Summary
نبض هرمون اللوتين (LH) هو السمة المميزة للوظيفة الإنجابية. وصفنا بروتوكولا للتنشيط عن بعد لمجموعات عصبية محددة مرتبطة بجمع الدم الآلي التسلسلي. تسمح هذه التقنية بالتعديل الهرموني الموقوت ، وتعدد الإرسال ، وتقليل تأثيرات التلاعب على مستويات LH في الواعية التي تتحرك بحرية ، وغير المضطربة.
Abstract
تعد مستويات هرمون اللوتين (LH) المنتشرة مؤشرا أساسيا لعمل التحكم في الغدة النخامية للتكاثر. لا يزال دور العديد من المدخلات والمجموعات العصبية في تعديل إطلاق LH غير معروف. غالبا ما يمثل قياس التغيرات في مستويات الهرمون اللوتيني في الفئران تحديا لأنها تتعطل بسهولة بسبب الإجهاد البيئي. تتطلب التقنيات الحالية لقياس إطلاق الهرمون اللوتيني والنبض تدريبا طويل الأجل للفئران للتكيف مع إجهاد التلاعب ، وبعض ضبط النفس ، ووجود الباحث ، والعمل على الفردية ، مما يقلل من فائدته للعديد من الأسئلة البحثية.
تقدم هذه الورقة تقنية لتنشيط مجموعات عصبية محددة عن بعد باستخدام تقنية Designer Receptor Exclusive Activated by Designer Drugs (DREADDs) إلى جانب أخذ عينات الدم المتسلسلة الآلية في الفئران الواعية والمتحركة بحرية وغير المضطربة. نصف أولا بروتوكول الجراحة التجسيمية لتوصيل ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) التي تعبر عن الفزع إلى مجموعات عصبية محددة. بعد ذلك ، نصف بروتوكول الشريان السباتي وقنية الوريد الوداجي والاتصال بعد الجراحة بنظام أخذ عينات الدم الآلي CULEX. أخيرا ، وصفنا بروتوكول الحقن الوريدي clozapine-N-oxide للتنشيط العصبي عن بعد وجمع الدم الآلي. تسمح هذه التقنية بأخذ عينات آلية مبرمجة كل 5 دقائق أو أكثر لفترة معينة ، إلى جانب حقن المواد في الوريد في نقطة زمنية أو مدة مرغوبة. بشكل عام ، وجدنا أن هذه التقنية هي نهج قوي للبحث في التحكم في الغدد الصم العصبية.
Introduction
يتم تنظيم محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والغدد التناسلية (HPG) مركزيا من خلال الإطلاق النابض للهرمون المطلق لموجهة الغدد التناسلية (GnRH) في نظام بوابة الغدة النخامية. في الغدة النخامية ، يتحكم GnRH في الإطلاق النبضي لموجهة الغدد التناسلية ، والهرمون اللوتيني (LH) ، والهرمون المنبه للجريب (FSH) إلى الدورة الدموية. يعمل إطلاق LH النابض كسمة مميزة لمحور HPG المركزي الذي يعمل1،2،3،4. على سبيل المثال ، يعرض آثار التغيرات الجينية أو التغيرات في العوامل الهرمونية أو البيئية على الجزء العصبي من المحور5،6،7. حتى وقت قريب ، كان قياس نمط نبض LH مقصورا على الثدييات الكبيرة8 والجرذان9 ، نظرا لارتفاع وتيرة أخذ العينات وأحجام الدم الكبيرة اللازمة لتحديد النبضات.
يعد اكتشاف نبضات الهرمون اللوتيني في الفئران أمرا مرغوبا فيه لأن هذا النوع لديه نماذج وراثية واسعة متاحة ويمكن التلاعب به بسهولة باستخدام تقنيات الهندسة الجينومية لمزيد من الدراسة لجينات ومجموعات خلايا معينة. في العقد الماضي ، سمح التقدم الكبير في تحليل تركيزات LH في الفئران باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم LH (ELISA) باكتشاف LH في كمية دقيقة من الدم10. أتاح تطوير تقنية أخذ عينات الدم المتكررة من طرف الذيل أخذ العينات المتكررة اللازمة للكشف عن تواتر وسعة نبضات LH في الفئران10,11. ومع ذلك ، يقتصر أخذ عينات الدم من طرف الذيل على استخدامه في المستيقظة الواعية. يتطلب فترة تدريب طويلة للفئران للتكيف مع المناولة ووجود محقق معين أثناء أخذ العينات. نجاحها شديد التأثر بالضغوطات البيئية وقد لا يكون مناسبا للاستخدام في سلالات الفئران التي تظهر مستويات عالية من القلق. كما تم استخدام القنية داخل الأذين لأخذ عينات الدم بشكل متكرر في الفئران الواعية التي تتحرك بحرية12. ومع ذلك ، لا يزال هذا الإعداد يتطلب أخذ عينات دم يدوية متكررة ويقيد مساحة حركة ، في حين أن القنية الأذينية يمكن أن تؤدي إلى تغييرات ديناميكية في وظيفة القلب. لذلك من المستحسن إنشاء طريقة لجمع الدم في ظل ظروف خالية من الإجهاد في الفئران الواعية والمتحركة بحرية ودون إزعاج دون الحاجة إلى تدريب مسبق أو التعامل أو الوجود البشري.
