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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Établissement d’un modèle physiologique de micro-tumeurs vascularisées humaines pour la recherche sur le cancer

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65865
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Biomedical Engineering, University of California, Irvine

Summary

Ce protocole présente un modèle de tumeur sur puce physiologiquement pertinent pour effectuer des recherches fondamentales et translationnelles à haut débit sur le cancer humain, en faisant progresser le dépistage des médicaments, la modélisation des maladies et les approches de médecine personnalisée avec une description des procédures de chargement, d’entretien et d’évaluation.

Abstract

L’absence de modèles de cancer validés qui récapitulent le microenvironnement tumoral des cancers solides in vitro reste un goulot d’étranglement important pour la recherche préclinique sur le cancer et le développement thérapeutique. Pour surmonter ce problème, nous avons développé la microtumeur vascularisée (VMT), ou puce tumorale, un système microphysiologique qui modélise de manière réaliste le microenvironnement complexe de la tumeur humaine. La VMT se forme de novo au sein d’une plate-forme microfluidique par co-culture de plusieurs types de cellules humaines dans des conditions d’écoulement dynamiques et physiologiques. Cette construction micro-tumorale issue de l’ingénierie tissulaire intègre un réseau vasculaire perfusé vivant qui soutient la masse tumorale en croissance, tout comme les vaisseaux nouvellement formés le font in vivo. Il est important de noter que les médicaments et les cellules immunitaires doivent traverser la couche endothéliale pour atteindre la tumeur, modélisant in vivo les barrières physiologiques à l’administration et à l’efficacité thérapeutiques. Étant donné que la plate-forme VMT est optiquement transparente, l’imagerie haute résolution de processus dynamiques tels que l’extravasation des cellules immunitaires et les métastases peut être obtenue grâce à la visualisation directe des cellules marquées par fluorescence dans le tissu. De plus, le VMT conserve l’hétérogénéité tumorale in vivo , les signatures d’expression génique et les réponses médicamenteuses. Pratiquement n’importe quel type de tumeur peut être adapté à la plate-forme, et les cellules primaires de tissus chirurgicaux frais se développent et répondent au traitement médicamenteux dans le VMT, ouvrant la voie à une médecine véritablement personnalisée. Ici, les méthodes d’établissement de la VMT et de son utilisation pour la recherche en oncologie sont décrites. Cette approche novatrice ouvre de nouvelles possibilités pour l’étude des tumeurs et des réponses aux médicaments, offrant aux chercheurs un outil puissant pour faire avancer la recherche sur le cancer.

Introduction

Le cancer reste un problème de santé majeur dans le monde et est la deuxième cause de décès aux États-Unis. Pour la seule année 2023, le National Center for Health Statistics prévoit plus de 1,9 million de nouveaux cas de cancer et plus de 600 000 décès par cancer aux États-Unis1, soulignant le besoin urgent d’approches thérapeutiques efficaces. Cependant, à l’heure actuelle, seulement 5,1 % des traitements anticancéreux entrant dans les essais cliniques obtiennent finalement l’approbation de la FDA. L’échec des candidats prometteurs à progresser avec succès dans les essais cliniques peut être en partie attribué à l’utilisation de systèmes modèles non physiologiques, tels que les cultures 2D et sphéroïdales, lors du développement préclinique de médicaments2. Ces modèles classiques de cancer manquent de composants essentiels du microenvironnement tumoral, tels qu’une niche stromale, des cellules immunitaires associées et une vascularisation perfusée, qui sont des déterminants clés de la résistance thérapeutique et de la progression de la maladie. Ainsi, un nouveau système modèle qui imite mieux le microenvironnement tumoral humain in vivo est nécessaire pour améliorer la traduction clinique des résultats précliniques.

Le domaine de l’ingénierie tissulaire progresse rapidement, offrant des méthodes améliorées pour étudier les maladies humaines en laboratoire. L’un des développements importants est l’émergence des systèmes microphysiologiques (MPS), également connus sous le nom de puces d’organes ou de puces tissulaires, qui sont des organes humains miniaturisés fonctionnels capables de reproduire des conditions saines ou malades 3,4,5. Dans ce contexte, des puces tumorales, qui sont des modèles tridimensionnels de tumeurs humaines in vitro basées sur la microfluidique, ont été développées pour la recherche en oncologie 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Ces modèles avancés intègrent des signaux biochimiques et biophysiques dans un microenvironnement tumoral dynamique, ce qui permet aux chercheurs d’étudier le comportement des tumeurs et les réponses aux traitements dans un contexte plus pertinent sur le plan physiologique. Cependant, malgré ces progrès, peu de groupes ont réussi à intégrer un système vasculaire vivant et fonctionnel, en particulier un système qui s’auto-modèle en réponse au flux physiologique 3,4,5,6. L’inclusion d’un réseau vasculaire fonctionnel est cruciale car elle permet de modéliser les barrières physiques qui affectent l’administration de médicaments ou de cellules, l’ancrage des cellules dans des microenvironnements distincts et la migration transendothéliale des cellules tumorales, stromales et immunitaires. En incluant cette caractéristique, la puce tumorale peut mieux représenter les complexités observées dans le microenvironnement tumoral in vivo.

Pour répondre à ce besoin non satisfait, nous avons développé une nouvelle plateforme de criblage de médicaments qui permet de former des réseaux de micro-vaisseaux au sein d’un dispositif microfluidique 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Cette plate-forme de puce d’organe de base, appelée micro-organe vascularisé (VMO), peut être adaptée à pratiquement n’importe quel système d’organes pour reproduire la physiologie tissulaire d’origine pour la modélisation des maladies, le dépistage de médicaments et les applications de médecine personnalisée. Les VMO sont établis par la co-culture de cellules endothéliales dérivées de colonies endothéliales (ECFC-EC), HUVEC ou iPSC-EC (ci-après EC), et de multiples cellules stromales dans la chambre, y compris les fibroblastes pulmonaires humains normaux (NHLF), qui remodèlent la matrice, et les péricytes qui enveloppent et stabilisent les vaisseaux. Le VMO peut également être établi en tant que système modèle de cancer en co-cultivant des cellules tumorales avec le stroma associé pour créer un modèle de micro-tumeur vascularisée (VMT)8,9,10,11,12,13, ou puce tumorale. Grâce à la co-culture de plusieurs types de cellules dans un environnement d’écoulement dynamique, des réseaux microvasculaires perfusés se forment de novo dans les chambres tissulaires du dispositif, où la vasculogenèse est étroitement régulée par les débits interstitiels14,15. Le milieu est conduit à travers les canaux microfluidiques de l’appareil par une tête de pression hydrostatique qui alimente les cellules environnantes de la chambre tissulaire en nutriments exclusivement à travers les micro-vaisseaux, avec un coefficient de perméabilité de 1,2 x 10-7 cm/s, similaire à ce que l’on observe pour les capillaires in vivo8.

