Summary
Vi beskriver en detaljeret protokol til fremstilling af postkryopræserverede hESC-afledte fotoreceptorstamceller og subretinal levering af disse celler i rd10-mus .
Abstract
Regenerering af fotoreceptorceller ved hjælp af humane pluripotente stamceller er en lovende terapi til behandling af både arvelige og aldrende nethindesygdomme på avancerede stadier. Vi har vist, at human rekombinant nethindespecifik laminin isoform matrix er i stand til at understøtte differentieringen af humane embryonale stamceller (hESC'er) til fotoreceptorforfædre. Derudover har subretinal injektion af disse celler også vist delvis restaurering i rd10 gnaver- og kaninmodellerne. Subretinal injektion er kendt for at være en etableret metode, der er blevet brugt til at levere farmaceutiske forbindelser til fotoreceptorcellerne og retinal pigmenteret epitel (RPE) lag i øjet på grund af dets nærhed til målrummet. Det er også blevet brugt til at levere adeno-associerede virale vektorer i sub-retinale rum til behandling af retinale sygdomme. Den subretinale levering af farmaceutiske forbindelser og celler i murine modellen er udfordrende på grund af begrænsningen i størrelsen af murine øjeæblet. Denne protokol beskriver den detaljerede procedure til fremstilling af hESC-afledte fotoreceptorstamceller til injektion og subretinal leveringsteknik for disse celler i genetisk retinitis pigmentosa-mutant, rd10-mus . Denne tilgang tillader celleterapi til det målrettede område, især det ydre nukleare lag af nethinden, hvor sygdomme, der fører til fotoreceptordegeneration, forekommer.
Introduction
Arvelige retinale sygdomme og aldersrelateret makuladegeneration fører til fotoreceptorcelletab og eventuel blindhed. Den retinale fotoreceptor er det ydre segmentlag af nethinden, der består af specialiserede celler, der er ansvarlige for fototransduktion (dvs. omdannelse af lys til neuronale signaler). Stang- og keglefotoreceptorcellerne støder op til det retinale pigmenterede lag (RPE)1. Fotoreceptorcellesubstitutionsterapi for at kompensere for celletabet har været en ny og udviklende terapeutisk tilgang. Embryonale stamceller (ESC'er)2,3,4, inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er)-afledte RPE-celler og retinale stamceller (RPC'er)4,5,6,7,8 blev brugt til at gendanne de beskadigede fotoreceptorceller. Sub-retinal rum, et begrænset rum mellem nethinden og RPE, er et attraktivt sted at deponere disse celler for at erstatte beskadigede fotoreceptorceller, RPE og Mueller-celler på grund af dets nærhed 9,10,11.
Gen- og celleterapier har udnyttet det subretinale rum til regenerativ medicin til forskellige nethindesygdomme i prækliniske undersøgelser. Dette omfatter levering af funktionelle kopier af genet eller genredigeringsværktøjer i form af enten anti-sense oligonukleotidterapi12,13 eller CRISPR/Cas9 eller baseredigering via adeno-associeret virus (AAV) baseret strategi 14,15,16, implantation af materialer (f.eks. RPE-ark, retinale proteser 17,18,19) og differentierede stamcelleafledte retinale organoider 20,21,22 til behandling af retinale og RPE-relaterede sygdomme. Kliniske forsøg med hESC-RPE31 i subretinale rum til behandling af RPE65-associeret Leber medfødt amaurose (LCA)23,24, CNGA3-bundet achromatopsi25, MERTK-associeret retinitis pigmentosa26, choroideræmi 27,28,29,30 har vist sig at være en effektiv tilgang. Direkte injektion af celler i nærheden af det beskadigede område forbedrer i høj grad chancen for celleafvikling i det passende område, synaptisk integration og eventuel visuel forbedring.
Selvom subretinal injektion i humane og storøjede modeller (dvs. svin 32,33,34,35, kanin 36,37,38,39,40 og ikke-menneskelig primat 41,42,43) er blevet etableret, er en sådan injektion i murinmodellen stadig udfordrende på grund af begrænsningen af øjeæblestørrelsen og den enorme linse, der optager museøjet 44,45,46. Imidlertid er genetisk modificerede modeller kun let tilgængelige i små dyr og ikke i store dyr (dvs. kaniner og ikke-menneskelige primater), og derfor henleder subretinal injektion i mus opmærksomheden på at undersøge nye terapeutiske tilgange til retinale genetiske lidelser. Tre hovedmetoder bruges til at levere celler eller AAV'er ind i det subretinale rum, nemlig den trans-hornhindevej, trans-scleral rute og pars plana-ruten (se figur 2). Transhornhinde og transsklerale veje er forbundet med dannelse af grå stær, synekkier, choroidal blødning og tilbagesvaling fra injektionsstedet 11,44,45,47,48,49. Vi vedtog pars plana-tilgangen som en direkte visualisering af injektionsprocessen, og injektionsstedet kan opnås i realtid under mikroskopet.