تم استخدام أخذ عينات الدم أو الديالة الآلية من قبل لقياس مستويات الهرمونات المختلفة (على سبيل المثال ، الميلاتونين13،14) وإفرازها النابض (على سبيل المثال ، هرمون النمو)15 في القوارض غير المقيدة. نقدم هنا بروتوكولا لأخذ عينات الدم المتكررة على المدى الطويل في الواعية وغير المقيدة ، إلى جانب التنشيط عن بعد في الوقت المناسب لمجموعات عصبية محددة باستخدام تقنيات كيميائية وراثية: المستقبلات المصممة التي يتم تنشيطها حصريا بواسطة الأدوية المصممة (DREADDs). سنصف التوصيل التجسيمي لناقل الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) والتنشيط عن بعد عن طريق التوصيل الوريدي الآلي (IV) لأكسيد كلوزابين-ن (CNO)16,17. يسمح هذا البروتوكول بالكشف المتسلسل عن المستويات القاعدية والتغيرات المستحثة في نبض الهرمون اللوتيني في متعددة في نفس الوقت. يتم إجراء كل من أخذ عينات الدم والتسليم الوريدي للمركب بطريقة يتم التحكم فيها بمرور الوقت عبر برنامج كمبيوتر يلغي الوجود المادي للمحقق أو الحاجة إلى تدريب مسبق على الفئران. تتغلب هذه الطريقة على القيود الرئيسية لأخذ عينات الدم اليدوية. يسمح بأخذ عينات الدم في حالة خالية من الإجهاد ، والتسليم المتزامن للمركب الوريدي إلى جانب التحكم في النشاط العصبي عن بعد. نعرض نتائج تمثيلية لاستخدام أخذ عينات الدم الآلي بمفرده أو مع تنشيط الخلايا العصبية عن بعد ونناقش مزاياها وقيودها واستخداماتها الإضافية.
Protocol
يتم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بالاتفاق مع دليل المجلس القومي للبحوث لرعاية واستخدام المختبر18 وكذلك القوانين الفيدرالية والولائية والمحلية. تم استخدام إناث الفئران البالغة (3-6 أشهر) لهذا العرض التوضيحي للبروتوكول ، بما في ذلك أربع إناث C57BL / 6J وأربعة Kiss1-Cre. ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) الإناث. تم احتجاز الفئران تحت دورة الضوء 12:12: الظلام ، والتحكم في درجة الحرارة عند 22 درجة مئوية ، وتغذت على نظام غذائي منخفض الاستروجين النباتي. تمت الموافقة على الإجراءات والبروتوكولات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ميشيغان (IACUC ، بروتوكولات: PRO00010420 و PRO00010138).
1. التسليم التجسيمي ل AAVs إلى مجموعة خلايا معينة
- التحضير للجراحة
- تعقيم جميع الأدوات. إعداد عبوات متعددة من الأدوات الجراحية لضمان استخدام كل عبوة في ما لا يزيد عن خمسة. إعداد قفازات معقمة ، على الأقل من زوج واحد لكل.
- اسحب الماصات الزجاجية الدقيقة للحقن باستخدام الإعدادات التالية (انظر جدول المواد) للماصات الدقيقة الرفيعة الطويلة التي تحقن ببطء وثبات ولا تسد بسهولة: الحرارة 1: 915 ، الحرارة 2: 630 ، السحب: 630. قم بتحسين هذه الإعدادات لكل ساحب.
- إجراء العمليات الجراحية في مكان جراحي مخصص. تطهير الأسطح الجراحية بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- استخدم الستائر المعقمة للحفاظ على عقم المجال الجراحي. ارتد معطف مختبر نظيفا أو ثوبا يمكن التخلص منه وقناعا.
- إعداد نظام التخدير بالاستنشاق. فتح إمدادات الأكسجين وتنظيم معدل التدفق إلى 0.8 لتر / دقيقة.
- جراحة
- ضع الماوس في صندوق التخدير وافتح الأيزوفلوران إلى 2.5٪. تقليل تدفق الأيزوفلوران إلى 2٪ بعد الحث الأولي ؛ الحفاظ على التدفق طوال العملية. للحصول على طرق بديلة للتخدير ، راجع بروتوكول وإرشادات اللجنة الأخلاقية المحلية.
- حقن مسكن وقائي (كاربروفين 5 ملغ/كغ من الأحماض المشبعة بالفلورسنت) وفقا لتوصية لجنة استخدام واللوائح المحلية.
- حلق رأس الماوس باستخدام كليبرز .
- قم بتثبيت على طاولة مجسمة ، ضع قضبان الأذن ، وتأكد من أن الرأس ثابت ومستقر بشكل صحيح. ثبت فم الفأرة على قطعة الفم ، مع التأكد من وضع اللسان على الجانب الخارجي من الفم لتجنب الاختناق.
