Summary
Описан подробный протокол подготовки посткриоконсервированных клеток-предшественников фоторецепторов hESC и субретинальной доставки этих клеток у мышей rd10 .
Abstract
Регенерация фоторецепторных клеток с помощью плюрипотентных стволовых клеток человека является перспективной терапией для лечения как наследственных, так и возрастных заболеваний сетчатки на поздних стадиях. Мы показали, что человеческий рекомбинантный матрица изоформы ламинина, специфичная для сетчатки, способна поддерживать дифференцировку эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в прогениторы фоторецепторов. Кроме того, субретинальная инъекция этих клеток также показала частичное восстановление на моделях грызунов и кроликов rd10 . Субретинальная инъекция, как известно, является признанным методом, который используется для доставки фармацевтических соединений в фоторецепторные клетки и слой пигментного эпителия сетчатки (RPE) глаза из-за его близости к целевому пространству. Он также используется для доставки аденоассоциированных вирусных векторов в субретинальное пространство для лечения заболеваний сетчатки. Субретинальная доставка фармацевтических соединений и клеток в мышиной модели затруднена из-за ограничений в размере мышиного глазного яблока. В этом протоколе подробно описана процедура подготовки клеток-предшественников фоторецепторов, полученных из hESC, для инъекции и методика субретинальной доставки этих клеток у мышей с мутацией генетического пигментного ретинита, rd10 . Такой подход позволяет проводить клеточную терапию в целевой области, в частности во внешнем ядерном слое сетчатки, где происходят заболевания, приводящие к дегенерации фоторецепторов.
Introduction
Наследственные заболевания сетчатки и возрастная макулярная дегенерация приводят к потере фоторецепторных клеток и, в конечном итоге, к слепоте. Фоторецептор сетчатки представляет собой наружный сегментный слой сетчатки, состоящий из специализированных клеток, ответственных за фототрансдукцию (т.е. преобразование света в нейронные сигналы). Палочковидные и колбочковые фоторецепторные клетки примыкают к пигментному слою сетчатки (РПЭ)1. Заместительная терапия фоторецепторными клетками для компенсации потери клеток является новым и развивающимся терапевтическим подходом. Для восстановления поврежденных фоторецепторных клеток использовали эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)2,3,4, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из РПЭ, и клетки-предшественники сетчатки (РПК)4,5,6,7,8. Субретинальное пространство, ограниченное пространство между сетчаткой и РПЭ, является привлекательным местом для депонирования этих клеток для замены поврежденных фоторецепторных клеток, РПЭ и клеток Мюллера из-за его близости 9,10,11.
Генная и клеточная терапия использует субретинальное пространство для регенеративной медицины при различных заболеваниях сетчатки в доклинических исследованиях. Это включает в себя доставку функциональных копий гена или инструментов редактирования генов в форме антисмысловой олигонуклеотидной терапии12,13 или CRISPR/Cas9 или редактирования оснований с помощью стратегии 14,15,16, основанной на аденоассоциированном вирусе (AAV), имплантацию материалов (например, листа RPE, протезирования сетчатки 17,18,19) и дифференцированных органоидов сетчатки, полученных из стволовых клеток 20,21,22 для лечения заболеваний сетчатки и РПЭ. Клинические исследования с использованием hESC-RPE31 в субретинальном пространстве для лечения врожденного амавроза Лебера, ассоциированного с RPE65 (LCA)23,24, CNGA3-ассоциированной ахроматопсии25, MERTK-ассоциированного пигментного ретинита26, хороидеремии 27,28,29,30 доказали свою эффективность. Прямое введение клеток в окрестности поврежденного участка значительно повышает вероятность заселения клеток в соответствующей области, синаптической интеграции и, в конечном итоге, улучшения зрения.
Несмотря на то, что субретинальная инъекция в моделях человека и большеглазых животных (т.е. свиньи 32,33,34,35, кролика 36,37,38,39,40 и нечеловекообразного примата 41,42,43) была установлена, такая инъекция в мышиной модели все еще является сложной задачей из-за ограниченного размера глазного яблока и огромных размеров линза, занимающая глаз мыши 44,45,46. Тем не менее, генетически модифицированные модели легко доступны только для мелких животных, а не для крупных животных (т.е. кроликов и нечеловекообразных приматов), поэтому субретинальная инъекция мышам привлекает внимание к исследованию новых терапевтических подходов к генетическим заболеваниям сетчатки. Для доставки клеток или AAV в субретинальное пространство используются три основных подхода, а именно трансроговичный путь, транссклеральный путь и pars plana (см. рис. 2). Трансроговичный и транссклеральный пути связаны с образованием катаракты, синехий, хориоидейальных кровотечений и рефлюкса из места инъекции 11,44,45,47,48,49. Мы приняли подход pars plana в качестве прямой визуализации процесса инъекции, и место инъекции может быть достигнуто в режиме реального времени под микроскопом.
