Summary
En protokoll presenteres for å evaluere om små EVs (sEVs) isolert fra placentaplanter dyrket under hypoksiske forhold (modellering av et aspekt av preeklampsi) forstyrrer blod-hjernebarrieren hos ikke-gravide voksne kvinnelige mus.
Abstract
Cerebrovaskulære komplikasjoner, inkludert cerebralt ødem og iskemisk og hemoragisk slag, utgjør den viktigste årsaken til mødredødelighet forbundet med preeklampsi. De underliggende mekanismene til disse cerebrovaskulære komplikasjonene er fortsatt uklare. Imidlertid er de knyttet til placenta dysfunksjon og blod-hjernebarriere (BBB) forstyrrelse. Likevel er forbindelsen mellom disse to fjerne organene fortsatt bestemt. Økende bevis tyder på at moderkaken frigjør signalmolekyler, inkludert ekstracellulære vesikler, i mors sirkulasjon. Ekstracellulære vesikler er kategorisert i henhold til deres størrelse, med små ekstracellulære vesikler (sEVs mindre enn 200 nm i diameter) betraktet som kritiske signalpartikler i både fysiologiske og patologiske forhold. I preeklampsi er det et økt antall sirkulerende sEV i mors sirkulasjon, hvis signalfunksjon ikke er godt forstått. Placental sEVs utgitt i preeklampsi eller fra normal graviditet placentas utsatt for hypoksi indusere hjernen endotelial dysfunksjon og forstyrrelse av BBB. I denne protokollen vurderer vi om sEV isolert fra placentaplanter dyrket under hypoksiske forhold (modellering av et aspekt av preeklampsi) forstyrrer BBB in vivo.
Introduction
Omtrent 70% av mødredødsfall på grunn av preeklampsi, et hypertensivt graviditetssyndrom preget av svekkede placentasjonsprosesser, maternell systemisk endoteldysfunksjon og i alvorlige tilfeller multiorgansvikt 1,2, er assosiert med akutte cerebrovaskulære komplikasjoner 3,4. De fleste mødredødsfall forekommer i lav- og mellominntektsland5. Imidlertid er de underliggende mekanismene fortsatt uklare til tross for den kliniske og epidemiologiske relevansen av cerebrovaskulære komplikasjoner assosiert med preeklampsi.
På den annen side er ekstracellulære vesikler (EV) (diameter ~ 30-400 nm) essensielle mediatorer for intercellulær kommunikasjon mellom vev og organer, inkludert mors placentainteraksjon6. I tillegg til proteiner og lipider på den ytre overflaten, bærer elbiler last innenfor (proteiner, RNA og lipider). EV-er kan kategoriseres i (1) eksosomer (diameter ~ 50-150 nm, også kalt små EV-er (sEVs)), (2) mellomstore / store EV-er og (3) apoptotiske kropper, som varierer etter størrelse, biogenese, innhold og potensiell signalfunksjon. Sammensetningen av elbiler bestemmes av cellene de kommer fra og sykdomstypen7. Syncytiotrofoblast-avledede EVer uttrykker placenta alkalisk fosfatase (PLAP) 8,9, som oppdager placentae-avledede sirkulerende små EVs (PDsEVsEVs) i svangerskapet. PLAP hjelper også med å skjelne endringer i PDsEVs last og deres effekter i preeklampsi versus normotensive graviditeter 10,11,12,13,14,15.
Morkaken har blitt anerkjent som den nødvendige komponenten i patofysiologien av preeklampsi16 eller cerebrale komplikasjoner forbundet med denne sykdommen 17,18,19. Men hvordan dette fjerne organet kan indusere endringer i hjernens sirkulasjon er ukjent. Siden sEV spiller sentrale roller i celle-til-celle-kommunikasjon på grunn av deres evne til å overføre bioaktive komponenter fra donor til mottakerceller 6,20,21, har et økende antall studier assosiert placenta sEVs med genereringen av mors endoteldysfunksjon 21,22,23,24, inkludert hjerneendotelceller 25,26hos kvinner med svangerskapsforgiftning. Dermed kan kompromittering av hjernens endotelfunksjon føre til forstyrrelse av blod-hjernebarrieren (BBB), en kritisk komponent i cerebrovaskulære komplikasjoner forbundet med preeklampsi 3,27.