L’incorporation de micro-vaisseaux auto-organisés dans le modèle VMT représente une percée significative car elle : 1) imite la structure et la fonction des masses tumorales vascularisées in vivo ; 2) peut modéliser les étapes clés des métastases, y compris les interactions tumeur-endothélial et les cellules stromales ; 3) établit des barrières physiologiquement sélectives pour l’administration de nutriments et de médicaments, améliorant ainsi le dépistage pharmaceutique ; et 4) permet l’évaluation directe des médicaments ayant des capacités anti-angiogéniques et anti-métastatiques. En reproduisant l’administration in vivo de nutriments, de médicaments et de cellules immunitaires dans un microenvironnement 3D complexe, la plateforme VMO/VMT est un modèle physiologiquement pertinent qui peut être utilisé pour effectuer le criblage de médicaments et étudier la biologie du cancer, vasculaire ou spécifique à un organe. Il est important de noter que le VMT favorise la croissance de divers types de tumeurs, notamment le cancer du côlon, le mélanome, le cancer du sein, le glioblastome, le cancer du poumon, la carcinose péritonéale, le cancer de l’ovaire et le cancer du pancréas 8,9,10,11,12,13. En plus d’être peu coûteuse, facile à établir et adaptée aux expériences à haut débit, la plateforme microfluidique est entièrement compatible optiquement pour l’analyse d’images en temps réel des interactions tumeur-stromal et de la réponse à des stimuli ou à des traitements. Chaque type de cellule du système est étiqueté avec un marqueur fluorescent différent pour permettre une visualisation directe et un suivi du comportement cellulaire tout au long de l’expérience, créant ainsi une fenêtre sur le microenvironnement dynamique de la tumeur. Nous avons précédemment montré que le VMT modélise plus fidèlement la croissance tumorale in vivo, l’architecture, l’hétérogénéité, les signatures d’expression génique et les réponses médicamenteuses que les modalités de culture standard10. Il est important de noter que le VMT soutient la croissance et l’étude des cellules dérivées des patients, y compris les cellules cancéreuses, ce qui modélise mieux la pathologie des tumeurs parentes que les cultures sphéroïdes standard et fait progresser les efforts de médecine personnalisée11. Ce manuscrit décrit les méthodes d’établissement de la VMT, en démontrant son utilité pour l’étude des cancers humains.

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Protocol

1. Conception et fabrication

  1. Conception de l’appareil
    1. Pour la fabrication d’un dispositif microfluidique, créer un moule SU-8 à l’aide d’une couche de 200 μm de SU-8 enrobée par centrifugation sur une plaquette de Si-1 (nettoyée au RCA-1 et traitée au fluorure d’hydrogène (HF) à 2 %), suivie d’une étape de photolithographie à masque unique comme décrit précédemment 8,9.
    2. Coulez une réplique en polydiméthylsiloxane (PDMS) de 4 mm d’épaisseur à partir du moule SU-8 pour générer un moule en polyuréthane durable pour les étapes de fabrication en aval. Diverses itérations de conception peuvent être utilisées 8,9,10,11,12,13,14,15.
    3. Dans l’itération actuelle, concevez le dispositif microfluidique pour qu’il soit monté sur mesure dans un format de plaque standard à 96 puits et composé d’une couche caractéristique PDMS de 2 mm d’épaisseur avec 12 unités de dispositif microfluidique entourées d’une fine couche de membrane polymère transparente (1/16 pouce) sur le fond (Figure 1A).
    4. S’assurer que les unités tissulaires individuelles sont constituées d’une chambre tissulaire flanquée d’une entrée et d’une sortie de chargement de gel (L1) et d’une sortie (L2), d’un régulateur de pression (PR)16 et de canaux microfluidiques découplés reliés à 2 entrées et sorties de milieux de chaque côté (M1-M2, M3-M4 ; Graphique 1B).
    5. Positionnez chaque entrée et sortie dans un seul puits qui sert de réservoir moyen pour établir une pression hydrostatique (10 mm H2O) à travers le canal microfluidique. Pour permettre l’anastomose du réseau vasculaire avec les canaux externes, connectez les canaux microfluidiques à la chambre tissulaire via des pores de communication de 50 μm de large (6 en haut, 6 en bas).
      REMARQUE : Les résistances microfluidiques créent un gradient de pression interstitielle de 5 mm H2O à travers la chambre tissulaire qui devient intraluminal une fois que le réseau vasculaire est complètement formé 8,10. Les procédures suivantes commencent par une plaque à haut débit entièrement assemblée.

Figure 1
Graphique 1. Conception de plate-forme microfluidique. (A) Le schéma de l’assemblage de la plate-forme montre la couche caractéristique du PDMS avec 12 unités d’appareil collées à une plaque sans fond de 96 puits et scellées avec une fine membrane polymère transparente. Chaque unité d’appareil occupe une colonne de puits sur la plaque. L’unité d’appareil unique entourée en rouge est illustrée avec les détails en (B). (B) Le schéma d’une unité de dispositif montre une seule chambre tissulaire positionnée à l’intérieur d’un puits de la plaque à 96 puits et deux orifices de chargement avec des trous d’entrée et de sortie (L1-L2) perforés pour permettre l’introduction d’un mélange cellule-matrice. Les entrées et sorties de milieu (M1-M2, M3-M4) sont perforées et positionnées dans des puits qui servent de réservoirs de fluide. Différents volumes de milieux établissent un gradient de pression hydrostatique à travers la chambre tissulaire via des canaux microfluidiques découplés. L’unité de régulation de pression (PR) sert de soupape d’éclatement de gel pour augmenter la facilité de chargement. Notez que l’appareil a une profondeur de 200 μm et que la chambre tissulaire mesure 2 mm x 6 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Préparatifs avant le chargement

  1. Culture cellulaire
    1. Maintenir les cellules selon les recommandations du fabricant dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 .
    2. Flacons de plaque T75 contenant des cellules EC, NHLF ou d’autres fibroblastes/cellules stromales transduites et des cellules cancéreuses souhaitées 3 à 4 jours avant le chargement à une densité informée par les protocoles du fabricant et de l’utilisateur. Pour ce protocole, plaquez 1 x 106 cellules par flacon pour chaque type de cellule. Culture EC dans un milieu de croissance endothélial 2 (EGM2) complet, NHLF dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de FBS, et cellules cancéreuses dans un milieu approprié en fonction du type de cellule.
    3. Maintenir les cellules en les nourrissant avec les milieux respectifs tous les 2-3 jours et reconfirmer l’efficacité de la transduction ou du marquage en visualisant les cellules au microscope fluorescent. Le jour de la charge, assurez-vous que l’EC est confluente à 80 % à 100 %, tandis que la NHLF est sous-confluente à 70 % à 80 %.
  2. Préparation du fibrinogène
    1. Préparez la solution de fibrinogène à la concentration souhaitée (généralement, 5 à 8 mg/mL favorisent la formation d’un réseau vasculaire robuste), en tenant compte du pourcentage de coagulation du fibrinogène. Calculez la quantité de fibrinogène nécessaire avec l’équation suivante :
      Fibrinogène (mg) = (volume (mL)) x (concentration (mg/mL))/ (% de coagulation)
    2. Dissoudre le fibrinogène dans un volume approprié de milieu endothélial basal 2 (EBM2), réchauffé à 37 °C, en agitant doucement le tube (ne pas vortex). Incuber le fibrinogène dans un bain-marie à 37 °C pour lui permettre d’entrer complètement en solution. Il est important de ne pas utiliser un support complet.
    3. Solution de fibrinogène à filtre stérile avec filtre de 0,22 μm et aliquote au volume désiré, généralement 400 μL par tube de microcentrifugation.
      REMARQUE : D’autres protéines matricielles (par exemple, les collagènes, la fibronectine ou la laminine) peuvent être enrichies dans le mélange de fibrinogène.

3. Chargement des échantillons

REMARQUE : Le chargement est sensible au temps et doit être terminé du début (levage des cellules) à la fin (ajout de supports aux appareils) dans un délai d’environ 1,5 à 1,75 h pour garantir des résultats optimaux. Chaque étape est notée avec une minuterie suggérée pour aider l’utilisateur à rester sur la bonne voie.

