Summary
동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
인간 만능 줄기세포를 이용한 광수용체 세포의 재생은 진행된 단계의 유전성 및 노화 망막 질환 치료에 유망한 치료법입니다. 우리는 인간 재조합 망막 특이적 라미닌 동형 매트릭스가 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 광수용체 전구세포로의 분화를 지원할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 이들 세포의 망막하 주사는 rd10 설치류 및 토끼 모델에서도 부분적인 회복을 보여주었다. 망막하 주사는 표적 공간과의 근접성으로 인해 눈의 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE)층에 제약 화합물을 전달하는 데 사용되는 확립된 방법으로 알려져 있습니다. 또한 망막 질환을 치료하기 위해 아데노 관련 바이러스 벡터를 망막 하 공간으로 전달하는 데 사용되었습니다. 쥐 모델에서 제약 화합물 및 세포의 망막하 전달은 쥐 안구 크기의 제약으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜은 유전성 망막염 색소성 돌연변이, rd10 마우스에서 주입을 위한 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조와 이들 세포의 망막하 전달 기술에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이 접근법은 표적 부위, 특히 광수용체 변성으로 이어지는 질병이 발생하는 망막의 외부 핵층에 대한 세포 치료를 가능하게 합니다.
Introduction
유전성 망막 질환과 노화 관련 황반 변성은 광수용체 세포 손실과 결국 실명으로 이어집니다. 망막 광수용체(retinal photoreceptor)는 광전달(즉, 빛을 신경 신호로 변환)을 담당하는 특수 세포로 구성된 망막의 바깥쪽 분절 층입니다. 간상체와 원추세포 광수용체 세포는 망막 색소층(RPE)에 인접해 있습니다1. 세포 손실을 보상하기 위한 광수용체 세포 대체 요법은 새롭게 발전하고 있는 치료 접근법입니다. 손상된 광수용체 세포를 복원하기 위해 배아 줄기 세포(ESC)2,3,4, 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 RPE 세포 및 망막 전구 세포(RPC)4,5,6,7,8을 사용했습니다. 망막과 RPE 사이의 제한된 공간인 망막하 공간은 손상된 광수용체 세포, RPE 및 Mueller 세포를 대체하기 위해 이러한 세포를 증착하기에 매력적인 위치입니다 9,10,11.
유전자 및 세포 치료제는 전임상 연구에서 다양한 망막 질환에 대한 재생 의학을 위해 망막 하부 공간을 활용하고 있습니다. 여기에는 안티-센스 올리고뉴클레오티드 요법(anti-sense oligonucleotide therapy)12,13 또는 CRISPR/Cas9 또는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 기반 전략(14,15,16)을 통한 염기 편집(base editing)의 형태로 유전자 또는 유전자 편집 도구의 기능적 사본 전달(functional copy)의 전달이 포함되며, 물질(예: RPE 시트, 망막 보철물 17,18,19) 및 분화된 줄기세포 유래 망막 오가노이드(differentiated stem-cell-derived retinal organoid)20,21,22 망막 및 RPE 관련 질환을 치료합니다. RPE65 관련 Leber 선천성 무뇨증(LCA)23,24, CNGA3 관련 색소 침착증25, MERTK 관련 색소성 망막염26, 맥락막혈증 27,28,29,30을 치료하기 위해 망막하 공간에서 hESC-RPE 31을 사용한 임상 시험 효과적인 접근 방식임이 입증되었습니다. 손상된 부위 부근에 세포를 직접 주입하면 해당 부위에 세포가 정착하고 시냅스가 통합되며 궁극적으로 시력이 개선될 가능성이 크게 향상됩니다.