Likevel rapporterte prekliniske funn ved bruk av cerebral kar fra rotter eksponert for serum hos kvinner med svangerskapsforgiftning28 eller endotelceller i den menneskelige hjerne eksponert for plasma hos kvinner med preeklampsi29 at sirkulerende faktor(er) induserer forstyrrelse av BBB. Til tross for flere kandidater med potensial til å skade BBB som er tilstede i mors sirkulasjon under preeklampsi, for eksempel forhøyede nivåer av proinflammatoriske cytokiner (dvs. tumornekrosefaktor)18,28 eller vaskulære regulatorer (dvs. vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF))29,30,31, eller oksidative molekyler som oksiderte lipoproteiner (okso-LDL)32,33, blant andre34, ingen av dem etablerer en direkte forbindelse mellom morkaken og BBB. Nylig har sEVs isolert fra hypoksiske morkaker vist evnen til å forstyrre BBB hos ikke-gravide kvinnelige mus25. Siden placenta sEVs kan bære de fleste av de listede sirkulerende faktorene med kapasitet til å forstyrre BBB, anses sEVs som egnede kandidater for å koble den skadede morkaken, være bærer av skadelige sirkulerende faktorer og forstyrre BBB i preeklampsi.
Denne protokollen tillater oss å undersøke om sEVs isolert fra placenta explants dyrket under hypoksiske forhold kan forstyrre BBB hos ikke-gravide kvinnelige mus som en proxy for å forstå patofysiologien av cerebrale komplikasjoner under preeklampsi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen ble utført i henhold til prinsippene uttrykt i Helsinkideklarasjonen og under autorisasjon fra de respektive etiske vurderingsnemndene. Alle menneskelige deltakere ga sitt informerte samtykke før prøveinnsamling, som rapportert tidligere25. I tillegg godkjente komiteen for bioetikk og biosikkerhet ved Bío-Bío-universitetet dette prosjektet (Fondecyt grant 1200250). Dyrearbeidet ble utført i samsvar med kardinalprinsippene til de tre R-ene i bruk av dyr i forsøk35, og i henhold til anbefalingene i retningslinjene for stell og bruk av forsøksdyr utgitt av US National Institute of Health. Dyrene ble holdt i passende miljøer ved Vivarium ved Universitetet i Bío-Bío. Fersk placentas (n = 4) ble oppnådd innen 1 time etter elektivt keisersnitt fra mødre (alder 28-31 år) med normale svangerskap ved termin (38 til 41 ukers svangerskap). Keisersnitt ble utført ved Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, Chile, som tidligere rapportert25. For å anvende in vivo-modellen ble 4-6 måneder gamle kvinnelige ikke-gravide mus (stamme C57BLACK/6) brukt. De ble delt inn i tre eksperimentelle grupper: (1) kontroll (uten behandling), (2) behandlet med sEV fra normoksi (sEVs-Nor), og (3) behandlet med sEVs fra hypoksisk dyrket placentas (sEVs-Hyp), som ble brukt til å evaluere forstyrrelsen av BBB in vivo25. Alle de injiserte løsningene var sterile. Tilberedningen av sEV-er ble også utført under aseptiske forhold og under en biosikkerhetshette i klasse II for å unngå forurensning.
1. Placenta kultur explants
- For å trekke ut eksplanter av normale graviditetsplacentas, sjekk metoden publisert av Miller et al. 200536.
- Fjern forsiktig blodproppene fra basalplaten til den menneskelige morkaken ved hjelp av steriliserte tang. Trekk ut små eksplanter for å oppnå en endelig vevsekstraksjon på 10 g.
- Sørg for at placenta explants fjernes fra de fire kvadranter av mors del av morkaken. Sørg for at devitalisert vev og forkalkede områder utelukkes.
- For å manipulere placentavev, gjør det på is, under sterile forhold og i et biosikkerhetsskap.