  1. Préparation des matériaux (Jour de chargement)
    1. Placer les éléments suivants dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 à 15 minutes : solution saline équilibrée de Hank (HBSS) ou solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour le lavage des cellules, réactif de dissociation cellulaire, milieux (par exemple, EGM2, DMEM)
    2. Conservez les réactifs suivants au réfrigérateur à 4 °C jusqu’au moment de l’emploi : thrombine, laminine (décongelé toute la nuit à 4 °C).
    3. Décongeler l’aliquote de fibrinogène à température ambiante. Préparer 1,5 μL d’aliquotes de thrombine dans des tubes de microcentrifugation de 500 μL, à raison d’un tube par unité de dispositif. Assurez-vous que l’aliquote de thrombine se trouve au fond de chaque tube pour faciliter le chargement.
    4. Placez les plaques à haut débit stérilisées aux UV dans un dessiccateur pendant au moins 30 minutes avant le chargement pour éliminer l’air emprisonné dans la microfluidique.
  2. Préparation des cellules (Démarrage de la minuterie = début à 0 min)
    1. Vérifiez les cellules au microscope à un grossissement de 4x pour confirmer l’efficacité de la confluence et de la transduction.
    2. Lavez chaque flacon de cellules T75 2 fois avec 5 mL d’HBSS et aspirez complètement. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation dans chaque fiole et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 1 à 2 min.
    3. Tapotez doucement la plaque avec la paume de votre main et vérifiez que toutes les cellules ont été soulevées.
    4. Laver les cellules de la fiole avec 9 mL de milieu approprié et les recueillir dans un cône de 15 mL. Retirez immédiatement une petite aliquote pour le comptage des cellules.
    5. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 3-5 min à 4 °C. Pendant que vous centrifugez les cellules, comptez les cellules. Une fiole T75 confluente d’EC ou de NHLF doit donner au moins 2 x 106 cellules.
    6. Après centrifugation, aspirer le milieu et remettre en suspension le granulé dans un milieu approprié à une concentration de 1 x 106 cellules/mL. Gardez les cellules sur de la glace.
  3. Préparation du mélange de cellules et de fibrinogènes (Minuterie = commencer à 20 min)
    1. Déterminez le nombre d’appareils qui seront chargés, en ajoutant 1 à 2 pour tenir compte de la perte de pipetage, et multipliez par le volume de mélange cellule/fibrinogène nécessaire par dispositif. Cela dépendra de la configuration de l’appareil, mais pour la conception de l’appareil présentée dans cet article, 6 μL par appareil sont nécessaires.
    2. La concentration de chaque type de cellule doit être déterminée expérimentalement. Pour commencer, charger l’EC à une concentration d’environ 7 x 106 cellules/mL et la NHLF à une concentration de 3,5 x 106 cellules/mL. La concentration des cellules cancéreuses peut varier considérablement en fonction de leur taux de croissance, mais se situe généralement dans la fourchette de 0,5 à 2 x 106 cellules/mL. Utilisez cette équation pour calculer le nombre de cellules nécessaires :
      Nombre de cellules nécessaires = (volume de fibrine (μL))/1000 μL x (concentration de cellules)
    3. Remettre les cellules en suspension à une concentration de 1 x 106 cellules/mL et utiliser l’équation suivante pour déterminer le volume de cellules nécessaires :
      Volume de cellules nécessaires (μL) = (nombre de cellules nécessaires)/1000
    4. Mélanger les volumes respectifs d’EC, de NHLF et de cellules cancéreuses (pour la VMT uniquement) dans un tube conique et centrifuger à 300 x g pendant 3 à 5 min à 4 °C.
    5. Après l’essorage, aspirez soigneusement le milieu et pipetez tout milieu résiduel à proximité de la pastille. Remettez doucement mais soigneusement la pastille en suspension dans le volume calculé de fibrinogène, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air. Garder sur la glace.
    6. Apportez des plaques stérilisées et des aliquotes de thrombine dans la hotte de culture tissulaire.
  4. Dispositifs de chargement (Minuterie = début à 30-35 min)
    1. À l’aide d’une pipette P20, pipeter 6 μL de volume du mélange cellule/fibrine. Assurez-vous de pipeter le mélange de haut en bas au moins 5 fois pour assurer une suspension cellulaire uniforme. Gardez le mélange sur de la glace pour ralentir la coagulation.
    2. Mélangez délicatement la cellule/fibrine dans un tube de thrombine en plaçant l’embout de la pipette directement dans l’aliquote de thrombine au fond du tube. Pipeter immédiatement de haut en bas au moins 2 fois, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air. La fibrine commencera à coaguler une fois mélangée à la thrombine, alors complétez rapidement mais délibérément les étapes 3.4.3. et 3.4.4. avant que la fibrine ne se gélifie dans l’embout de la pipette (~3 s).
    3. Soulevez la plaque à haut débit en biais et insérez rapidement la pointe de la pipette dans l’un des orifices de chargement de l’appareil (L1 ou L2). Voir la figure 2A pour le schéma.
    4. Poussez le piston de la pipette vers le bas jusqu’à la première butée avec un mouvement fluide et doux pour injecter le mélange cellule/fibrine dans la chambre à tissus. Surveillez le fait que le gel traverse complètement la chambre.
      REMARQUE : L’application d’une pression trop forte pendant cette étape peut entraîner l’éclatement du gel dans les canaux microfluidiques en haut et/ou en bas des chambres tissulaires.
    5. Replacez délicatement la plaque à plat dans la hotte de culture tissulaire sans retirer l’embout de la pipette, relâcher le piston de la pipette ou déranger la pipette. Utilisez votre main pour tourner et retirer l’embout de pipette du P20 et laissez-le dans le trou de l’orifice de chargement. N’utilisez pas le bouton d’éjection pour retirer l’embout car cela provoquerait trop de pression.
    6. Passez aux étapes 3.4.1 à 3.4.5 pour les autres appareils.
    7. Une fois le chargement terminé, laissez la plaque reposer pendant 2 minutes sans être dérangée dans la hotte de culture tissulaire.
    8. Retirez les pointes de pipette en les tournant doucement et en les tirant des orifices de chargement. Replacez le couvercle sur l’assiette.
    9. Incuber toute la plaque pendant 15 à 20 min dans un incubateur à 37 °C pour permettre au gel de polymériser complètement.
    10. Après l’incubation, vérifiez chaque unité de l’appareil au microscope. Vérifiez que les cellules sont uniformément réparties dans la chambre sans bulles d’air et qu’il y a une interface de gel clairement visible entre la chambre tissulaire et les canaux microfluidiques, comme sur la figure 2B-C.
  5. Revêtement de canal avec de la laminine (Minuterie = commencer à 45-50 min)
    1. Une fois que les gels sont complètement solides, introduisez de la laminine dans les canaux microfluidiques pour favoriser l’anastomose vasculaire.
    2. À l’aide d’un P20, introduisez 4 μL de laminine dans chaque canal microfluidique (haut et bas) de l’appareil. Insérez l’embout de la pipette dans M1 ou M3 et expulsez lentement la laminine, en veillant à ce que la laminine recouvre tout le canal supérieur, puis répétez l’opération pour M2 ou M4 pour recouvrir tout le canal inférieur.
    3. Déterminez l’orientation en pipetant la laminine du côté opposé au régulateur de pression pour permettre une pression suffisante pour la faire passer. Cependant, si la laminine ne se déplace pas facilement d’un côté, retirez l’embout d’un côté et poussez la laminine de l’autre côté. Il peut être nécessaire d’aller jusqu’à la deuxième butée de la pipette (c’est-à-dire pousser le piston à fond) pour générer une pression suffisante pour pousser la laminine à travers tout le canal.
    4. Retirez délicatement l’embout de l’entrée/sortie du support. N’utilisez pas le bouton d’éjection du P20.
    5. Répétez les étapes 3.5.1 à 3.5.4 pour chaque appareil et incubez la plaque à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 10 min.
  6. Ajout de média (Minuterie = début à environ 1 h 10 min)
    1. Ajouter 275 μL de média complet EGM2 dans les réservoirs de média non couplés des puits des rangées A et B ou G et H. Ce sera le côté haut, et l’orientation doit être déterminée en faisant en sorte que les puits du côté opposé au régulateur de pression aient un volume élevé pour commencer. Les médias seront poussés du côté supérieur par la gravité.
    2. À l’aide d’une pipette P200, introduire 75 μL de milieu dans les entrées/sorties du milieu des puits contenant les 275 μL d’EGM2. Insérez l’embout dans l’orifice d’entrée du média et expulsez lentement le support, en observant que le média se déplace à travers le canal et bouillonne de l’autre côté.
    3. Retirez l’embout de la pipette et poussez le milieu restant de l’embout dans le réservoir de média de manière à ce que le volume total du côté haut soit de 350 μL.
    4. Répétez les étapes 3.6.1 à 3.6.3 pour chaque unité d’appareil, canaux supérieur et inférieur.
    5. Ajouter 50 μL de média pour recouvrir complètement le côté bas, les puits des rangées A et B ou G et H, selon l’orientation décrite ci-dessus. Assurez-vous qu’il y a une couche uniforme de média recouvrant le fond du puits. Reportez-vous à la figure 2D pour un schéma montrant les volumes de média dans les réservoirs.
  7. Élimination des bulles d’air (post-chargement)
    REMARQUE : L’élimination des bulles est une étape essentielle pour assurer un bon débit dans chaque appareil. Au jour 2, les cellules endothéliales et les fibroblastes commenceront à s’étirer en réponse à l’écoulement (Figure 2E).
    1. Une fois tous les milieux ajoutés, incuber les plaques pendant 1 à 2 h dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 avant de vérifier s’il y a des bulles d’air dans les canaux ou aux entrées/sorties du milieu.
    2. Visualisez les bulles dans les canaux de média au microscope et expulsez-les en réintroduisant 75 μL de média dans les canaux pour expulser les bulles.
    3. Visualisez les bulles dans les entrées/sorties du fluide à l’œil nu. Utilisez une pipette P200 pour éliminer les bulles d’air piégées aux entrées et sorties du fluide en poussant le piston vers le bas, en introduisant l’embout dans le trou et en tirant la bulle en soulevant le piston pour appliquer une pression négative et aspirer la bulle.