인간 및 큰 눈을 가진 모델(즉, 돼지 32,33,34,35, 토끼 36,37,38,39,40 및 비인간 영장류 41,42,43)에서 망막하 주사가 확립되었지만, 쥐 모델에서의 이러한 주입은 안구 크기의 제약과 거대함으로 인해 여전히 어렵습니다 마우스 눈(44,45,46)을 차지하는 렌즈. 그러나 유전자 변형 모델은 작은 동물에서만 쉽게 사용할 수 있고 큰 동물(즉, 토끼 및 인간이 아닌 영장류)에서는 쉽게 사용할 수 없기 때문에 마우스의 망막하 주사는 망막 유전 질환에 대한 새로운 치료 접근법을 조사하는 데 주목을 받고 있습니다. 세포 또는 AAV를 망막하 공간으로 전달하기 위해 세 가지 주요 접근 방식, 즉 각막 횡단 경로, 공막 횡단 경로 및 파스 플라나 경로가 사용됩니다(그림 2 참조). 경각막 및 경공막 경로는 백내장 형성, synechiae, 맥락막 출혈 및 주사 부위의 역류와 관련이 있습니다 11,44,45,47,48,49. 우리는 주입 공정의 직접적인 시각화로 pars plana 접근 방식을 채택했으며 현미경으로 실시간으로 주입 부위를 얻을 수 있습니다.
우리는 최근 재조합 인간 망막 특이적 라미닌 동형 LN523을 사용하여 화학적으로 정의된 이종 없는 조건에서 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 광수용체 전구세포로 분화할 수 있는 방법을 설명했습니다. LN523이 망막에 존재하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 우리는 인간 망막의 세포외 기질 틈새가 시험관 내에서 재현될 수 있고, 따라서 hESCs로부터 광수용체 분화를 지원할 수 있다는 가설을 세웠다36. 단세포 전사체 분석 결과, 32일 후 cone-rod homeobox와 recoverin을 함께 발현하는 광수용체 전구세포가 생성되었습니다. 상염색체 인간 색소성 망막염을 모방한 망막 변성 10(rd10) 돌연변이 마우스 모델을 사용하여 생체 내 32 hESC 유래 광수용체 전구체의 효능을 평가했습니다. hESC 유래 광수용체 전구세포를 광수용체 기능 장애 및 퇴화가 진행 중인 P20에서 rd10 마우스의 망막하 공간에 주입하였다36. 여기에서는 동결 후 보존된 hESC 유래 광수용체 전구체의 준비 및 rd10 마우스의 망막하 공간으로의 전달을 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 또한 마우스의 망막하 공간에 AAV, 세포 현탁액, 펩타이드 또는 화학물질을 투여하는 데 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
생체 내 실험은 SingHealth의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 지침과 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 새끼들은 사이클로스포린(260g/L)이 함유된 식수를 먹여 P17(이식 전)에서 P30(이식 후)까지 면역 억제되었습니다.
1. 동결 보존 후 Day 32 hESC 유래 광수용체 전구체의 제조
- 37°C 수조에서 미리 데워진 광수용체 분화 배지(PRDM).
- 액체 질소에서 32일 hESC 유래 광수용체 전구 세포를 포함하는 냉동 수소를 회수합니다. 드라이 아이스에 보관하십시오.
- 37°C의 수조에서 3-5분 동안 냉동을 해동합니다. 1mL의 PRDM에 32개의 세포를 재현탁시키고 130 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 PRDM 1mL에 세포를 재현탁시킵니다.
- 세포 계수를 위해 혼합물 10μL를 제거합니다. 제조업체의 지침에 따라 0.2% 트리판 블루를 사용하여 셀을 혼합합니다. 피펫 셀 혼합물을 세포 계수 챔버 슬라이드에 넣습니다. 자동화된 세포 계수기로 세포 수와 생존율을 측정합니다.
- 세포 생존율이 70% 이상이면 다음 단계로 진행합니다. 나머지 셀 현탁액을 130 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 이식을 위해 3 x 105 cells/μL의 농도로 PRDM에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 눈에 보이는 세포 덩어리를 관찰하십시오. 눈에 보이는 세포 덩어리가 관찰되지 않을 때까지 마이크로퓨지 튜브에 10μL 피펫 팁을 사용하여 세포 덩어리를 반복적으로 재현탁합니다. 33G 주입 주사기에 로드하여 바늘을 통한 세포 용액의 압출을 관찰합니다.