- Vask eksplantene (minst tre ganger) med rikelige mengder (fem volumer av eksplantene) av kald (4 °C) fosfatbufferløsning (PBS 1x, pH 7,4) for å fjerne så mye blod som mulig. Sentrifuge (252 x g i 10 min) ved romtemperatur mellom vask.
- Resuspender 10 g vaskede eksplanter i 20 ml kulturmedium supplert med 2% føtal bovint serum, 100 IE / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin (se materialfortegnelse).
- Sett suspensjonen i en 100 mm kulturskål. La eksplantene stå i 2 timer i en inkubator ved 37 °C med 21% oksygen og 5% CO2.
- Deretter vaskes eksplantene på nytt med 1x PBS ved 37 °C (tre ganger). Sentrifuge (252 x g i 10 min) ved romtemperatur mellom vask.
- Videre resuspendere vevet i 20 ml kulturmedium som tidligere er utarmet av nanopartikler.
MERK: For nanopartikkeluttømming, utfør ultrasentrifugering (120 000 x g i 18 timer ved romtemperatur) og mikrofiltrering (0,22 μm filter). - Del de resuspenderte eksplantene i to kulturer (100 mm). Hver kulturrett må inneholde 10 ml resuspenderte eksplanter.
- Deretter plasserer du en av tallerkenene som inneholder placentaplanter i standard kulturforhold (37 ° C med 8% oksygen og 5% CO2), mens du plasserer den andre i et hypoksisk kammer med 1% O2.
MERK: (VALGFRITT) Analyse av vevets levedyktighet kan utføres ved bruk av samme vevsekstraksjoner og 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidanalyse (MTT-analyse) som beskrevet andre steder 37,38. Bruk total proteinkonsentrasjon målt i eksplanthomogenatene for å normalisere MTT-verdier. - Etter 18 timer i kultur, høst de kondisjonerte mediene til eksplantene i et nytt 15 ml rør.
MERK: På dette trinnet kan betingede medier fryses (-80 °C) i en lengre periode (uker).
2. Placental-avledet sEVs isolasjon
- Isoler sEV fra det kondisjonerte mediet ved hjelp av differensialsentrifugerings- og mikrofiltreringsprotokollen etter tidligere publiserte rapporter25,39.
- Utfør sekvensiell sentrifugering for det høstede betingede medium. Sekvensielle trinn av sentrifugeringer er (1) 300 x g i 10 minutter, (2) 2000 x g i 10 minutter, (3) 10 000 x g i 30 minutter og (4) 120 000 x g i 2 timer. Utfør sentrifugeringen romtemperatur.
- I alle disse sentrifugeringene, ved hjelp av en 20-100 μL pipette, samle forsiktig supernatanten og kast pelleten.
- Når du er ferdig, sender du den siste oppsamlede supernatanten gjennom et 0,22 μm filter (se materialfortegnelsen). Deretter utfører du en ekstra sentrifugering ved 120 000 x g i 18 timer ved romtemperatur.
- Deretter kastes supernatanten mens pelleten resuspenderes (som inneholder placenta sEVs) i 500 μL PBS (pH 7,4) og passerer igjen gjennom et 0,22 μm filter. Til slutt utfører du en siste sentrifugering ved 120 000 x g i 3 timer ved romtemperatur.
- Deretter resuspenderer pelleten (som inneholder placenta sEVs) i 500 μL PBS (pH 7,4, tidligere tømt for sEV) og passerer gjennom et 0,22 μm filter.
- Merk prøvene som lager av sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) eller sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
MERK: Forbered 50-100 μL alikoter av de isolerte sEVene for videre eksperimentering. Små elbiler kan lagres ved -80 °C i en lengre periode (måneder). - Karakteriser placenta sEVs etter størrelse, antall og sEVs proteinmarkør, som rapportert tidligere25. Den ideelle gjennomsnittlige partikkeldiameteren til sEV er 50-150 nm.