Figure 2
Graphique 2. Schéma de chargement de l’appareil. (A) À l’aide d’une pipette P20, le mélange cellule/fibrine est introduit dans la chambre tissulaire de chaque unité de dispositif via l’un des orifices de chargement. (B) La micrographie à fond clair montre un dispositif microfluidique chargé d’EC, de fibroblastes et de cellules cancéreuses pour former un VMT. Barre d’échelle = 500 μm. (C) Micrographie à fluorescence de l’appareil en B montrant l’EC en rouge, la tumeur en cyan et les fibroblastes en bleu. (D) Le schéma montre l’ajout de fluide dans les réservoirs, avec 350 μL du côté haut et 50 μL du côté bas pour générer la charge de pression hydrostatique. (E) Le jour 2 de la culture VMT montre que les fibroblastes et la CE commencent à s’étirer pour former le réseau vasculaire. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Maintenance des appareils et applications expérimentales

  1. Entretien et traitement médicamenteux
    REMARQUE : Pour maintenir le débit dans le système, la pression hydrostatique doit être rétablie quotidiennement en pipetant le volume de média du côté bas vers le côté haut ou vice versa, en veillant à ce que le volume total du côté haut reste à 350 μL. Le sens d’écoulement est changé tous les jours après le jour 2 de l’établissement du VMO ou du VMT. Des détails supplémentaires sur l’entretien et le traitement sont fournis ci-dessous.
    1. Changez de milieu tous les deux jours avec EGM2 complet jusqu’à ce que le système vasculaire soit complètement établi (jours 5 et 6). Aspirer complètement les vieux milieux et remplacer les puits à haute pression (350 μL) et les puits à basse pression (50 μL).
      REMARQUE : La détermination expérimentale de formulations de milieux optimisés peut être effectuée pour d’autres types de cellules, impliquant souvent un mélange 50/50 ou l’ajout de composants spécifiques dans EGM2.
    2. Une fois que le réseau vasculaire est formé et que les tissus sont complètement développés (jours 4 à 7), effectuez un test de perfusion au dextran avant d’utiliser les dispositifs pour des expériences (étape 4.2.1.). N’utilisez que des appareils qui ont une perfusion suffisante dans la chambre tissulaire.
    3. Pour les expériences utilisant des produits thérapeutiques, le jour du début du traitement, prenez des images dans tous les canaux fluorescents de chaque appareil. Cela servira de référence.
    4. Traiter les dispositifs avec le traitement souhaité en remplaçant le milieu par un milieu frais contenant le médicament dilué à la concentration souhaitée. S’assurer que les médicaments sont dilués dans des véhicules appropriés selon les recommandations du fabricant, mais ne pas dépasser 0,01 % de DMSO dans le milieu.
    5. Exposez les dispositifs au médicament pendant la durée souhaitée (généralement 48 h, mais peut être informée par la pharmacocinétique).
    6. Imagez chaque canal de chaque appareil à l’intervalle de temps souhaité pour surveiller la réponse au traitement. Entretenez les plaques comme indiqué à l’étape 4.1.1 pendant toute la durée de l’expérience.
    7. À la fin de l’expérience, blanchir les plaques et les placer dans un récipient à risque biologique, fixer avec 4 % de PFA pour la coloration immunofluorescente (étape 4.3) ou récolter pour isoler les cellules vivantes ou l’ARN (étape 4.4.).
  2. Tests de perfusion
    1. Perfusion de dextran
      REMARQUE : La perméabilité/perméabilité vasculaire peut être déterminée en perfusant le réseau vasculaire avec du dextran marqué par fluorescence de poids moléculaires variables (40 kD, 70 kD ou 150 kD). Le FITC ou le rhodamine-dextran peuvent être utilisés en fonction de l’étiquette fluorescente de la CE.
      1. Avant la perfusion, déterminer l’exposition appropriée du canal FITC ou rhodamine en ajoutant quelques μL de dextran dans le canal fluidique ou la chambre d’un dispositif vide. Réglez le temps d’exposition juste en dessous du niveau de saturation grâce à l’utilisation d’un logiciel de microscope pour afficher un histogramme d’intensités de pixels, assurant une plage dynamique caractérisée par des pixels uniformément répartis sans aucune concentration notable de valeurs de haute intensité.
      2. Prenez des micrographies de tous les appareils dans les canaux d’intérêt, y compris une image d’arrière-plan de tous les appareils dans le canal de dextran fluorescent, pour calibrer par rapport à l’arrière-plan. Utilisez la même exposition que celle déterminée ci-dessus et alignez la chambre tissulaire au centre du cadre de l’image pour garantir des images cohérentes pour la quantification.
      3. Préparer un stock principal de FITC-dextran ou de rhodamine-dextran à une concentration de 5 mg/mL dans 1x DPBS. Ce bouillon peut être conservé à 4 °C.
      4. Pour préparer un stock de travail, diluer 5 mg/mL de stock jusqu’à une concentration finale de 50 μg/mL dans l’EGM2.
      5. Remplacez le milieu dans les réservoirs par la solution de dextran diluée à la moitié du volume maximal (175 μL dans un puits ainsi que le côté haut sur le canal supérieur ou inférieur de la chambre à tissus). Remplacez le média dans les autres puits de manière à ce que le côté haut non couplé reçoive 175 μL d’EGM2 frais sans dextre, et que les puits du côté bas n’aient que 50 μL dans chacun.
        REMARQUE : Le dextran ne doit être ajouté qu’à un seul côté des canaux microfluidiques (haut ou bas) pour permettre la visualisation du colorant se déplaçant à travers le côté haute pression, dans le lit vasculaire et hors du côté basse pression.
      6. Au microscope, observez l’écoulement du dextran fluorescent dans le réseau vasculaire. Cela se produit généralement dans les 2 minutes environ suivant l’ajout du colorant dans le réservoir de média.
      7. Commencez à imager le canal de dextran fluorescent (et d’autres canaux, si vous le souhaitez). Il s’agit de T = 0 point de temps. Prenez des images supplémentaires à plusieurs moments (généralement toutes les 10 minutes) ou une seule image de point final.
    2. Perfusion de cellules
      REMARQUE : Différents types de cellules peuvent être perfusés à travers le système vasculaire selon la conception de l’étude, y compris les lymphocytes ou les macrophages pour les études d’immunologie du cancer, ainsi que les cellules cancéreuses pour les études de métastases. Les cellules doivent être marquées par fluorescence pour faciliter le suivi dans le temps.
      1. Au moins 2 h avant de perfuser les cellules, effectuez une perfusion de dextran sur tous les appareils comme indiqué ci-dessus. Cette étape est importante pour déterminer la perméabilité vasculaire avant d’ajouter des cellules.
      2. Déterminez l’exposition appropriée de l’appareil photo pour les cellules à perfuser. Prélevez un petit échantillon de cellules pour l’examiner au microscope et définissez le temps d’exposition de ce marqueur fluorescent. Réglez le temps d’exposition juste en dessous du niveau de saturation.
      3. Prenez des micrographies de tous les appareils dans les canaux d’intérêt, y compris une image d’arrière-plan de tous les appareils dans le canal de dextran fluorescent, pour calibrer par rapport à l’arrière-plan. Utilisez la même exposition que celle déterminée à l’étape 4.2.2.1.
      4. Confirmez que le dextran s’est complètement diffusé hors des chambres tissulaires avant de prélever les cellules pour la perfusion. Récoltez et comptez les cellules qui vous intéressent.
      5. Remettre les cellules en suspension à la densité appropriée dans EGM2. Par exemple, les lymphocytes T sont généralement ajoutés à environ 1 x 106 cellules/mL pour imiter la concentration dans le sang.
        REMARQUE : Les EC sont sensibles à la composition du milieu, mais peuvent tolérer jusqu’à 50 % de mélange avec la plupart des autres milieux. Testez au préalable.
      6. Ajouter 175 μL de suspension cellulaire dans un puits situé sur le côté supérieur de chaque dispositif et ajouter 175 μL d’EGM2 complet dans l’autre puits. Du côté bas, ajouter 50 μL de média complet EGM2 dans les deux puits.
      7. Au microscope, observez l’écoulement des cellules fluorescentes dans le réseau vasculaire. Cela se produit généralement dans les 2 minutes environ suivant l’ajout des cellules au réservoir de support.
