и 900 мкл буфера для разбавления лизиса клеток, осторожно перемешайте пипетку и поместите на лед.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл охлажденного 0,1-кратного буфера для лизиса клеток и осторожно перемешайте 5 раз.
- Инкубируйте на льду в течение 3 мин (рисунок 3C).
- Добавьте 1 мл охлажденного буфера для промывки и пипетку вверх и вниз, чтобы аккуратно перемешать 5 раз.
- Центрифугу гранулировать ядра при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C, осторожно сцедить надосадочную жидкость в сухую гранулу и выдержать на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если исходное количество клеток низкое (100 000-200 000 клеток), выполните этапы лизиса и промывки клеток в пробирке для ПЦР объемом 200 мкл вместо пробирки для микроцентрифуги объемом 2 мл, чтобы уменьшить площадь поверхности пробирки и минимизировать потери. В этом случае отрегулируйте громкость буфера промывки в меньшую сторону, чтобы вместить меньший объем трубки. - Повторите шаги 3.9-3.10 2 раза, чтобы в общей сложности сделать три стирки.
- Вручную подсчитайте ядра с помощью предметного стекла гемоцитометра под микроскопом. При желании используйте трипановый синий краситель, чтобы обеспечить контраст для просмотра ядер и помочь отличить ядра от нелизированных клеток.
- Приготовьте 1x Nuclei Buffer в соответствии с опубликованным протоколом: 20x Nuclei Buffer stock, 1 мМ DTT, 1 U/мкл ингибитора РНКазы в безнуклеазной воде и храните на льду (см. Таблицу материалов).
- Ресуспендируйте гранулы ядер в 1x Nuclei Buffer в зависимости от целевого восстановления ядер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация достаточно высока, стремитесь к целевому извлечению 10 000 или немного выше на этом этапе (3 230-8 060 ядер/мкл) при определении начального объема ресуспендии, учитывая ожидаемую потерю объема на 25 мкл и снижение концентрации на 20% при фильтрации (шаг 3.15). - Осторожно пропустите ресуспендированный объем ядер через ситечко с наконечником пипетки 40 мкм и поместите ядра на лед (рис. 3D).
- Пересчитайте ядра (рис. 4А-В). При необходимости разбавьте окончательный раствор буфером для ядер.
- Транспортируйте ядра на льду и немедленно приступайте к захвату ядер в соответствии с опубликованными протоколами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для выделения высококачественных ядер из образцов солидных опухолей пациента для мультиомного секвенирования (рис. 1) опухолевую ткань диссоциировали и криоконсервировали одноклеточную суспензию (рис. 2A-D). Затем клеточную суспензию размораживали во время запланированного мультиомного захвата. Захват ядер проводили с использованием оптимизированных лизисных буферных реагентов и времени для максимизации качества и выхода (рис. 3A-D). Репрезентативные изображения ядер показывают соответствующие размеры и форму (рис. 4A-C). Ядра, обведенные бледно-серым цветом, показывают легкие пятна оболочки.
Рисунок 1: Схема рабочего процесса выделения ядер. Схема, показывающая основной рабочий процесс от целого образца опухолевой ткани до одноядерной суспензии, готовой к отправке для захвата ядер, подготовки мультиомной библиотеки и, в конечном итоге, секвенирования scRNA и ATAC. Аббревиатуры: scRNA = одноклеточная РНК; ATAC-seq = анализ на транспозазный хроматин с секвенированием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Этапы расщепления тканей, криоконсервации, оценки клеток и центрифугирования. А) оборудование для измельчения образцов опухолевой ткани; (Б) криоконсервация клеточной суспензии; (C) микроскопическая оценка клеточной суспензии; (D) подход к центрифугированию для данного протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Подготовка реагентов, экстракция ядер и фильтрация. (А) Приготовление реагентов для экстракции ядер; (B) растворение дигитонина при 65 °C перед использованием; (C) инкубация образцов для лизиса клеток на льду; (D) фильтрация экстрагированных ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные микроскопические изображения ядер, полученных из сложных образцов опухолевой ткани. (А-С) Репрезентативные изображения ядер, собранных с окрашиванием трипановым синим и без него. (В,В) Ядра, обведенные бледно-серым цветом, демонстрируют легкую выпуклость ядерной оболочки. Используются 10-кратные и 40-кратные объективы. Масштабные линейки = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Имя решения | Компоненты | ||