MERK: sEVs karakterisering inkluderer positiv påvisning av CD63, Tsg101, Alix og HSP70 (dvs. for å karakterisere sEVs populasjon beriket i eksosomer). Bruk også PLAP som markør for morkakens opprinnelse25. - Mål den totale mengden protein i sEV-løsningen ved hjelp av BCA-proteinanalysesettet i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabellen).
MERK: Figur 1 viser en oversikt over placenta-eksplantkultur og ekstracellulær vesikkelisolasjon.
3. Mus injeksjon
- Bedøv dyret i et bedøvelsesinduksjonskammer med 5 % isofluran distribusjon (se materialfortegnelse). Kontroller nivået av anestesi via en tåklemme.
- Etter ~40 s, sett musen inn i anestesisystemet ved hjelp av en ansiktsmaske og oppretthold et anestesinivå på 2% isofluran.
- Deretter plasserer du dyret på en varmeplattform (se Materialfortegnelse) ved romtemperatur på 28 °C. Hold øynene smurt med kunstige tårer.
- Før injisering, fortynn placenta sEVs (200 μg totalt protein) med fosfatbuffer (pH, 7,4) til du når et endelig volum på 70 μL.
- Desinfiser injeksjonsområdet med 70% etanol og bomullspinner. Sørg for at du bruker en insulinsprøyte med en 30 G kanyle til å injisere sEVs oppløsningen.
MERK: Sprøyten kan plasseres på varmeplattformen i 5 minutter for å oppnå en fysiologisk temperatur. - Deretter injiseres oppløsningen i den eksterne venen jugularis venen. Dette trinnet trenger spesiell opplæring.
MERK: Prosedyren må utføres forsiktig, langsomt trekke nålen tilbake og forsiktig aspirere til tegn på blod refluks. - Etter injeksjon, påfør lett trykk på det injiserte området i ~ 15 s med en tørr bomullspinne. Deretter returnerer dyrene til deres respektive bur.
- Sørg for å evaluere bevissthet og atferd i 15 min. En indikator på bevissthetsoppnåelse er dyrets gjenoppretting av total motoraktivitet.
MERK: Sørg for å holde en varm temperatur i dyrets bur.
4. Rapid murine koma og atferd skala (RMCBS)
- Bruk RMCBS til å evaluere de nevrologiske og trivselsparametrene til dyrene40.
MERK: RMCBS tillater en rask evaluering (~ 3 min) med minimal dyrestress på grunn av operatørintervensjon. RMCBS har ti parametere (hver poengsum er 0-2). - Evaluer musens velvære med RMCBS-skalaen ved 0 timer (før injeksjon av sEV) og 3 timer, 6 timer, 12 timer og 24 timer etter injeksjon.
MERK: Utfør analyse av claudin-5 (6 timer etter injeksjon av sEV) og Evans blå ekstravasasjon (24 timer etter injeksjon av sEV) for å evaluere forstyrrelsen av BBB (figur 2).
5. Analyse av Evans blå ekstravasasjon
- Etter placenta sEVs injeksjon (24 timer), bedøve musene som beskrevet i trinn 3.1.
- Forbered Evans blå oppløsning (2%, fortynnet i fosfatbufferløsning, 1x) (se materialfortegnelse).
- Bruk retro-orbital tilgang25, injiser Evans blå oppløsning ved 2 ml / kg.
- La Evans blå løsning sirkulere i 20 minutter under vedlikehold av anestesi.
- Deretter utfører du intrakardial perfusjon etter tidligere beskrevet protokoll41 med saltoppløsning (~3 ml, 0,9%, w/v) for å fjerne Evans blå fargestoff fra sirkulasjonen. Dette trinnet er obligatorisk.
MERK: For denne prosedyren, øk anestesi til 5% og verifiser et dypt anestesiplan (dvs. drastisk reduksjon i respirasjonsfrekvensen). - Eksponer hjertet via medial torakotomi41 (figur 3).
- Deretter fikseres hele dyret med en intrakardial infusjon av paraformaldehydoppløsning (4% i PBS, v / v).
MERK: Kontroller stivheten til halen for å overvåke riktig fiksering. - Videre, når fikseringen er fullført, trekk forsiktig ut hjernen, vei den og fotografer den41. Ta bilder med hele hjernen nær en linjal42.