      8. Une fois le flux cellulaire établi, commencez à imager le canal cellulaire fluorescent (et d’autres canaux, si vous le souhaitez). Il s’agit de T = 0 point de temps. Prenez des images supplémentaires à plusieurs moments ou une seule image de point final, selon la conception de l’étude. Par exemple, l’imagerie toutes les 10 minutes permettra d’obtenir des parcours temporels à haute résolution ou toutes les 6 à 12 h pour suivre les mouvements périodiques des cellules.
  3. Coloration immunofluorescente (IF)
    1. Aspirer le milieu des puits. Ajouter 200 μL de PFA à 4 % dans les deux puits du côté haut de chaque unité d’appareil et 50 μL du côté bas. Laisser le PFA s’écouler dans les chambres pendant 15 min à température ambiante ou 30 min à 4°C.
    2. Pendant l’incubation, préparez une plaque à 24 puits avec 500 μL de 1x PBS par puits. Calculez le nombre de puits nécessaires pour teindre chaque appareil.
    3. Retirez complètement le PFA des puits. Retournez la plaque et retirez délicatement le support en plastique de la membrane.
      REMARQUE : La coloration IF peut également être effectuée in situ sans retirer la membrane et l’appareil. Pour ce faire, effectuez des étapes de coloration en perfusant les réactifs à travers le VMO/VMT et augmentez la durée de chaque étape d’incubation d’environ 6 fois.
    4. Décollez très doucement et soigneusement la couche inférieure de la membrane de la couche caractéristique de l’appareil pour exposer les chambres tissulaires en saisissant les deux coins et en tirant vers le bas dans un mouvement lent et fluide. La plupart des tissus doivent rester dans la chambre tissulaire. Reportez-vous à la figure 3A.
    5. À l’aide d’une lame de rasoir ou d’un scalpel, appliquez une force suffisante pour couper complètement la couche d’éléments et découpez un petit rectangle autour de chaque unité d’appareil, comme illustré à la Figure 3B.
    6. Calez une spatule entre la couche caractéristique et la plaque de puits. Appliquez une légère pression sous la couche caractéristique pour retirer soigneusement toute la couche caractéristique contenant la chambre tissulaire de la plaque de puits.
    7. Placez chaque pièce rectangulaire de la couche caractéristique PDMS contenant le tissu face vers le bas dans un seul puits contenant du PBS.
    8. Une fois que toutes les unités sont dans les puits, lavez avec du PBS en plaçant la plaque sur une bascule douce pendant 5 minutes, en aspirant le PBS du puits et en le remplaçant par 500 μL de PBS frais. Répétez l’opération pour un total de 3 lavages.
    9. Aspirer le PBS de chaque puits et perméabiliser les tissus avec 500 μL de Triton-X à 0,5 % dans le PBS, 2 fois pendant 10 minutes chacun sur une bascule douce. Enlever la solution de perméabilisation.
    10. Bloquer 500 μL de sérum à 10 % dans du Triton-X à 0,1 % par dispositif pendant 1 h à température ambiante en balançant doucement.
    11. Diluer les anticorps primaires dans 3 % de sérum dans 0,1 % de Triton-X à la concentration et au volume souhaités. Retirez la solution bloquante et ajoutez suffisamment de solution d’anticorps primaires pour recouvrir entièrement le fond de chaque puits et permettre la libre circulation des tissus de l’appareil (~200 μL). Recouvrez l’assiette d’un film transparent.
    12. Incuber la plaque en la balançant toute la nuit à 4 °C. Le lendemain, ramenez la plaque contenant les mouchoirs de l’appareil à température ambiante (~15 min).
    13. Aspirer la solution d’anticorps primaire de chaque puits et de chaque chambre de lavage avec 500 μL de PBS, 3 fois pendant 5 minutes chacun sur une bascule douce.
    14. Ajouter 200 μL d’anticorps secondaire dans 3 % de sérum dans 0,1 % de Triton-X à la concentration désirée. Incuber l’assiette en la balançant doucement pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
    15. Aspirer la solution d’anticorps secondaire et laver avec du PBS, 3x pendant 5 min chacun avec un léger balancement. Ajouter une solution de 1x DAPI dans 0,1% de Triton-X pendant 10 min en se balançant dans le noir.
    16. Retirez de la plaque les découpes rectangulaires de l’appareil contenant des tissus tachés à l’aide d’une pince à épiler et placez-les côté mouchoir vers le haut sur un essuie-tout.
    17. Pipeter quelques μL (~10 μL) de solution anti-décoloration directement sur chaque chambre et lamelle, en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Laissez l’antidécoloration durcir sur les chambres pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité, puis procédez à l’imagerie.
  4. Isolement de tissus et de cellules pour les tests moléculaires
    REMARQUE : Chaque plaque à haut débit contiendra environ 1-2 x 105 cellules, selon le moment de la récolte. Mettez à l’échelle le nombre de répétitions expérimentales pour tenir compte du nombre total de cellules ainsi que des pertes potentielles lors de la récolte.
    1. Analyses unicellulaires
      1. Aspirez le média de chaque puits et inversez la plaque à haut débit de manière à ce que la couche de l’appareil soit orientée vers le haut.
      2. Retirez le support en plastique de la membrane. Décollez très doucement et soigneusement la membrane inférieure du PDMS de la couche caractéristique de l’appareil pour exposer les chambres tissulaires en saisissant les deux coins et en tirant vers le bas dans un mouvement lent et fluide.
      3. La membrane peut être retirée même avec un collage approprié. La plupart des tissus doivent rester dans la chambre tissulaire après le retrait de la membrane ; Cependant, si une partie est collée à la membrane, suivez les étapes ci-dessous sur la membrane elle-même.
      4. Lavez chaque unité avec 500 μL de HBSS ou de PBS. Ajoutez 100 μL de réactif de dissociation à chaque unité de l’appareil et laissez-le reposer sous forme de gouttelette sur le dessus de l’appareil. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 5 min.
      5. Après la digestion, utilisez une pipette P200 pour pipeter de haut en bas à travers les chambres tissulaires et recueillir les tissus dans le réactif de dissociation. Déplacez l’embout de la pipette d’avant en arrière sur chaque dispositif pour assurer l’élimination complète du tissu et collectez dans un cône de 15 ml avec 500 μl d’EGM2 pour neutraliser le réactif de dissociation.
      6. Pour une élimination complète des cellules restantes de la chambre tissulaire, ajoutez 500 μL d’EGM2 à chaque unité de l’appareil et lavez avec une pipette P200.
      7. Centrifuger la solution de digestion contenant les tissus délogés à 300 x g pendant 5 min à 4 °C pour agglomérer des cellules individuelles et des tissus entiers.
      8. Aspirer soigneusement le milieu et ajouter 500 μL de collagénase de type IV à 1 mg/mL (200 U/mL), 0,1 mg/mL de hyaluronidase de type V et 200 U/mL d’ADN de type IV dans HBSS.
      9. Après une remise en suspension douce, laisser reposer la solution pendant 2 minutes à température ambiante avant de pipeter à nouveau doucement pour dissocier le gel.
      10. Laver le mélange de digestion avec 10 mL d’EGM2 et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre en suspension les cellules dans 1x DPBS avec 1 % de BSA ou de HSA et passer à travers un filtre pré-humidifié de 70 μm en essorant à 200 x g pendant 1 min.
      11. Comptez les cellules et ajustez le volume de manière à ce que la concentration finale soit de 1000 cellules par μL. Les suspensions cellulaires peuvent ensuite être soumises au FACS, à la cytométrie en flux ou au séquençage de l’ARN unicellulaire.
    2. Isolement de l’ARN à partir de tissus entiers
      1. Suivez les étapes 4.4.1.1 et 4.4.1.2 ci-dessus.
      2. Ajouter environ 10 μL de tampon de lyse de l’ARN sur chaque chambre tissulaire exposée, en veillant à ce que le tampon s’accumule directement sur les tissus. N’utilisez pas plus de 100 μL de tampon de lyse de l’ARN au total.
      3. Incuber 3 min à température ambiante. Utilisez le P20 pour pipeter de haut en bas sur chaque unité de l’appareil et utilisez la pointe de la pipette pour gratter tout matériau résiduel de la chambre à tissus si nécessaire.
      4. Transférez autant de tampon de lyse que possible dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Répétez les étapes 4.4.2.2.-4.4.2.3. pour les autres appareils et prélever des échantillons dans le tube de 1,5 ml.
      5. Suivez les instructions du fabricant pour isoler l’ARN, en fonction du kit ou des réactifs.