2. rd10 마우스에서 hESC의 망막하 전달
- 동물의 준비
- 복강 내 접근법으로 27G 바늘에 부착된 1mL 투베르쿨린 주사기에 케타민(체중 20mg/kg)과 자일라진(체중 2mg/kg)의 조합을 사용하여 마우스(P20, 수/암, 3-6g)를 마취합니다. 선제적 진통제로 마우스에 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 피하 주사합니다.
- 마취제를 투여한 후 동공 확장을 위해 1% 트로피카미드와 2.5% 페닐에프린을 각각 한 방울씩 주입합니다. 안과 젤을 각막에 바르면 안구건조증과 마취 관련 백내장을 예방할 수 있습니다.
- 완전히 마취될 때까지 쥐를 빈 케이지에 넣습니다. 발 패드를 꼬집어 적절한 마취 수준을 평가하고 동물이 세게 꼬집어도 반응하지 않는지 확인합니다.
- 쥐가 완전히 마취되면 동물을 38°C로 설정된 따뜻한 패드에 놓습니다.
- 세포의 망막하 전달
- 1포트 유리체 경유 파스 플라나 접근법을 사용하려면 여기에서 수행한 것처럼 무균 환경에서 망막하 주사를 수행합니다. 주입을 수행하기 위해 직사광선 경로가 있는 정립 작동 현미경을 사용하십시오.
- 니들 허브를 제거하여 10μL 유리 주사기를 준비합니다. 33G 뭉툭한 바늘을 유리 주사기에 장착합니다. 금속 허브 커버를 잡고 바늘을 주사기에 조심스럽게 고정합니다.
- 증류수로 씻어내어 바늘의 누출 및 개통의 징후가 있는지 확인합니다. 주사기를 비우고 조심스럽게 옆에 놓습니다.
- 마취된 쥐를 베개 위에 놓고 치료 눈이 현미경의 대물렌즈를 똑바로 올려다봅니다. 0.5% 프로파라카인 염산염을 바르고 30초 동안 기다립니다. 150μL의 안과 젤을 눈에 바르고 그 위에 둥근 커버 슬립을 놓습니다.
- 각막, 홍채, 동공, 수정체, 결막을 관찰하여 눈을 대략적으로 검사합니다. 동공을 통해 초점면을 조정하여 쥐 눈의 안저를 시각화합니다. 시신경 헤드가 동공 중앙에 위치할 때까지 헤드를 조정하고 베개에 적절한 위치를 지정하여 헤드의 움직임을 최소화합니다.
- hESC가 있는 튜브 바닥을 여러 번 부드럽게 두드려 균일한 세포 현탁액을 얻습니다. 33G의 뭉툭한 바늘이 있는 10μL 유리 마이크로리터 주사기를 사용하여 2μL의 세포/배지를 빼냅니다. 주사기에 세포 침전/뭉침을 방지하기 위해 주사 직전에 세포를 빼냅니다.
- 30G 일회용 바늘을 사용하여 변두리 뒤쪽 2mm에 절제술 상처를 만듭니다. 렌즈를 만지지 않도록 바늘의 각도를 ~45°로 유지하십시오. 바늘 끝이 눈에 보이면 바늘을 부드럽게 빼냅니다. 바늘 찔림 부상을 방지하기 위해 사용 후에는 바늘을 날카로운 통에 버리십시오.
- 유리 주사기를 가지고 뭉툭한 바늘을 절제술 상처에 삽입합니다. 수정체를 만지지 않고 뭉툭한 바늘이 상처의 반대쪽 망막에 도달할 때까지 전진시킵니다. 출혈을 방지하기 위해 주사 부위에 주요 망막 혈관이 없는지 확인하십시오.
- 공막의 압력 가지가 보일 때까지 망막을 부드럽게 관통합니다. 바늘의 뭉툭한 끝을 공막과 평행하게 유지하여 세포가 유리체 공간으로 누출되는 것을 방지합니다.
- 주사기에 부드러운 압력이 유지되는 동안 2μL의 세포 현탁액 또는 PRDM 배지(대조군)를 망막하 공간에 천천히 주입합니다. 주사가 성공하면 주사 부위에 눈에 보이는 블레브(즉, 세포 현탁액/배지가 있는 융기된 망막)가 형성되어야 합니다.