Vi beskrev for nylig en metode, der kan differentiere humane embryonale stamceller (hESC'er) til fotoreceptorforfædre under xenofree, kemisk definerede betingelser ved hjælp af rekombinant human retina-specifik lamininisoform LN523. Da LN523 viste sig at være til stede i nethinden, antog vi, at den ekstracellulære matrixniche i den menneskelige nethinde kunne rekapituleres in vitro og derved understøtte fotoreceptordifferentiering fra hESC'erne36. Enkeltcelle transkriptomisk analyse viste, at fotoreceptorprogenitorer, der co-udtrykker keglestang, homeobox og recoverin, blev genereret efter 32 dage. En retinal degeneration 10 (rd10) mutant musemodel, der efterligner autosomal human retinitis pigmentosa, blev brugt til at evaluere effekten af dag 32 hESC-afledte fotoreceptorforfædre in vivo. De hESC-afledte fotoreceptorstamceller blev injiceret i det subretinale rum hos rd10-mus ved P20, hvor fotoceptordysfunktion og degeneration er i gang36. Her beskriver vi en detaljeret protokol til fremstilling af de postkryopræserverede hESC-afledte fotoreceptorforfædre og levering til det sub-retinale rum hos rd10-mus . Denne metode kan også bruges til at administrere AAV'er, cellesuspensioner, peptider eller kemikalier i det subretinale rum hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo-forsøgene blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne og protokollen godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) og Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for brug af dyr i oftalmisk og synsforskning. Ungerne blev immunsupprimeret fra P17 (prætransplantation) til P30 (efter transplantation) ved at fodre dem med drikkevand indeholdende ciclosporin (260 g/l).
1. Forberedelse af dag 32 hESC-afledte fotoreceptorprogenitorer efter kryopræservering
- Forvarmt fotoreceptordifferentieringsmedium (PRDM) i et 37 °C vandbad.
- Der hentes en kryovial indeholdende dag 32 hESC-afledte fotoreceptorstamceller fra flydende nitrogen. Opbevares på tøris.
- Kryovialen optøs ved 37 °C i vandbad i 3-5 min. Resuspender dag 32 celler i 1 ml PRDM og centrifuger ved 130 x g i 4 min.
- Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i 1 ml PRDM.
- 10 μL af blandingen fjernes til celletælling. Bland celler ved hjælp af 0,2% trypanblå i henhold til producentens anvisninger. Pipettecelleblanding ind i celletællekammerets dias. Bestem cellenummer og levedygtighed ved automatiseret celletæller.
- Fortsæt til næste trin, når cellelevedygtigheden er over 70%. Den resterende cellesuspension centrifugeres ved 130 x g i 4 min. Supernatanten fjernes og cellepellet resuspenderes i PRDM i en koncentration på 3 x 105 celler/μl til transplantation.
- Hold øje med synlige celleklumper. Resuspender celleklumper gentagne gange ved hjælp af en 10 μL pipettespids i mikrofugerøret, indtil der ikke observeres nogen synlig celleklump. Læg i 33G injektionssprøjten for at observere ekstrudering af celleopløsningen gennem nålen.
2. Sub-retinal levering af hESC'erne i rd10-mus
- Tilberedning af dyrene
- Bedøv musen (P20, han/hun, 3-6 g) ved hjælp af en kombination af ketamin (20 mg/kg legemsvægt) og xylazin (2 mg/kg legemsvægt) i en 1 ml tuberkulinsprøjte, der er fastgjort til en 27G kanyle ved intraperitoneal tilgang. Administrer en subkutan injektion af buprenorphin (0,05 mg/kg) til mus som forebyggende smertestillende middel.
- Efter administration af anæstesien indlægges en dråbe hver på 1% tropamid og 2,5% phenylephrin til pupiludvidelse. Påfør en oftalmisk gel på hornhinden for at forhindre øjet i tørhed og anæstesirelateret grå stær.
- Placer musen i et tomt bur, indtil det er fuldt bedøvet. Vurder det korrekte bedøvelsesniveau ved at klemme potepuden og bekræft, om dyret ikke reagerer på den hårde knivspids.