Недавно мы описали метод, который может дифференцировать человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) в фоторецепторы-предшественники в ксеносвободных, химически определенных условиях с использованием рекомбинантной изоформы ламинина LN523, специфичной для сетчатки человека. Поскольку было обнаружено, что LN523 присутствует в сетчатке, мы предположили, что ниша внеклеточного матрикса сетчатки человека может быть рекапитулирована in vitro и тем самым поддерживать дифференцировку фоторецепторов от чЭСК36. Одноклеточный транскриптомный анализ показал, что предшественники фоторецепторов, совместно экспрессирующие конусно-палочковый гомеобокс и рекремен, генерировались через 32 дня. Модель мутантной мыши с дегенерацией сетчатки 10 (rd10), которая имитирует пигментный аутосомный ретинит человека, была использована для оценки эффективности фоторецепторов-предшественников in vivo на 32-й день hESC. Клетки-предшественники фоторецепторов, полученные из hESC, были введены в субретинальное пространство мышей rd10 на P20, где продолжается дисфункция и дегенерация фоторецептора36. В данной статье мы опишем подробный протокол подготовки посткриоконсервированных фоторецепторов-предшественников hESC и их доставки в субретинальное пространство мышей rd10 . Этот метод также может быть использован для введения AAV, клеточных суспензий, пептидов или химических веществ в субретинальное пространство у мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты in vivo проводились в соответствии с руководящими принципами и протоколом, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных SingHealth (IACUC) и Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Иммунная супрессия щенков проводилась с P17 (до трансплантации) до P30 (после трансплантации) путем кормления их питьевой водой, содержащей циклоспорин (260 г/л).
1. Подготовка фоторецепторов-предшественников на 32-й день после криоконсервации
- Предварительно нагрейте среду дифференцировки фоторецепторов (PRDM) на водяной бане с температурой 37 °C.
- Извлеките из жидкого азота криовиал, содержащий клетки-предшественники фоторецепторов на 32-й день чЭСК. Хранить на сухом льду.
- Криовиал разморозить при 37 °C на водяной бане в течение 3-5 мин. Ресуспендировать в течение дня 32 клетки в 1 мл PRDM и центрифугировать при 130 х г в течение 4 мин.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл PRDM.
- Удалите 10 мкл смеси для подсчета клеток. Смешайте ячейки, используя 0,2% трипанового синего в соответствии с инструкциями производителя. Смешение ячеек пипетки в предметное стекло счетной камеры. Определите количество и жизнеспособность клеток с помощью автоматического счетчика клеток.
- Переходите к следующему шагу, когда жизнеспособность клетки превысит 70%. Центрифугируйте оставшуюся клеточную суспензию при 130 x g в течение 4 мин. Удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать клеточную гранулу в PRDM в концентрации 3 x 105 клеток/мкл для трансплантации.
- Понаблюдайте за видимыми скоплениями клеток. Ресуспендируйте клеточные сгустки несколько раз с помощью наконечника пипетки объемом 10 мкл в пробирке микрофуги до тех пор, пока не исчезнет видимый клеточный комок. Загрузите в шприц для инъекций 33G для наблюдения за экструзией клеточного раствора через иглу.
2. Субретинальная доставка чЭСК у мышей rd10
- Подготовка животных
- Обезболивайте мышь (P20, самец/самка, 3-6 г) с помощью комбинации кетамина (20 мг/кг массы тела) и ксилазина (2 мг/кг массы тела) в туберкулиновом шприце объемом 1 мл, прикрепленном к игле 27G, внутрибрюшинным доступом. Введите мышам подкожную инъекцию бупренорфина (0,05 мг/кг) в качестве упреждающего анальгетика.
- После введения анестезии закапывают по капле 1% тропикамида и 2,5% фенилэфрина для расширения зрачка. Нанесите офтальмологический гель на роговицу, чтобы предотвратить сухость глаз и катаракту, связанную с анестезией.
- Поместите мышь в пустую клетку до полного обезболивания. Оцените надлежащий уровень анестетика, ущипнув подушечку лапы, и убедитесь, что животное не реагирует на сильное щипку.
- Когда мышь будет полностью обезболина, положите животное на теплую подушку, установленную при температуре 38 °C.