알림: 주사 중에는 망막이 찢어지거나 바늘 끝의 세포가 막히지 않도록 부드러운 압력만 사용해야 합니다. - 블렙을 확인한 후 세포가 가라앉을 때까지 10초 동안 기다립니다. 눈에서 바늘을 부드럽게 빼냅니다.
- 블렙의 수술 중 광간섭 단층촬영(OCT) 스캔(옵션)
- 마우스 눈을 배치하여 머리를 천천히 움직여 현미경 아래에서 블레브를 시각화합니다. 헤드를 부드럽게 잡아 위치를 고정합니다. 추가적인 동공 확장이 필요하지 않습니다. 커버 슬립과 눈에 있는 젤을 제거하지 마십시오. 블렙을 시각화하기 위해 투명한 광학 매체를 제공합니다.
- 작동 현미경에 내장된 iOCT 기능을 사용하여 수술 중 OCT를 수행합니다.
- OCT 화면에서 Cube 옵션을 누르고 화살표 버튼을 눌러 블렙에 스캔 영역을 배치합니다. 최상의 OCT 품질을 위해 Centering 및 Focus 를 슬라이딩하여 OCT를 조정합니다. Capture/Scan 을 눌러 블렙 영역의 OCT 스캔을 획득합니다. 이미지를 검토하여 스캔 품질을 확인합니다.
- 복구
- 커버 슬립을 제거하고 거즈로 눈에서 젤을 닦아냅니다. 감염을 예방하기 위해 주사 후 항생제 연고를 한 번 바르십시오.
- 동물이 흉골 누움을 유지하고 홈 케이지로 돌아갈 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 따뜻한 조명 아래에서 마취에서 회복되도록 합니다. 주사 후 최소 3일 동안 염증, 감염 및 고통의 징후가 있는지 동물을 모니터링하십시오.
알림: 150W의 따뜻한 조명은 동물 케이지에서 최소 30cm 떨어져 있어야 하며 화상을 입지 않도록 주의해야 합니다. - 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 1일 동안 매시간 8회 또는 수의사의 권고에 따라 피하 주사합니다. 눈에 염증이나 감염이 관찰되면 적절한 치료를 위해 수의사와 상담하십시오.
- 기구 세척 및 멸균
- 10μL 유리 마이크로리터 주사기와 33G 뭉툭한 바늘을 100% 에탄올 10배로 플러시합니다. 주사기를 증류수로 플래시하여 에탄올을 씻어냅니다.
- 유리 주사기와 바늘을 분해합니다. 보관을 위해 주사기를 건조시킵니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10μL 유리 주사기는 제조업체의 지침(그림 1)에 따라 조립되었으며, 셀 현탁액/배지를 전달하는 데 사용된 뭉툭한 바늘은 그림 1B에 나와 있습니다. 망막하 주사에 대한 다양한 접근법이 그림 2에 나와 있습니다. 이 프로토콜에서 pars plana 접근 방식을 설명합니다(그림 2C). 유리 주사기에 장착된 뭉툭한 바늘은 경화술 상처를 통해 삽입되어 전 세계의 망막 하 공간에 접근했습니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 주사 바늘의 궤적, 망막을 통한 침투 및 세포의 전달은 주입을 수행할 때 현미경 아래에서 직접 모니터링되었습니다. 세포/배지의 성공적인 전달은 주입 부위의 블레브를 관찰하여 확인되었습니다(그림 3B). 성공적인 블렙은 물풍선을 닮은 밝은 희끄무레한 색으로 식별할 수 있습니다. 전달 실패는 세포/배지가 주사 부위의 유리체 공간으로 누출되고 기포를 형성하지 못하여 관찰됩니다. OCT 스캔은 주입된 부위에 대해 수행되었으며, 스캔 결과 세포를 처리한 눈에는 떠다니는 개별화된 hESC가 나타났고(그림 4A), 매체를 처리한 눈에서는 망막하 공간에 세포가 없는 투명한 액체가 나타났습니다(그림 4B). 개별화된 hESC는 망막 하부 공간에 분포된 과반사 물질로 식별됩니다(그림 4A). 주사의 성공률은 안검이 성공적으로 형성된 눈의 수를 기록하여 계산되었습니다. 우리 실험실에서 이 접근법을 채택한 응용 프로그램과 주사 성공률을 포함했습니다(표 1).