- Når musen er fuldt bedøvet, anbringes dyret på en varm pude, der er indstillet til 38 °C.
- Sub-retinal levering af cellerne
- For at bruge en 1-port trans-vitreal pars plana tilgang, som gjort her, skal du udføre sub-retinal injektion i et sterilt miljø. Brug et opretstående operationsmikroskop med en direkte lysvej til at udføre injektionen.
- Klargør 10 μL glassprøjten ved at fjerne kanylenavet. Monter den 33G stumpe kanyle på glassprøjten. Tag metalnavdækslet og fastgør forsigtigt kanylen på sprøjten.
- Skyl med destilleret vand for at kontrollere, om der er tegn på lækage og kanylens tålmodighed. Tøm sprøjten og læg den forsigtigt ved siden.
- Placer den bedøvede mus på en pude, hvor behandlingsøjet ser direkte op til mikroskopets mål. Påfør 0,5% proparacainhydrochlorid og vent i 30 s. Påfør 150 μL oftalmisk gel på øjet og læg et rundt dæksel på det.
- Udfør en grov undersøgelse af øjet ved at observere hornhinden, iris, pupil, linse og bindehinde. Gennem eleven visualiseres fundus i museøjet ved at justere brændplanet. Juster hovedet, indtil synshovedet er placeret i midten af pupillen, og minimer hovedets bevægelse ved korrekt placering på puden.
- Bank let på bunden af røret med hESC'erne flere gange for at få en ensartet cellesuspension. Ved at bruge 10 μL mikroliter glassprøjten med en 33G stump kanyle, trækkes 2 μL celler/medier ud. Træk cellerne ud lige før injektionen for at undgå, at cellerne sætter sig/klumper sig sammen i sprøjten.
- Brug en 30G engangsnål til at lave et sclerektomisår 2 mm bag limbussen. Hold nålens vinkel på ~45° for at undgå at røre linsen. Når spidsen af nålen er visualiseret i øjet, trækkes nålen forsigtigt ud. Kassér kanylen i den skarpe beholder efter brug for at undgå skader på nålestikken.
- Tag glassprøjten og indsæt den stumpe nål i sclerektomisåret. Uden at røre linsen skal du føre den stumpe nål frem, indtil den når den modsatte nethinden af indgangssåret. Sørg for, at injektionsområdet er fri for større retinale blodkar for at undgå blødning.
- Træng forsigtigt ind i nethinden, indtil der ses en trykgren på scleraen. Hold den stumpe ende af nålen parallelt med sclera for at undgå lækage af cellerne i glaslegemet.
- Injicer langsomt 2 μL cellesuspension eller PRDM-medier (kontrol) i det subretinale rum, mens sprøjten trykkes forsigtigt. Efter en vellykket injektion skal der dannes en synlig bleb (dvs. hævet nethinde med cellesuspensionen/mediet i) på injektionsstedet.
BEMÆRK: Der må kun anvendes et let tryk under injektionen for at undgå nethinden rive og blokere cellerne ved nålespidsen. - Når du har bekræftet bleben, skal du vente i 10 s for at lade cellerne slå sig ned. Træk forsigtigt nålen tilbage fra øjet.
- Intraoperativ optisk kohærenstomografi (OCT) scanning af bleb (valgfrit)
- Placer museøjet for at visualisere bleb under mikroskopet ved langsomt at bevæge hovedet. Fastgør positionen ved forsigtigt at holde hovedet. Ingen yderligere pupiludvidelse er nødvendig. Fjern ikke dækslet og gelen på øjet. Det giver et klart optisk medie til at visualisere bleb.
- Udfør den intraoperative OCT ved hjælp af driftsmikroskopets indbyggede iOCT-funktion.
- Tryk på Cube-indstillingen på OCT-skærmen, og placer scanningsområdet på bleben ved at trykke på pileknapperne . Juster OCT ved at glide Centrering og Focus for den bedste OCT-kvalitet. Tryk på Capture/Scan for at hente OCT-scanningen af bleb-området. Gennemgå billederne for at kontrollere kvaliteten af scanningerne.
- Opsving
- Fjern dækslet slip og rengør gelen fra øjet med gasbind. Påfør antibiotisk salve en gang efter injektionen for at forhindre infektion.
- Lad dyret komme sig efter anæstesi under varmt lys, indtil de genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggepladsen og vende tilbage til hjemmeburet. Overvåg dyret i mindst 3 dage efter injektionen for tegn på betændelse, infektion og angst.