Figure 3
Graphique 3. Plate-forme de préparation pour l’immunomarquage. (A) Schéma de la plate-forme de l’appareil entièrement assemblée avec une couche de membrane sur le dessus. Pour retirer la membrane, tirez soigneusement chaque coin de la couche extérieure vers le bas dans un mouvement régulier et doux. (B) Une fois la couche de membrane complètement retirée, utilisez une lame, un scalpel ou un couteau pour découper des rectangles autour de la chambre tissulaire de chaque unité de l’appareil, en prenant soin de ne pas couper dans le tissu lui-même. Une spatule peut ensuite être calée sous chaque rectangle pour le déloger de la plaque et placer chaque unité dans un seul puits d’une plaque à 24 puits avec du PBS pour la coloration. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

Conformément aux protocoles décrits ici, les VMO et les VMT ont été établies à l’aide de la lignée cellulaire de cancer du sein triple négatif MDA-MB-231 achetée dans le commerce, de la lignée cellulaire de cancer du sein triple négatif. Des VMO établis ont également été perfusés avec des cellules cancéreuses pour imiter les métastases. Dans chaque modèle, au jour 5 de la co-culture, un réseau vasculaire s’auto-assemble en réponse à un écoulement gravitationnel à travers la chambre tissulaire, servant de conduit pour l’apport in vivo de nutriments, de produits thérapeutiques et de cellules cancéreuses ou immunitaires à la niche stromale (Figure 4). Les VMO ont d’abord été établies en introduisant de l’EC marquée mCherry dans la chambre tissulaire, comme le montre la figure 4A (jour 0 de culture), avec une distribution uniforme des cellules. Au jour 2 de la culture VMO, les EC commencent à s’étirer et à se luméniser (Figure 4B), et au jour 4, les EC se sont anastomosés avec les canaux microfluidiques externes et forment un réseau vasculaire continu (Figure 4C). Après que le système vasculaire ait formé des anastomoses et tapissé les canaux externes, le tissu VMO a été perfusé avec du FITC-dextran à 70 kD pour confirmer la perméabilité vasculaire (Figure 4D). Le FITC-dextran a été introduit dans le réservoir de fluide avec la pression hydrostatique la plus élevée et a été autorisé à perfuser à travers la chambre tissulaire via des micro-vaisseaux du côté haute pression au côté basse pression, comme indiqué par les flèches. Dans le VMO, le FITC-dextran a complètement perfusé le réseau microvasculaire en 15 minutes avec une fuite vasculaire minimale, confirmant ainsi la fonction de barrière vasculaire serrée (Figure 4E). Les cellules MDA-MB-231 ont ensuite été perfusées dans le VMO, où les cellules ont adhéré à la muqueuse endothéliale (Figure 4F) et se sont extravasées dans l’espace extravasculaire dans les 24 heures suivant la perfusion, formant de multiples micro-métastases dans la chambre tissulaire (Figure 4G). Des images fluorescentes microscopiques en accéléré ont été prises toutes les 50 ms avec des objectifs à air 4x et 10x sur un microscope confocal inversé pour observer les cellules cancéreuses perfusant à travers la microvascularisation en temps réel (vidéo supplémentaire 1, vidéo supplémentaire 2).

Dans le VMO, on peut voir les lymphocytes T s’extravaser dans l’espace extracellulaire en l’espace extracellulaire en 45 minutes (Figure 4H-I). Des micrographies fluorescentes en accéléré ont été prises au microscope confocal afin d’acquérir une pile z de 150 μm de profondeur toutes les 15 minutes afin d’observer l’extravasation des lymphocytes T en temps réel (vidéo supplémentaire 3). Comme le montre la figure 4J, MDA-MB-231 VMT avec des vaisseaux entièrement formés et non perméables a été perfusé avec des lymphocytes T (jaunes), dont beaucoup ont rapidement adhéré à la paroi vasculaire (pointes de flèches ; Figure 4K, vidéo supplémentaire 4, vidéo supplémentaire 5). Ces résultats, en plus des études antérieures 8,9,10,11,12,13,14,15, démontrent l’utilité des plateformes VMO et VMT pour la recherche en immunologie et en immuno-oncologie, respectivement.