그림 1: 주입 중에 사용되는 기구. (A) 10μL 유리 주사기에는 33G 뭉툭한 바늘이 장착되어 있습니다. (B) 33G 뭉툭한 바늘의 확대 사진. (C) 동물의 머리를 쉴 수 있는 베개. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 망막하 주사의 다양한 경로. (A) 경각막 경로: 주사 바늘은 각막과 동공을 통과하여 망막하 공간으로 들어갑니다. (B) 공막 경 경로: 망막하 공간은 공막을 통해 직접 접근합니다. (C) Pars plana route: 주사 바늘은 림버스의 절개를 통해 유리체 공간에 삽입됩니다. 바늘은 망막을 관통하여 망막하 공간에 도달합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 망막하 주사 중 눈의 안저 이미지. (A) 망막하 주사를 시행하기 전에는 망막에 닿는 유리체 공간에서 바늘 끝이 주요 망막 혈관을 피하는 것을 볼 수 있었습니다. (B) 망막하 주사 후 주사 부위에 눈에 보이는 기미가 형성되었습니다(노란색 점선). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 주입된 눈의 수술 중 OCT 스캔. 스캔은 주사 직후에 수행되었습니다. (A) hESC를 처리한 눈: 상단 패널은 눈의 OCT 스캔(청록색 및 분홍색 단면선)의 위치를 보여주었습니다. hESC는 망막하 공간(노란색 점선, 중간 및 하단 패널)의 치료된 눈에서 관찰되었습니다. (B) 매체 처리된 눈: 상단 패널은 눈의 OCT 스캔 위치(청록색 및 분홍색 단면선)를 보여주었습니다. 세포가 없는 맑은 액체는 매체 주입 눈의 망막하 공간(노란색 점선, 중간 및 하단 패널)에서 관찰되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 응용 프로그램 | 수신자 변형률 | 성공률 |
| AAV (아에이브) | RPE65RD12/J | 80% |
| AAV (아에이브) | 재질 보기 C57BL/6 JIS | 95% |
| hESC 유래 전구세포 | RD10-/- | 95% |
표 1: 다양한 응용 분야에서의 망막하 주사 성공률.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
망막하 주사는 RPE 및 망막 질환 23,25,26,27,28,31,40을 치료하기 위한 세포 현탁 이식에 사용되어 왔다. 이 접근법은 세포 이식 및 유전자 치료 접근법뿐만 아니라 망막 질환에 대한 새로운 치료 화합물을 평가하는 설치류 연구에서도 매우 중요합니다. 현재 망막하 공간으로 세포 또는 AAV를 전달하기 위해 세 가지 주요 경로, 즉 각막 횡단 경로, 경막 경로 및 pars plana 경로가 사용되고 있습니다.
경각막 접근법에서 주사 바늘은 각막, 동공, 마지막으로 망막을 통과하여 세포를 망막 하부 공간으로 전달하고 성공적인 블레브를 형성합니다. 경각막 접근법의 장점은 수용자(47)에서 완전한 망막 박리를 생성할 수 있는 능력이다. 더 많은 수의 세포를 전달할 수 있습니다. 그러나 구조적 형태 및 세포 통합을 연구하기 위한 종단 관찰은 이 접근 방식에서 어렵습니다. 또한 합병증으로는 백내장 형성, 좌음, 각막 혼탁 등이 있어 종단적 관찰이 11,45,47,48에 도전합니다. 대안적으로, 경공막 접근법은 또한 AAV를 망막하 공간(44,49)으로 전달하는데 사용된다. 이 접근법은 신생아 마우스에 유용하며 바늘이 안구 매체를 통과할 필요가 없기 때문에 더 안전한 것으로 간주됩니다. 그러나 맥락막 출혈, 주사 부위에서 용액의 역류, 망막 천공 및 유리체 공간으로의 누출을 무시해서는 안 됩니다.