- Deretter legger du hjernen i en hjernemus-slicer (se Materialfortegnelse).
- Dissekere hjernen i ni seksjoner, kran-caudal, inkludert cerebellum (100 μm hver seksjon).
- Etter disseksjon, visualiser og ta bilder av hjerneskivene i et stereozoommikroskop (se Materialfortegnelse).
- Bruk bildene som er tatt til å kvantifisere Evans blå ekstravasasjon ved hjelp av ImageJ-programvaren (se Materialfortegnelse).
MERK: For å analysere tilstedeværelsen av Evans blå fargestoff, sett Evans blå verdier ved hjelp av en positiv kontroll av hjerneseksjonen (fra et dyrekontrolldyr injisert med fargestoff, men uten intrakardial perfusjon). Evans blå verdier nådd fra positiv kontroll er vanligvis mellom 75 og 110 i intensitetshistogrammet til den blå kanalen (figur 4). - Sørg for at hjernebilder analyseres blindt av den respektive eksperimentelle gruppen for å unngå observatørskjevhet. Alternativt kan du kvantifisere Evans blå ekstravasasjon ved hjernehomogenisering etterfulgt av spektroskopi43.
MERK: I separate eksperimenter, ved hjelp av ferskt isolerte hjerner fra sEVs injiserte mus (6 timer), analyser proteinnivåene av claudin 5 (CLND-5) (se materialtabell), et kritisk tett kryss involvert i tettheten til BBB44 (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen evaluerer kapasiteten til sEVs avledet fra placentas dyrket i hypoksi for å forstyrre BBB hos ikke-gravide mus. Denne metoden gjør det mulig å forstå bedre den potensielle forbindelsen mellom moderkaken og hjernen under normale og patologiske forhold. Spesielt kan denne metoden utgjøre en proxy for å analysere placenta sEVs deltakelse i begynnelsen av cerebrale komplikasjoner i preeklampsi.
I motsetning til mus injisert med sEVs-Nor, viser mus injisert med sEVs-Hyp en progressiv nedgang i nevrologisk score til 24 timer (tabell 1), noe som antyder sEVs-Hyp-kapasiteten til å svekke hjernens funksjon.
Også mushjerner i den sEVs-Hyp-injiserte gruppen har høyere friskvekt enn de som er isolert fra mus injisert med sEVs-Nor eller kontrollmus (henholdsvis 0,51 ± 0,008; 0,46 ± 0,008; 0,47 ± 0,01 g), noe som kan utgjøre en bruttoindikator på hjerneødem45.
Kompatibel med dette funnet, tillater denne protokollen en å identifisere Evans blå ekstravasasjon som en indikator på forstyrrelse av BBB. I den forbindelse har hjerner fra mus injisert med sEVs-Hyp høyere Evans blå ekstravasasjon enn hjerner fra sEVs-Nor-gruppen (figur 5A).
Selv om den underliggende mekanismen for forstyrrelse av BBB indusert av sEVs-Hyp ikke ble analysert med denne protokollen, indikerer resultatene også at sEVs-Hyp-injiserte mus viste reduserte proteinmengder av CLND-5 i områdene der BBB var mest påvirket (dvs. bakre områder) (figur 5B). Derfor er det mulig at sEVs-hyp svekker ekspresjonen av funksjonen til dette kritiske endoteliale tette kryssproteinet.