- Субретинальная доставка клеток
- Чтобы использовать 1-портовый трансвитреальный подход pars plana, как это сделано здесь, выполните субретинальную инъекцию в стерильной среде. Для выполнения инъекции используйте вертикальный операционный микроскоп с прямым световым трактом.
- Подготовьте стеклянный шприц объемом 10 мкл, сняв ступицу иглы. Установите тупую иглу 33G на стеклянный шприц. Возьмите металлическую крышку ступицы и аккуратно закрепите иглу на шприце.
- Промойте дистиллированной водой, чтобы проверить наличие признаков утечки и проходимости иглы. Опорожните шприц и осторожно положите его в сторону.
- Положите мышь под наркозом на подушку так, чтобы лечебный глаз смотрел прямо на объектив микроскопа. Нанесите 0,5% пропаракаина гидрохлорид и подождите 30 с. Нанесите 150 мкл офтальмологического геля на глаз и наложите на него круглый покровный листок.
- Выполните грубое обследование глаза, осматривая роговицу, радужную оболочку, зрачок, хрусталик и конъюнктиву. Через зрачок визуализируйте глазное дно мышиного глаза, регулируя фокальную плоскость. Отрегулируйте голову до тех пор, пока оптическая головка не окажется в центре зрачка, и минимизируйте движение головы, правильно расположив ее на подушке.
- Осторожно постучите по дну пробирки с чЭСК несколько раз, чтобы получить однородную клеточную суспензию. Используя стеклянный микролитровый шприц объемом 10 мкл с тупой иглой 33G, извлеките 2 мкл клеток/среды. Извлеките клетки непосредственно перед инъекцией, чтобы избежать осаждения/слипания клеток в шприце.
- С помощью одноразовой иглы 30G сделайте склерэктомическую рану на 2 мм позади лимба. Держите угол иглы ~45°, чтобы не касаться объектива. Как только кончик иглы визуализируется в глазу, осторожно извлеките иглу. Выбросьте иглу в контейнер для острых предметов после использования, чтобы избежать укола иглой.
- Возьмите стеклянный шприц и введите тупую иглу в рану после склерэктомии. Не прикасаясь к хрусталику, продвигайте тупую иглу до тех пор, пока она не достигнет сетчатки, противоположной входной ране. Убедитесь, что в области инъекции нет крупных кровеносных сосудов сетчатки, чтобы избежать кровотечения.
- Осторожно проникните в сетчатку до тех пор, пока не станет видна ответвление на склере. Держите тупой конец иглы параллельно склере, чтобы избежать просачивания клеток в стекловидное тело.
- Медленно введите 2 мкл клеточной суспензии или среды PRDM (контроль) в субретинальное пространство, поддерживая мягкое давление на шприц. При успешной инъекции в месте инъекции должен образоваться видимый пузырь (т.е. приподнятая сетчатка с клеточной суспензией/средой в ней).
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инъекции следует использовать только мягкое давление, чтобы избежать разрыва сетчатки и закупорки клеток на кончике иглы. - После подтверждения блеба подождите 10 с, чтобы клетки успокоились. Аккуратно втяните иглу из ушка.
- Интраоперационная оптическая когерентная томография (ОКТ) (опция)
- Расположите глаз мыши, чтобы визуализировать шарик под микроскопом, медленно двигая головой. Зафиксируйте положение, осторожно удерживая голову. Дополнительное расширение зрачка не требуется. Не снимайте покровное покрытие и гель на глаз. Это дает прозрачную оптическую среду для визуализации пузыря.
- Выполняйте интраоперационную ОКТ с помощью встроенной функции iOCT операционного микроскопа.
- Нажмите кнопку Cube (Куб ) на экране OCT и расположите область сканирования на шарике, нажимая кнопки со стрелками . Отрегулируйте OCT, переместив центрирование и фокусировку для достижения наилучшего качества OCT. Нажмите Capture/Scan , чтобы получить ОКТ-скан области bleb. Просмотрите изображения, чтобы проверить качество сканов.
- Выздоровление
- Снимите покровный листок и очистите глаз гелем с помощью марли. Нанесите мазь с антибиотиком один раз после инъекции, чтобы предотвратить инфицирование.
- Дайте животному прийти в себя после анестезии под теплым светом, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания положения грудины и возвращения в домашнюю клетку. Наблюдайте за животным в течение как минимум 3 дней после инъекции на предмет признаков воспаления, инфекции и стресса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теплый свет мощностью 150 Вт должен находиться на расстоянии не менее 30 см от клетки для животных, и следует соблюдать осторожность, чтобы избежать ожогов. - Вводят подкожную инъекцию бупренорфина (0,05 мг/кг) 8 часов в течение 1 дня или по рекомендации ветеринара. Если наблюдается воспаление или инфекция глаза, обратитесь к ветеринарному врачу для соответствующего лечения.