Figure 4
Graphique 4. Résultats représentatifs pour MDA-MB-231 VMT et VMO. (A) VMO le jour 0 immédiatement après le chargement des cellules dans la chambre tissulaire. Les EC sont indiqués en rouge. Barre d’échelle = 500 μm. (B) Au jour 2 de la culture VMO, l’EC commence à s’étirer en réponse à l’écoulement. (C) Le jour 4 de la VMO montre que le réseau vasculaire est anastomosé avec les canaux microfluidiques externes et que les vaisseaux sont presque matures. (D) Les réseaux VMO sont entièrement perfusés et brevetés au jour 5 de la culture. Récipients en rouge, 70 kD FITC-dextran vert. Le sens de l’écoulement est indiqué par des flèches. Barre d’échelle = 500 μm. (E) Vue zoom du VMO perfusé. Barre d’échelle = 100 μm. (F) MDA-MB-231 (cyan) est perfusé à travers le même réseau VMO que celui illustré en E, et à l’instant 0, les cellules cancéreuses ont adhéré à la paroi des vaisseaux endothéliales (pointes de flèche). Barre d’échelle = 100 μm. (G) En 24 h, les cellules MDA-MB-231 se sont extravasées dans l’espace extracellulaire, établissant de multiples micro-métastases dans la niche vasculaire. Barre d’échelle = 100 μm. (H) La microscopie confocale fluorescente Time-lapse révèle l’extravasation des lymphocytes T à travers un micro-vaisseau à l’intérieur du VMO (I) sur une période de 45 min. Les pointes de flèches indiquent les zones d’extravasation. Barre d’échelle = 50 μm. (J) La lignée cellulaire de cancer du sein triple négatif MDA-MB-231 est établie dans la VMT et perfusée au jour 5. Barre d’échelle = 500 μm. Le réseau vasculaire montre une fuite minime à 15 min après la perfusion (médaillon, barre d’échelle = 100 μm). (K) MDA-MB-231 VMT (identique à B) est perfusé avec des lymphocytes T (jaune), avec de multiples zones d’adhérence des lymphocytes T à la paroi vasculaire (pointes de flèche). Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1. Perfusion de cellules cancéreuses de l’ovaire dans le VMO. Microscopie fluorescente time-lapse de cellules COV362 (cyan) perfusées à travers un réseau vasculaire (rouge) et imagées à un objectif 4x toutes les 50 ms pendant 1 min. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 2. Perfusion de cellules cancéreuses du sein triple négatif dans le VMO. Microscopie fluorescente time-lapse de cellules MDA-MB-231 (cyan) perfusées à travers un réseau vasculaire (rouge) et imagées à un objectif 10x toutes les 50 ms pendant 30 s. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 3. Perfusion de lymphocytes T de VMO. La microscopie confocale à fluorescence Time-lapse a capturé le processus d’extravasation des lymphocytes T à travers un micro-vaisseau à l’intérieur du VMO sur une durée de 45 minutes. Des images Z-stack ont été obtenues toutes les 15 min, avec une taille de pas de 2 μm et une profondeur de 150 μm. Le vaisseau est rouge, les lymphocytes T sont jaunes. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 4. Perfusion de lymphocytes T de VMT. Microscopie fluorescente time-lapse de lymphocytes T perfusés à travers MDA-MB-231 VMT à 4x objectif. Les images ont été acquises toutes les 50 ms pendant 30 s. Les lymphocytes T sont représentés en jaune, MDA-MB-231 en cyan et les vaisseaux/EC en rouge. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 5. Vue zoom de la perfusion T cell-VMT. Vue agrandie 10x du MDA-MB-231 VMT perfusé avec des lymphocytes T (à partir de la vidéo supplémentaire 4). Les images ont été acquises toutes les 50 ms pendant 30 s. Les lymphocytes T sont représentés en jaune, MDA-MB-231 en cyan et les vaisseaux/EC en rouge. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Presque tous les tissus du corps reçoivent des nutriments et de l’oxygène par le biais du système vasculaire, ce qui en fait un élément essentiel pour la modélisation réaliste des maladies et le dépistage des médicaments in vitro. De plus, plusieurs tumeurs malignes et états pathologiques sont définis par un dysfonctionnement de l’endothélium vasculaire et une hyperperméabilité3. Notamment, dans le cancer, la vascularisation associée à la tumeur est souvent mal perfusée, perturbée et perméable, agissant ainsi comme une barrière à l’administration de cellules thérapeutiques et immunitaires à la tumeur. De plus, la vascularisation sert de conduit par lequel les cellules cancéreuses peuvent métastaser pour ensemencer des tissus éloignés et facilite les communications cellule-cellule qui atténuent la réponse immunitaire tout en favorisant davantage la croissance et la dissémination des cellules cancéreuses. Ces phénomènes mettent en évidence le rôle crucial que joue la niche vasculaire dans la résistance thérapeutique et la progression du cancer et la nécessité de modéliser avec précision le microenvironnement tumoral au cours de l’étude préclinique. Pourtant, les systèmes modèles in vitro standard n’incluent pas les composantes stromales et vasculaires appropriées ou n’intègrent pas les conditions d’écoulement dynamiques. Pour remédier à ces lacunes dans les systèmes modèles actuels, des méthodes visant à établir un système microphysiologique bien caractérisé qui soutient la formation d’une micro-tumeur humaine vivante et perfusée (VMT) pour la recherche en oncologie physiologique ont été présentées. Il est important de noter que le VMT modélise les caractéristiques clés des vaisseaux aberrants associés à la tumeur et des interactions tumeur-stromal, ce qui le rend idéal pour la modélisation biomimétique des maladies et les tests d’efficacité thérapeutique10.

Pour faciliter l’utilisation, la plate-forme ne nécessite pas de pompes ou de vannes externes et, grâce au format de la plaque à 96 puits, elle peut être adaptée aux équipements de culture et aux flux de travail standard. De plus, différentes itérations de dispositifs pour répondre à des questions biologiques distinctes et à des compartiments spécifiques aux tissus et aux patients ont été validées 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Bien que la plate-forme puisse être adaptée à pratiquement n’importe quelle utilisation spécifique à un organe ou à un tissu en intégrant divers types de cellules, les cellules doivent d’abord être testées pour leur croissance et leur capacité vasculogénique dans le VMO/VMT à des concentrations cellulaires variables afin de déterminer la densité d’ensemencement optimale et les conditions de co-culture. Pour établir le système vasculaire, il est possible d’acheter dans le commerce des cellules endothéliales dérivées de cellules formant des colonies endothéliales humaines (ECFC-EC) ou de les isoler fraîchement à partir de sang de cordon ombilical en sélectionnant des cellules CD31+. Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) peuvent également être utilisées pour établir la vascularisation dans le VMO/VMT et peuvent être achetées dans le commerce ou fraîchement isolées des cordons ombilicaux. De plus, des cellules endothéliales dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC-EC) ont été testées avec succès sur la plateforme, ouvrant la possibilité d’un système complètement autologue18. Les fibroblastes d’origine commerciale (fibroblastes pulmonaires humains normaux pour leur potentiel vasculogène) fonctionnent bien dans le VMO/VMT, et certaines populations de cellules stromales dérivées primaires peuvent également être incorporées ou substituées. Les tumeurs primaires peuvent être introduites dans le VMT sous forme de cellules uniques, de sphéroïdes, d’organoïdes ou de morceaux tumoraux. La composition de la matrice peut être modifiée en fonction des besoins expérimentaux, y compris l’ajout de collagènes, de laminine, de fibronectine ou même de matrices tissulaires décellularisées19.

Le protocole comprend plusieurs étapes critiques où des soins particuliers sont essentiels pour éviter les problèmes courants (figure 5). Pendant le chargement, assurer un mélange homogène de la boue cellule/fibrine par un pipetage minutieux et une introduction en douceur dans la chambre tissulaire (figure 5A). Appliquez une pression appropriée pour expulser complètement le gel dans la chambre afin d’éviter une charge partielle (Figure 5B). La visualisation de la suspension cellule/fibrine traversant l’ensemble de la chambre tissulaire est nécessaire pour assurer un remplissage complet de la chambre et peut être facilitée en plaçant un doigt ganté derrière l’unité de l’appareil. Évitez d’appuyer trop fort sur le piston de la micropipette pour éviter que le mélange cellule/fibrine n’éclate dans les canaux microfluidiques (Figure 5C). Il faut veiller à ne pas introduire de bulles d’air pendant le pipetage afin d’éviter toute interférence avec le développement des tissus et les applications en aval (figure 5D). Une vitesse de mélange et de chargement appropriée est cruciale pour éviter les zones de coagulation incohérente (Figure 5E), tandis que le retrait prématuré de l’embout de la pipette peut également perturber le gel dans la chambre (Figure 5F). Il est recommandé de s’entraîner à charger pour familiariser les utilisateurs avec l’élément chronométré de la procédure et l’étape de chargement. De plus, l’introduction correcte de la laminine dans les canaux microfluidiques est cruciale pour la migration de l’EC, l’anastomose avec les canaux externes et la formation d’un réseau continu et perfusible pour l’apport de nutriments. Un revêtement de canal incomplet ou absent entraînera de mauvais résultats de perfusion et un VMO/VMT inutilisable.