BEMÆRK: Det varme lys på 150 W skal være mindst 30 cm væk fra dyreburet, og der skal udvises forsigtighed for at undgå brandskader. - Administrer en subkutan injektion af buprenorphin (0,05 mg/kg) 8 timer i 1 dag eller efter dyrlægens anbefaling. Hvis der observeres betændelse eller infektion i øjet, skal du kontakte en dyrlæge for passende behandling.
- Rengøring og sterilisering af instrumenterne
- Skyl 10 μL mikroliter glassprøjten og 33G stump kanylen med 100% ethanol 10x. Vask ethanolen væk ved at blinke sprøjten med destilleret vand.
- Dissemble glassprøjten og nålen. Tør sprøjten til opbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 μL glassprøjten blev samlet i overensstemmelse med producentens anvisninger (figur 1), og den stumpe kanyle, der blev brugt til at indgive cellesuspensionen/mediet, er vist i figur 1B. Forskellige tilgange til subretinal injektion er illustreret i figur 2. Vi beskriver pars plana-tilgangen i denne protokol (figur 2C). Den stumpe nål monteret på en glassprøjte blev indsat gennem et sklerotomisår og fik adgang til det sub-retinale rum over hele kloden. Som vist i figur 3A blev nålens bane, penetration gennem nethinden og levering af cellerne overvåget direkte under mikroskopet, når injektionen blev udført. Vellykket indgivelse af cellerne/medierne blev bekræftet ved at observere en blødning på injektionsstedet (figur 3B). En vellykket bleb kan identificeres som en lys hvidlig farve, der ligner en vandballon. En mislykket indgivelse observeres ved lækage af cellerne/medierne i glaslegemet på injektionsstedet og manglende dannelse af en bleb. OCT-scanningen blev udført på det injicerede område, og scanningen viste flydende individualiserede hESC'er i det cellebehandlede øje (figur 4A), mens det mediebehandlede øje viste klar væske uden celler i det subretinale rum (figur 4B). De individualiserede hESC'er identificeres som hyperreflekterende materialer fordelt i det subretinale rum (figur 4A). Succesraten for injektionen blev beregnet ved at bemærke antallet af øjne med vellykket dannelse af bleb. Vi inkluderede de applikationer, der anvendte denne tilgang i vores laboratorium, og succesraten for injektionerne (tabel 1).
Figur 1: Instrumenter, der anvendes under injektionen. (A) 10 μL glassprøjten er monteret med en 33G stump kanyle. (B) Zoom-in billede af 33G stump nål. C) Pude, som dyrets hoved kan hvile på. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Forskellige veje til subretinal injektion. (A) Transhornhindevej: Injektionsnålen passerer gennem hornhinden og pupillen for at komme ind i det subretinale rum. (B) Trans-scleral rute: Det sub-retinale rum er direkte tilgængeligt gennem sclera. C) Pars plana-vej: Injektionsnålen indsættes i glaslegemet via et snit i limbussen. Nålen når det sub-retinale rum ved at trænge ind i nethinden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fundusbilleder af øjet under subretinal injektion. (A) Før subretinal injektion blev udført, kunne spidsen af nålen ses i glaslegemet, der rører nethinden, og undgå de store retinale blodkar. (B) Efter subretinal injektion blev der dannet en synlig blødning på injektionsstedet (gul stiplet linje). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Intraoperative OCT-scanninger af de injicerede øjne. Scanningerne blev udført umiddelbart efter injektionen. A) hESC-behandlede øjne: toppanelet viste OCT-scanningens placering (cyan og lyserøde tværsnitslinjer) på øjet hESC blev observeret i det behandlede øje i det subretinale rum (gul stiplet linje, midterste og nederste paneler). B) Mediebehandlet øje: toppanelet viste OCT-scanningens placering (cyan og lyserøde tværsnitslinjer) på øjet. Klar væske uden celler blev observeret i det subretinale rum i det medieinjicerede øje (gul prikket linje, midterste og nederste paneler). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Programmer | Modtagerstamme | Succesrate |
| AAV | RPE65rd12/J | 80% |
| AAV | C57BL/6 | 95% |
| hESC-afledte stamceller | Rd10-/- | 95% |
Tabel 1: Succesraten for subretinal injektion i forskellige applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinal injektion er blevet anvendt til cellesuspensionstransplantation til behandling af RPE og retinale sygdomme 23,25,26,27,28,31,40. Denne tilgang er yderst vigtig i gnaverundersøgelser, ikke kun for celletransplantation og genterapimetoder, men også for at evaluere nye terapeutiske forbindelser til nethindesygdomme. I øjeblikket bruges tre hovedruter til at levere celler eller AAV'er ind i det sub-retinale rum, dvs. trans-hornhindevej, trans-sclerale og pars plana-ruter.