| Буфер дайджеста | 0,5-1 мг/мл коллагеназа IV типа | ||
| 100 ЕД/мл ДНКазы I | |||
| 0,1% Полоксамер 188 | |||
| 20 мМ HEPES | |||
| 1 мМ CaCl2 | |||
| 3-5% фетальная бычья сыворотка (FBS) в средней среде 199 | |||
| 1X буфер лизиса клеток | 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4) | ||
| 10 мМ NaCl | |||
| 3 мМ MgCl2 | |||
| 2% BSA (а не 1%) | |||
| 0,10% Твин-20 | |||
| 0,1% неидентифицированный заменитель P40 | |||
| 0,01% дигитонин | |||
| 1 мМ DTT | |||
| 1 U/мкл ингибитора РНКазы в воде, не содержащей нуклеаз | |||
| Буфер для разбавления лизиса клеток | 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4) | ||
| 10 мМ NaCl | |||
| 3 мМ MgCl2 | |||
| 2% БСА | |||
| 1 мМ DTT | |||
| 1 U/мкл ингибитора РНКазы в воде, не содержащей нуклеаз | |||
| Буфер промывки | 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4) | ||
| 10 мМ NaCl | |||
| 3 мМ MgCl2 | |||
| 2% БСА | |||
| 0,10% Твин-20 | |||
| 1 мМ DTT | |||
| 1 U/мкл ингибитора РНКазы в воде, не содержащей нуклеаз | |||
Таблица 1: Решения, используемые в этом протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Распутывание гетерогенных клеточных популяций, присутствующих в микроокружении опухоли, является активной областью внимания в биологии рака. Точно так же сложные ткани существуют при доброкачественных патологиях, таких как заживление ран и фиброз. Мультиомное секвенирование стало мощным инструментом, позволяющим получать данные одноклеточных парных scRNA- и ATAC-seq. Этот протокол описывает изоляцию ядер, которая требует оптимизации в условиях обработки свежих, хрупких, небольших опухолевых образцов. Здесь мы приводим протокол выделения ядер из десмопластических образцов солидной опухолевой ткани. Мы обнаружили, что такой подход позволяет получать надежные и высококачественные данные даже в тех случаях, когда клеточные суспензии замораживаются до выделения и захвата ядер.
Увеличение концентрации альбумина на протяжении всего анализа помогает ограничить слипание клеток и нижележащих ядер, что может быть проблемой при работе с образцами опухоли. Что касается расщепления тканей, то при желании с этим протоколом также можно использовать реагенты из наборов для пищеварения (см. Таблицу материалов). В случае использования мы по-прежнему рекомендуем проводить каждые 30 минут обмен дайджеста/гашения и буфера, чтобы максимизировать выход жизнеспособных клеток. После диссоциации тканей лизис эритроцитов может быть выполнен в соответствии с протоколом производителя. Протокол градиентного разделения клеток также может быть выполнен по усмотрению исследователя (см. таблицу материалов). Мы не выполняем эти протоколы на регулярной основе, но мы применяли такие протоколы к аналогичным образцам без заметных различий в результатах. Если после фильтрации ядер отмечается значительный мелкий мусор, для дальнейшей очистки можно рассмотреть возможность флуоресцентно-активированной сортировки ядер (FANS). Подробное обсуждение FANS, включая рекомендации по протоколу, доступно, но выходит за рамки данного протокола. Следует отметить, что в литературе существуют протоколы, которые рассматривают этап фиксации перед лизисом клетки. Тем не менее, мы предпочитаем работать с нефиксированными тканями и ядрами, так как scATAC-seq лучше всего работает на нефиксированных тканях9.
Для лизиса клеток, поскольку ингибитор РНКазы является довольно дорогостоящим, разумно уменьшить подготовленный объем буфера для лизиса клеток (и буфера для разбавления лизиса клеток) по сравнению с объемами, предусмотренными в опубликованном протоколе, при условии, что соотношение реагентов остается пропорциональным. При оценке и подсчете собранных ядер по усмотрению исследователя может быть применен набор ЖИВОЙ/МЕРТВОЙ жизнеспособности/цитотоксичности. Трипановый синий краситель также может быть использован для обеспечения контраста при просмотре ядер и для различения ядер от нелизированных клеток, если это необходимо. Наконец, стоит отметить, что мы применили те же условия лизиса клеток с адаптированными реагентами по протоколу для одноклеточного ATAC-seq с отличными результатами10.