- Очистка и стерилизация инструментов
- Промойте стеклянный микролитровый шприц объемом 10 мкл и тупую иглу 33G 100% этанолом 10x. Смойте этанол, прошив шприц дистиллированной водой.
- Разберите стеклянный шприц и иглу. Высушите шприц для хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стеклянный шприц объемом 10 мкл был собран в соответствии с инструкциями производителя (рис. 1), а тупая игла, используемая для подачи клеточной суспензии/среды, показана на рисунке 1B. Различные подходы к субретинальной инъекции проиллюстрированы на рисунке 2. В этом протоколе мы опишем подход pars plana (рис. 2C). Тупая игла, установленная на стеклянном шприце, была введена через склеротомическую рану и получила доступ к субретинальному пространству по всему земному шару. Как показано на рисунке 3А, траектория иглы, проникновение через сетчатку и доставка клеток контролировались непосредственно под микроскопом при выполнении инъекции. Успешная доставка клеток/сред была подтверждена наблюдением пузырька в месте инъекции (рис. 3B). Удачный блеб можно определить как светлый беловатый цвет, напоминающий водяной шар. Неудачная доставка наблюдается по просачиванию клеток/среды в стекловидное тело в месте инъекции и неспособности сформировать пузырь. ОКТ-сканирование было выполнено на области инъекции, и сканирование показало плавающие индивидуализированные чЭСК в глазу, обработанном клеткой (рис. 4A), в то время как глаз, обработанный средой, показал прозрачную жидкость без клеток в субретинальном пространстве (рис. 4B). Индивидуализированные чЭСК идентифицированы как гиперотражающие материалы, распределенные в субретинальном пространстве (рис. 4А). Успешность инъекции рассчитывали путем отметки количества глаз с успешным образованием пузыря. Мы включили приложения, в которых этот подход применялся в нашей лаборатории, и показатели успешности инъекций (Таблица 1).
Рисунок 1: Инструменты, используемые во время инъекции. (A) Стеклянный шприц объемом 10 мкл крепится с помощью тупой иглы 33G. (B) Увеличьте изображение тупой иглы 33G. (C) Подушка, на которой может лежать голова животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Различные пути субретинальной инъекции. (A) Трансроговичный путь: инъекционная игла проходит через роговицу и зрачок, чтобы попасть в субретинальное пространство. (B) Транссклеральный путь: доступ к подсетчатому пространству осуществляется непосредственно через склеру. (C) Путь Pars plana: инъекционная игла вводится в стекловидное тело через разрез в лимбе. Игла проникает в субретинальное пространство, проникая в сетчатку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Изображения глазного дна глаза во время субретинальной инъекции. (А) До того, как была выполнена субретинальная инъекция, кончик иглы мог быть виден в стекловидном теле, касаясь сетчатки, избегая крупных кровеносных сосудов сетчатки. (B) После субретинальной инъекции в месте инъекции образовался видимый пузырь (желтая пунктирная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Интраоперационное ОКТ-сканирование глаз с инъекцией. Сканирование было сделано сразу после инъекции. (A) глаза, обработанного чЭСК: на верхней панели было показано расположение ОКТ-сканирования (голубые и розовые линии поперечного сечения) на глазу; чЭСК наблюдались в обработанном глазу в субретинальном пространстве (желтая пунктирная линия, средняя и нижняя панели). (B) Глаз, обработанный средой: на верхней панели было показано расположение ОКТ-сканирования (голубые и розовые линии поперечного сечения) на глазу; Прозрачная жидкость без клеток наблюдалась в субретинальном пространстве в глазу, введенному в среду (желтая пунктирная линия, средняя и нижняя панели). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Приложений | Штамм реципиента | Процент успеха |
| ААВ | РПЭ65РД12/ДЖ | 80% |
| ААВ | К57БЛ/6 | 95% |
| Клетки-предшественники, полученные из чЭСК | Лd10-/- | 95% |
Таблица 1: Успешность субретинальной инъекции в различных приложениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Субретинальная инъекция была использована для трансплантации клеточной суспензии для лечения РПЭ и заболеваний сетчатки 23,25,26,27,28,31,40. Этот подход очень важен в исследованиях грызунов не только для трансплантации клеток и генной терапии, но и для оценки новых терапевтических соединений для лечения заболеваний сетчатки. В настоящее время для доставки клеток или AAV в субретинальное пространство используются три основных пути: трансроговичный, трансклеральный и pars plana.