Figure 5
Graphique 5. Erreurs courantes lors du chargement. (A) Unité de dispositif microfluidique correctement chargée sans défauts. (B) Le mélange cellule/fibrine n’a pas été complètement introduit dans la chambre, ce qui a entraîné une charge partielle. (C) Trop de pression appliquée pendant le chargement, ce qui entraîne l’éclatement du gel dans le canal microfluidique, bloquant l’écoulement. (D) Bulles d’air introduites dans le mélange cellule/fibrine à l’intérieur de la chambre pendant le pipetage. (E) Mélange inadéquat du mélange cellule/fibrine ou chargement lent entraînant des incohérences dans la coagulation. (F) Le retrait de l’embout de la pipette de l’orifice de chargement avant que le gel n’ait suffisamment durci entraînera une perturbation du mélange cellule/fibrine dans la chambre tissulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Des flux de travail robustes et standardisés pour l’analyse sont cruciaux dans les études VMO/VMT, car ils génèrent des quantités substantielles de données d’imagerie. Les méthodes de traitement d’images et d’analyse pour VMO/VMT ont été décrites précédemment 8,9,10,11,12,13. Pour l’analyse quantitative des tumeurs, l’intensité fluorescente dans le canal de couleur représentant les cellules tumorales est mesurée à l’aide de logiciels open source tels que ImageJ/Fiji (National Institute of Health)20 ou CellProfiler (Broad Institute)21. Le seuil des images micrographiques tumorales est défini pour sélectionner la région tumorale fluorescente, et l’intensité moyenne de fluorescence est mesurée dans cette région. L’intensité fluorescente totale de la tumeur est calculée comme le produit de la zone fluorescente et de son intensité moyenne, normalisée aux valeurs de base (prétraitement) pour obtenir le changement de pli de la croissance tumorale par dispositif au cours de la période expérimentale. En ce qui concerne l’analyse quantitative des vaisseaux, AngioTool (National Cancer Institute)22, les scripts de macro ImageJ/Fiji ou les logiciels MATLAB, tels que REAVER23, peuvent être utilisés pour quantifier la longueur totale des vaisseaux, le nombre de paramètres, le nombre de jonctions, la longueur moyenne des vaisseaux, le diamètre des vaisseaux, la lacunarité moyenne et le pourcentage de surface des vaisseaux. Des algorithmes d’apprentissage automatique peuvent être intégrés dans les flux de travail pour l’analyse automatique des images vasculaires afin d’identifier les composés qui perturbent efficacement le système vasculaire24. Les images de perfusion sont analysées en mesurant le changement d’intensité de fluorescence dans les régions de l’espace extracellulaire et en calculant le coefficient de perméabilité10. Des simulations par éléments finis de l’écoulement intraluminal à l’intérieur d’un réseau microvasculaire peuvent être réalisées à l’aide de COMSOL Multiphysics25. La mise en œuvre de méthodes analytiques standardisées est essentielle pour extraire des informations significatives de la grande quantité de données générées dans les études VMT.

Le protocole décrit ici permettra à l’utilisateur de tirer parti de la plate-forme VMO/VMT pour étudier de nombreux aspects de la biologie tumorale, notamment la croissance/progression tumorale, les métastases tumorales, la dynamique intra-tumorale des lymphocytes T et la réponse tumorale à la chimiothérapie et au traitement anti-angiogénique. Pour permettre des études d’immuno-oncologie physiologiquement pertinentes, il a été démontré comment les lymphocytes T fraîchement isolés perfusent à travers la microvascularisation, s’extravasent à travers la barrière cellulaire endothéliale et migrent dans la construction tissulaire. L’imagerie confocale microscopique en accéléré a été présentée comme un outil permettant de visualiser des événements spatialement aléatoires et temporellement rapides, y compris l’extravasation des lymphocytes T, qui ne sont pas facilement visualisés avec d’autres systèmes modèles. De plus, nous avons déjà testé plusieurs types de médicaments antinéoplasiques dans le VMT, y compris des agents chimiothérapeutiques, des inhibiteurs de petites molécules/tyrosine kinase, des anticorps monoclonaux (tels que l’anti-PD1 et le bevacizumab), des composés anti-angiogéniques et des agents stabilisateurs vasculaires, soulignant comment la plateforme peut être utilisée pour tester différentes classes de médicaments ciblant à la fois la tumeur et le stromaassocié. 9,10,11,12,13. Les effluents peuvent être collectés à partir de la plate-forme et analysés pour diverses cytokines ainsi que des exosomes. Dans de futures études, la plate-forme VMT peut être utilisée pour évaluer la sensibilité des cellules tumorales à l’attaque médiée par les lymphocytes T au niveau de chaque patient. En conclusion, le VMT est une plate-forme flexible et puissante idéale pour l’étude de la biologie tumorale, où le remodelage des composants vasculaires et stromaux est essentiel à la progression tumorale.

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Disclosures

Le CCWH détient une participation dans Aracari Biosciences, Inc., qui commercialise une version de la technologie décrite dans le présent document. Les termes de cet arrangement ont été examinés et approuvés par l’Université de Californie à Irvine, conformément à ses politiques en matière de conflits d’intérêts. Il n’y a pas d’autres conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions les membres du laboratoire du Dr Christopher Hughes pour leur précieuse contribution aux procédures décrites, ainsi que nos collaborateurs du laboratoire du Dr Abraham Lee pour leur aide dans la conception et la fabrication de la plateforme. Ces travaux ont été financés par les subventions suivantes : UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) et TL1 TR001415 et W81XWH2110393 (SJH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%  Sigma-Aldrich 175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates Greiner Bio-One 655096
Methanol ≥99.8% ACS VWR Chemicals BDH BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, Integra Miltex 33-31AA-P/25
PDMS membrane PAX Industries HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001 Harrick Plasma N/A
Smooth-Cast 385 Smooth-On N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator Bel-Art F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate VWR 82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) Dow 4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope Agilent  CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells StemBioSys N/A
Collagen I, rat tail Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) Sigma-Aldrich C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium Corning 21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning 10013CV
DAPI Sigma-Aldrich D9542
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma Neta Scientific SIAL-341573
Fibronectin human plasma Sigma-Aldrich F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) Sigma-Aldrich FD70S-1G
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4) Sigma-Aldrich H6254
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Leica TCS SP8 Leica N/A
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts Lonza CC-2512
Nikon Eclipse Ti Nikon N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences  15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells Lonza CC-2702
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Avantor Seradigm 97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen P10144
Quick-RNA Microprep Kit Zymo Research R1051
Thrombin from bovine plasma Sigma-Aldrich T4648
Triton X-100 (Electrophoresis), Fisher BioReagents BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Gibco 12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Vasculife Lifeline Cell Technology LL-0003

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References

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  24. Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
  25. COMSOL Multiphysics. , Stockholm, Sweden. www.comsol.com (2023).

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Modèle de micro-tumeur vascularisée Recherche sur le cancer Microenvironnement tumoral Cancers solides Recherche préclinique sur le cancer Développement thérapeutique Puce tumorale Système microphysiologique Types de cellules humaines Plateforme microfluidique Réseau vasculaire perfusé Couche endothéliale Administration thérapeutique Extravasation des cellules immunitaires Métastases Cellules marquées par fluorescence Hétérogénéité tumorale Signatures d’expression génique Réponses médicamenteuses Médecine personnalisée
Établissement d’un modèle physiologique de micro-tumeurs vascularisées humaines pour la recherche sur le cancer
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Hachey, S. J., Gaebler, D., Hughes,… More

Hachey, S. J., Gaebler, D., Hughes, C. C. W. Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research. J. Vis. Exp. (199), e65865, doi:10.3791/65865 (2023).

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