Важнейшими шагами в протоколе являются точное определение времени лизиса и бережное, но целесообразное обращение с ядрами. Недостаточное перемешивание приведет к неполному или непоследовательному лизису клеток; Однако чрезмерное перемешивание приведет к сдвигу хроматина. Как отмечалось в других протоколах выделения ядер, смешивание ядер должно осуществляться путем пипетирования, а не вихря образца, поскольку силы сдвига могут повредить хрупкие ядра11. В связи с этим важно, чтобы буфер для лизиса клеток был приготовлен свежим непосредственно перед использованием. Натяжение (фильтрация) клеток с наконечником пипетки после заключительного этапа центрифугирования является ключевым моментом в нашем опыте для предотвращения слипания ядер перед захватом. Эту фильтрацию можно повторить перед загрузкой, если комки все еще обнаруживаются при окончательном подсчете или образуются во время транспортировки образца перед загрузкой, с учетом дополнительных потерь объема и концентрации с каждым добавленным этапом фильтрации. Следует отметить, что между выделением ядер и захватом не должно быть существенной временной паузы.
Ограничения этого протокола заключаются в том, что диссоциация тканей и, в частности, сроки и условия инкубации лизиса клеток могут быть оптимизированы для различных типов солидных опухолей12. Этот протокол был оптимизирован для десмопластических солидных опухолей, таких как карцинома молочной железы и аденокарцинома поджелудочной железы, а также успешно применяется к неопухолевым десмопластическим тканям, таким как паренхиматозный фиброз, но другие типы опухолей могут потребовать дополнительной коррекции. Он оптимизирован как для свежих клеточных суспензий, так и для замороженных клеточных суспензий с отличным выходом ядер и из того, и другого. Мы рекомендуем проводить такую оптимизацию последовательно, начиная с диссоциации тканей, а после достижения оптимальной одноклеточной суспензии переходить к оптимизации условий лизиса клеток для получения оптимальной одноядерной суспензии.
Одноклеточное ATAC-секвенирование, а в последнее время и мультиомное секвенирование представляют собой потрясающий прорывной инструмент для распутывания клеточной гетерогенности солидных опухолей. Подтипы клеток могут быть выделены на основе их доступности хроматина и характеристик экспрессии генов, а влияние доступности и экспрессии транскрипционного фактора на поведение опухоли может быть изучено напрямую. Эти методологические достижения находят широкое применение, учитывая их огромный потенциал для выявления новых терапевтических мишеней. Таким образом, разработка оптимизированных протоколов для получения этих данных имеет первостепенное значение. Здесь мы делимся этим протоколом выделения ядер в контексте ткани рака поджелудочной железы — типа рака, для которого существует мало методов лечения, и все они имеют ограниченную эффективность на сегодняшний день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить благодарность Стэнфордскому центру функциональной геномики (SFGF), в частности, Дхананджаю Вагу и Джону Коллеру, а также 10x Genomics за их помощь в оптимизации наших экспериментов. Мы также хотели бы поблагодарить докторов Джорджа Поултсайда, Монику Дуа, Брендана Виссера и Бирна Ли за их помощь в получении образцов пациентов. Мы хотели бы поблагодарить Арта и Элейн Тейлор, Фонд Ранца, а также Уоррена и Джуди Каплан за их щедрую поддержку наших исследований. Источники финансирования включают гранты NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Фонд исследования рака Дэймона Раньона (D.D., M.T.L.), Фонд Ганна/Оливье, Калифорнийский институт регенеративной медицины, Фонд Стайнхарта/Рида и Лаборатория детской регенеративной медицины Хейги. Секвенирование было получено с помощью машин, приобретенных на средства NIH (S10OD025212, S10OD018220 и 1S10OD01058001A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
References
- Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087 (2023).
- Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
- Foster, D. S., et al. Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin. Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).
- Hasan, S., Buechler, M. B. What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts. Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).
- Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
- Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
- Januszyk, M., et al. Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing. Micromachines (Basel). 11 (9), 815 (2020).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. JCI Insight. 3 (18), e99911 (2018).
- Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
- Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118 (2021).
- Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. J Vis Exp. (175), (2021).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J Vis Exp. (162), e61542 (2020).