При трансроговичном доступе инъекционная игла проходит через роговицу, зрачок и, наконец, сетчатку, чтобы доставить клетки в субретинальное пространство и сформировать успешный пузырь. Преимуществом транскорнеального доступа является возможность создания полной отслойки сетчатки у реципиента47. Он может доставить большее количество клеток; Однако при таком подходе продольное наблюдение для изучения структурной конформации и клеточной интеграции является сложной задачей. Кроме того, осложнения включают образование катаракты, синехии и помутнение роговицы, что затрудняет продольные наблюдения 11,45,47,48. В качестве альтернативы транссклеральный доступ также используется для доставки AAV в субретинальное пространство44,49. Этот подход полезен для новорожденных мышей и считается более безопасным, так как нет необходимости в том, чтобы игла проходила через окулярную среду. Однако нельзя игнорировать кровотечение из хориоидеи, рефлюкс раствора из места инъекции, перфорацию сетчатки, подтекание в стекловидное тело.
Мы применили подход pars plana для введения фоторецепторов-предшественников, полученных из hESC, в субретинальное пространство с помощью тупой иглы 33G. При таком подходе инъекционная игла вводилась через разрез в области лимба. Затем игла была пропущена через полость стекловидного тела и, наконец, попала в субретинальное пространство через сетчатку. Часто наблюдались скопления клеток, которые могут блокировать доставку клеток при использовании игл неподходящего размера. Ресуспендирование клеток в пробирке микрофуги перед загрузкой в инъекционный шприц следует тщательно выполнять с помощью наконечника пипетки объемом 10 мкл. Первоначально мы пытались использовать иглу 34G, где часто наблюдалась закупорка иглы клетками. Соответствующий размер иглы должен быть протестирован для конкретных типов клеток, особенно узкопроходные иглы, как правило, дают менее жизнеспособные клетки при введении50. Одним из преимуществ такого подхода является непосредственная визуализация во время инъекции, позволяющая хирургу контролировать и тщательно выбирать конкретное место для доставки клеток. Область инъекции и игла должны быть хорошо видны во время процедуры. Катаракта и помутнение роговицы, вызванные анестезией, могут сильно повлиять на правильную доставку клеток в определенное место.
Во время выполнения инъекции игла должна проникать в сетчатку перпендикулярно, а тупой конец иглы должен быть параллелен склере, чтобы свести к минимуму утечку введенных клеток в стекловидное тело (рисунок 3). При выполнении инъекции к шприцу следует прикладывать только легкое давление. Сильное давление может привести к разрыву сетчатки, кровоизлиянию, просачиванию клеток в хориоидальное пространство, непрохождению клеток через иглу и проколу глазного яблока. Оптимальное давление может быть обеспечено, когда кончик иглы только что прошел через сетчатку, а на кончике иглы видна маленькая белая точка давления. После инъекции иглу следует медленно и осторожно втягивать из места инъекции, чтобы предотвратить утечку введенных клеток в стекловидное тело.
Ограничением этого подхода является сложная кривая обучения. Исследование показало, что обученному офтальмологу необходимо выполнить 364 инъекции мышам, чтобы достичь 95% успеха, в то время как менее опытным стажерам с хирургическим опытом потребуется большее количествотренировок. Осложнения этого подхода включают след иглы в сетчатке, рефлюкс клеток в стекловидное тело, кровотечение из сосудистой оболочки/сетчатки и ятрогенную катаракту. Однако при достаточном количестве тренировок эти осложнения наблюдаются значительно реже46.
В заключение, наш метод может доставлять фоторецепторы-предшественники, полученные из hESC, в субретинальное пространство мышей rd10 , что очевидно показано на ОКТ-сканировании. Этот подход может быть использован для изучения новых терапевтических соединений, трансплантации различных типов клеток и генной терапии для лечения заболеваний наружной сетчатки и РПЭ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Хви Гун Тай является соучредителем компании Alder Therapeutics AB. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Вэй Шэн Тана, Луанн Чан, Сюэ Йена, Синьи Ли и Инин Чунг за оказанную техническую помощь в подготовке фоторецепторов-предшественников на 32-й день после криоконсервации. Эта работа была частично поддержана грантами Национального совета по медицинским исследованиям (NMRC/OFYIRG/0042/2017) и грантом24-й конкурсной исследовательской программы Национального исследовательского фонда (CRP24-2020-0083) для H.G.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