Figur 1: Placenta explant kultur og ekstracellulær vesikkel isolasjonsprotokoll. (A) Normale placenta explant kulturer. (B) Eksplanter fordeles i to betingelser for biogenese av placenta små ekstracellulære vesikler (sEVs). Normoksi (sEVs-Nor, 8% O2) eller hypoksi (sEVs-Hyp, 1% O2) i 18 timer. (C) Betingede medier høstes, filtreres og sentrifugeres for å eliminere celleavfall. (D) sEV er isolert av ultrasentrifugeringer. (E) sEV karakteriseres ved hjelp av nanosporingsanalyse og western blot. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: In vivo-evaluering av protokoll for forstyrrelse av blod-hjernebarrieren. Ikke-gravide C57BL6/J-mus, 4-6 måneder gamle, brukes. (A) Via vena jugularis eksterna fikk dyrene sEVs (200 μg totalt protein) isolert fra Normoxic (sEVs-Nor, 8% O2) eller hypoksisk (sEVs-Hyp, 1% O2) placentakulturer. RMCBS overvåkes ved 0-24 timer etter injeksjon. (B) 6 timer etter sEVs injeksjon, blir hjernen ekstrahert og seksjonert i ni segmenter for proteinutvinning. Claudin 5 (CLDN5) analyseres i homogenater av disse ni seksjonene. (C) Evans blå ekstravasasjonsanalyse (24 timer etter sEVs injeksjon) ble analysert etter retro-orbital punkteringsinjeksjon i hvert av de ni segmentene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fotodokumentarer av Evans blå fargestoff og intrakardiale perfusjonsprotokoll. (A) Mus mottok Evans blå via retro-orbital injeksjon. (Venstre) Dyr før og (høyre) etter injeksjon (15 s) av Evans blå. (B) Torakotomi for å utføre intrakardial perfusjon av fosfatbufferløsning (1x PBS) og paraformaldehyd (4% PFA). Venstre ventrikkel er spiss med spissen av nålen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av Evans blå ekstravasasjon etter injeksjon av sEV. (A) Representativt bilde av hele hjernen som viser Evans blå ekstravasasjon. Den stiplede linjen representerer ni seksjoner hentet fra hele hjernen. (B) Hjerne dissekert ved hjelp av en hjernemus slicer. (C) Representative bilder av hjerneskiver ved 24 timer etter injeksjon av sEV. Kontroll (CTL), placenta ved normoksisk (sEVs-Nor) eller hypoksiske tilstander (sEVs-Hyp). Skala bar = 0,4 cm. (D) Digital disposisjon av hjernesnitt ved hjelp av ImageJ. (E) Histogram i den blå kanalen. Verdier mellom 75-110 er knyttet til Evans blå ekstravasasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Evans blå ekstravasasjon og claudin-5-nivåer hos mus injisert med sEV isolert fra placentaeksplanter. (A) Prosentandel av Evans blå (EB) ekstravasasjon med tanke på hele hjerneseksjonene. Kontroll (CTL, blå), placenta ved normoksisk (sEVs-Nor, rød) eller hypoksiske tilstander (sEVs-Hyp, grønn). (B) Relative nivåer av claudin 5 (CLDN5) i de ni hjerneseksjonene ble oppnådd fra de tre eksperimentelle gruppene. β-aktin brukes som lastekontroll. Verdier menes ± interkvartilbredde. Hver prikk representerer et individuelt eksperimentelt emne. *p < 0,05, **p < 0,005. p < 0,0001. p < 0,001; ANOVA-test etterfulgt av Bonferroni post-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tid (h) | Kontroll | sEVs-Normoxia | sEVs-hypoksi | ANOVA |
| 0 | 18,75 ± 0,250 | 18,5 ± 0,288 | 18,75 ± 0,250 | Ns |
| 3 | 18,5 ± 0,866 | 17 ± 0,707 | 13.25 ± 1.750*α | 0.006 |
| 6 | 19.25 ± 0,750 | 17 ± 0,577 | 11.75 ± 1.250*α | 0.002 |
| 12 | 18,5 ± 0,645 | 16.75 ± 1.109 | 13 ± 0.816*α | 0.001 |
| 24 | 19,5 ± 0,288 | 17,75 ± 0,250 | 10.25 ± 0.853*α | <0.0001 |
| *p < 0,01 kontra kontroll. αp < 0,01 versus sEVs-Normoxia | ||||
Tabell 1: Rapid murine coma and behavior scale (RMCBS) etter 24 timer etter injeksjon av sEV. Skåren uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM. Dyrs score nærmest 20 er standard, mens jo lavere poengsum, desto høyere dysfunksjon av CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien avslører ny innsikt i potensiell skade som følge av sEVs isolert fra placenta-eksplanter dyrket under hypoksiske forhold på forstyrrelsen av gnagerblod-hjernebarrieren. Den patologiske mekanismen innebærer en reduksjon i CLND-5 i den bakre hjerneregionen25.