우리는 33G 뭉툭한 바늘을 사용하여 hESC 유래 광수용체 전구체를 망막하 공간에 도입하기 위해 pars plana 접근법을 채택했습니다. 이 접근법에서는 사각 부위의 절개를 통해 주사 바늘을 삽입했습니다. 그런 다음 바늘은 유리체를 통과하여 마지막으로 망막을 통해 망막하 공간에 접근했습니다. 세포 덩어리가 종종 관찰되었으며 부적절한 바늘 크기를 사용할 때 세포 전달을 차단할 수 있습니다. 마이크로분리 튜브의 세포 재현탁은 주사기에 넣기 전에 10μL 피펫 팁을 사용하여 부지런히 수행해야 합니다. 처음에는 34G 바늘을 사용하려고 시도했는데, 세포에 의한 바늘 막힘이 자주 관찰되었습니다. 특정 세포 유형에 대해 적절한 크기의 바늘을 테스트해야 하며, 특히 구멍이 좁은 바늘은 주입 시 생존 가능한 세포가 감소하는 경향이 있습니다50. 이 접근법의 장점 중 하나는 주사 중 직접 시각화하여 외과의가 세포 전달을 위한 특정 위치를 모니터링하고 신중하게 선택할 수 있다는 것입니다. 시술 중에는 주사 부위와 바늘이 선명하게 보여야 합니다. 마취로 인한 백내장과 각막 혼탁은 세포가 특정 위치로 적절하게 전달되는 데 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
주사를 수행하는 동안 바늘은 망막을 수직으로 관통해야 하며, 주사된 세포가 유리체 공간으로 누출되는 것을 최소화하기 위해 바늘의 뭉툭한 끝이 공막과 평행해야 합니다(그림 3). 주입을 수행할 때 주사기에 부드러운 압력만 가해야 합니다. 강한 압력은 망막 파열, 출혈, 맥락막 공간으로의 세포 누출, 세포가 바늘을 통과하지 못하거나 안구에 구멍이 뚫릴 수 있습니다. 바늘 끝이 망막을 통과했을 때 최적의 압력을 확신할 수 있으며 바늘 끝에 작은 흰색 압력 점이 보입니다. 주입 후에는 주사 부위에서 바늘을 천천히 부드럽게 집어넣어 주입 된 세포가 유리체 공간으로 누출되는 것을 방지해야합니다.
이 접근 방식의 한계는 학습 곡선이 어렵다는 것입니다. 한 연구에 따르면 훈련된 안과 의사는 95%의 성공률을 달성하기 위해 쥐에게 364번의 주사를 수행해야 하는 반면, 수술 경험이 있는 경험이 적은 수련의는 더 많은 수의 훈련이 필요할 것으로 예상됩니다46. 이 접근법의 합병증으로는 망막의 바늘 자국, 유리체 공간으로의 세포 역류, 맥락막/망막의 출혈, 의인성 백내장 등이 있습니다. 그러나 충분한 훈련을 받으면 이러한 합병증은 현저히 덜 관찰된다46.
결론적으로, 우리의 방법은 OCT 스캔에서 분명히 나타난 바와 같이 hESC 유래 광수용체 전구체를 rd10 마우스의 망막하 공간으로 전달할 수 있습니다. 이 접근법은 외막 및 RPE 관련 질병 치료를 위한 새로운 치료 화합물, 다양한 세포 유형 이식 및 유전자 요법을 탐색하는 데 채택될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hwee Goon Tay는 Alder Therapeutics AB의 공동 설립자입니다. 다른 저자는 상충되는 이해관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
동결 보존 후 32 hESC 유래 광수용체 전구체를 준비할 수 있도록 기술적 지원을 제공해 주신 Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee 및 Yingying Chung에게 감사드립니다. 이 연구는 H.G.T.에 대한 National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award(NMRC/OFYIRG/0042/2017) 및 National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant(CRP24-2020-0083)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