I den trans-hornhinde tilgang passerer injektionsnålen gennem hornhinden, pupillen og til sidst nethinden for at levere cellerne ind i det sub-retinale rum og danne en vellykket bleb. Fordelen ved den trans-corneale tilgang er evnen til at skabe en fuldstændig retinal løsrivelse i modtageren47. Det kan levere et større antal celler; Imidlertid er langsgående observation for at studere strukturel konformation og celleintegration udfordrende i denne tilgang. Derudover omfatter komplikationer kataraktdannelse, synekkier og uklarhed af hornhinden, hvilket gør de langsgående observationer udfordrende 11,45,47,48. Alternativt bruges den trans-scleral tilgang også til at levere AAV til det sub-retinale rum44,49. Denne fremgangsmåde er nyttig for nyfødte mus og betragtes som sikrere, da det ikke er nødvendigt for nålen at gå gennem det okulære medie. Imidlertid bør choroidal blødning, tilbagesvaling af opløsningen fra injektionsstedet, perforering af nethinden og lækage i glaslegemet ikke ignoreres.
Vi vedtog pars plana-tilgangen for at introducere de hESC-afledte fotoreceptorforfædre i det subretinale rum ved hjælp af en 33G stump nål. I denne fremgangsmåde blev injektionsnålen indsat via snittet i limbusområdet. Nålen blev derefter ført gennem glaslegemet og endelig adgang til sub-retinale rum gennem nethinden. Celleklumper blev ofte observeret og kan blokere leveringen af celler, når der anvendes uegnede nålestørrelser. Resuspension af celler i mikrofugerøret skal udføres omhyggeligt ved hjælp af en 10 μL pipettespids, før den lægges i injektionssprøjten. Vi forsøgte oprindeligt at bruge en 34G-nål, hvor cellernes blokering af nålen ofte blev observeret. En passende størrelse af nålen bør testes for specifikke celletyper, især nåle med smal boring har tendens til at give mindre levedygtige celler, når de injiceres50. En af fordelene ved denne tilgang er direkte visualisering under injektion, så kirurgen kan overvåge og omhyggeligt vælge det specifikke sted for cellelevering. Injektionsområdet og nålen skal være tydeligt synlige under proceduren. Anæstesi-induceret grå stær og hornhinde opacitet kan i høj grad påvirke den korrekte levering af celler til et bestemt sted.
Under injektionen skal nålen trænge vinkelret ind i nethinden, og den stumpe ende af nålen skal være parallel med sclera for at minimere lækagen af de injicerede celler i glaslegemet (figur 3). Der må kun trykkes let på sprøjten, når injektionen udføres. Et stærkt tryk kan føre til nethinden tårer, blødning, lækage af cellerne i det choroidale rum, manglende celler til at passere gennem nålen og punktering af øjeæblet. Det optimale tryk kan sikres, når nålespidsen lige er passeret gennem nethinden, og der ses en lille hvid trykprik ved nålespidsen. Efter injektionen skal nålen trækkes langsomt og forsigtigt tilbage fra injektionsstedet for at forhindre lækage af injicerede celler i glaslegemet.
Begrænsningen ved denne tilgang er den udfordrende indlæringskurve. En undersøgelse viste, at en uddannet øjenlæge havde brug for at udføre 364 injektioner i mus for at opnå en succesrate på 95%, mens mindre erfarne praktikanter med kirurgisk erfaring forventedes at kræve et højere antal træninger46. Komplikationer af denne fremgangsmåde omfatter nålespor i nethinden, tilbagesvaling af celler i glaslegemet, blødning fra choroid / nethinden og iatrogen grå stær. Men med en tilstrækkelig mængde træning observeres disse komplikationer signifikant mindre46.
Afslutningsvis kan vores metode levere de hESC-afledte fotoreceptorforfædre ind i det subretinale rum hos rd10-mus , som det tydeligt fremgår af OCT-scanningerne. Denne tilgang kan anvendes til at udforske nye terapeutiske forbindelser, transplantation af forskellige celletyper og genterapi til behandling af ydre nethinden og RPE-relaterede sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hwee Goon Tay er medstifter af Alder Therapeutics AB. Andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee og Yingying Chung for at yde teknisk assistance til forberedelsen af dag 32 hESC-afledte fotoreceptorforfædre efter kryopræservering. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC / OFYIRG / 0042 / 2017) og National Research Foundation 24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) til HGT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