Tidligere undersøkelser har vist at plasma-sEVs fra personer med preeklampsi induserer endoteldysfunksjon i forskjellige organer ved bruk av in vitro-modeller 46,47. Denne undersøkelsen undersøkte spesielt blod-hjernebarrieren, og ga et nytt perspektiv på sEVs isolert fra hypoksi-dyrket morkake, som forstyrrer denne viktige barrieren. Disse funnene introduserer et nytt forskningsområde hvor sEVs kan tjene som en kommunikasjonskanal mellom morkaken og hjernen i både normale og patologiske scenarier, som preeklampsi.
Den presenterte protokollen er grei, men flere kritiske skritt krever omtale. Denne protokollen krever ferske morkaker innen 1 time etter levering. Vi fraråder også å forlenge dyrkningsperioden utover 24 timer for å hindre vevsnedbrytning. Denne protokollen reduserer potensiell forurensning fra sEV-er produsert av museplacentaer. Digital analyse av Evans blå ekstravasasjon er tidkrevende. Videre er Evans blå farging mindre iøynefallende etter hjerneseksjonering. Derfor anbefales et første oppsett for å identifisere det blå området ved hjelp av en positiv kontroll. En negativ kontroll, for eksempel en hjerne fra en mus som ikke er utsatt for Evans blå injeksjon, kan også brukes. Blind analyse av eksperimentelle grupper er avgjørende for å avverge potensiell observatørskjevhet.
Flere utfordringer kan oppstå under denne protokollen. En betydelig begrensning ligger i biologisk variabilitet som stammer fra både humane morkaker og injiserte mus. For å sikre reproduserbarheten av Evans blå ekstravasasjonseksperimenter, foreslås etablering av sEV-doser isolert fra humane placentaer. Vi valgte en dose på 200 μg totalt protein; Denne mengden kan imidlertid variere basert på vesikkelrenhet, effekten av jugulær injeksjon, Evans blå administrasjon, dens clearance fra sirkulasjonssystemet, og ikke minst den biologiske effekten av sEVs med tanke på innholdet.
De cellulære mekanismene som sEVs fra den menneskelige morkaken kan forstyrre blod-hjernebarrieren, krever ytterligere eksperimentering. Likevel har denne metoden relevans, antydet potensiell kommunikasjon mellom morkaken og hjernen, noe som garanterer videre utforskning. Derfor oppfordres fremtidige undersøkelser, med fokus på sEV og deres interaksjoner med blod-hjernebarrieren, samt virkningen av lasten på nevronvev. Hvorvidt blod-hjernebarriere svekkelse fører til varige konsekvenser for mors hjerne garanterer videre undersøkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å oppgi.
Acknowledgments
Forfatterne takker forskerne tilknyttet GRIVAS Health for verdifulle innspill. Også jordmødre og klinisk personale fra Obstetrics and Gynecology Service tilhører Hospital de Chillan, Chile. Grunnlagt av Fondecyt Regular 1200250.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
| Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
| Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
| BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
| Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
| D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
| Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
| Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
| Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
| Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
| Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
| Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
| PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
| Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
| ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
| Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
| Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
| Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
| Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
| Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |
References
- Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
- Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M.
- Hammer, E. S., Cipolla, M. J.
- Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
- Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
- Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
- Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
- Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
- Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
- Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
- Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5'-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
- Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
- Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000 (2019).
- Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
- Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia - A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
- Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
- Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670 (2014).
- Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
- Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
- Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
- Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M.
- Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
- Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
- Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
- Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
- Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
- Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier - a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
- Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451 (2022).
- Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
- Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
- Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
- Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , https://awionline.org/lab-animal-search/russell-w-m-s-burch-r-l-1959-principles-humane-experimental-technique-methuen-co (1959).
- Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
- Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2 (2015).
- Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22 (2006).
- Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124 (2010).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
- Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
- Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
- Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
- Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
- Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).