- تحقق من أن قد تم تخديره بعمق بقرصة إصبع القدم قبل بدء الجراحة ومراقبة أنفاس الفأر ولونه طوال العملية.
- ضع دعامة الارتفاع تحت الماوس للحفاظ على مستوى الجسم والرأس في وضع أفقي. حافظ على دفء باستخدام وسادة دافئة مغطاة بالورق. ضع مرهم العين على كلتا العينين لتجنب الجفاف.
- حافظ على نظافة المنطقة الجراحية قدر الإمكان. ارتداء قفازات معقمة. تطهير رأس الفأر باليود والكحول قبل فتح الجلد. باستخدام مشرط ، قم بقص الجلد على الرأس على طول خط الوسط ، تقريبا من خلف العينين حتى خلف خياطة لامدا. حافظ على الجمجمة مكشوفة ونظفها بقطعة قطن مدمجة في كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪.
- ابحث عن الوريد الأنفي المنقاري (RRV) وقم بتمييزه بقلم رصاص معقم. استخدم المجسمة لبقية الإجراء.
ملاحظة: نحصل على نتائج أفضل باستخدام RRV كمرجع أمامي خلفي ، ولكن من المعتاد استخدام bregma كمرجع. - باستخدام إبرة معقمة كمرجع، تأكد من صحة اتجاه الدماغ قبل الشروع في القياسات المجسمة. تأكد أيضا من أن ارتفاعات سطح الجمجمة في RRV و lambda ، وكذلك الميل الجانبي ، هي نفسها (± 0.02 مم).
ملاحظة: يصبح الميل الجانبي أكثر ملاءمة للحقن في هياكل الدماغ الجانبية. - قم بتحميل ماصة زجاجية معقمة بالمحلول الفيروسي المراد حقنه. أحضره إلى مرجع RRV للمرجع 0 الأمامي الخلفي (AP). تقدم على طول الخيط السهمي إلى إحداثيات AP المفضلة. ضع علامة على هذا الموضع بقلم رصاص معقم ، وارفع الإبرة ، وانتقل إلى حج القحف.
- حفر بعناية دائرة صغيرة حول الموضع المحدد لتجنب كسر الجيب السهمي العلوي. ضع المثقاب في وضع مائل بدلا من وضع عمودي لتقليل الضغط أثناء الحفر. إزالة قطعة من الجمجمة مع ملقط صغير.
- بمجرد الكشف عن الأوعية الدموية ، استخدم منتصف الجيب السهمي العلوي لاستخدامه كمرجع متوسط (ML) (النقطة 0) ؛ هذا أكثر دقة من استخدام الخيط السهمي. انتقل إلى موضع ML المفضل. اخفض الماصة للمس الأم الجافية كمرجع ظهري بطني (DV) (النقطة 0). كسر قليلا dura-mater والنزول ماصة إلى موقف DV من اختيار.
- احقن الكمية المطلوبة من AAV (50-200 nL) واترك القنية في مكانها لمدة 3 دقائق للسماح بتشتت السائل الكافي. أخرج الماصة بعناية من الدماغ.
- حرر الماوس من قضبان الأذن. أغلق الجلد باستخدام المشابك الجراحية أو أي طريقة تختارها. ضع في قفص منفصل دافئ للتعافي. راقب الاسترداد والتفاعل والنشاط بعد استيقاظ الماوس. عند الاسترداد الكامل ، حرك الماوس مرة أخرى إلى قفصه الأصلي.
- انتظر لمدة لا تقل عن 3-4 أسابيع للتعبير الفيروسي قبل متابعة الجزء الثاني من الإجراء.
2. الوريد الوداجي والشريان السباتي
- التحضير للجراحة
- إجراء العمليات الجراحية في مكان جراحي مخصص. تطهير الأسطح الجراحية بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل بدء الإجراءات. إعداد عبوات متعددة من الأدوات الجراحية لضمان استخدام كل عبوة في ما لا يزيد عن خمسة.
- الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية. بعد ذلك ، نظف بالماء المعقم أو المالحة وقم بتطهير الأدوات باستخدام معقم حبة ساخنة لمدة 15 ثانية على الأقل (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) بين العمليات الجراحية.
- استخدم الستائر المعقمة للحفاظ على عقم المجال الجراحي. ارتد معطف مختبر نظيفا أو ثوبا يمكن التخلص منه وقناعا.
- تحضير القسطرة الدقيقة للقنية في الشريان السباتي والوريد الوداجي. قم ببناء قسطرة الشريان عن طريق ربط جزء صغير من أنابيب microrenathane (ممتدة من القطر الخارجي 0.025 بوصة [OD] × 0.012 بوصة القطر الداخلي [ID]) مع أنابيب السيلاستيك (0.025 بوصة OD × 0.012 بوصة ID). قم ببناء القسطرة الوريدية فقط باستخدام الأنابيب السيلاستية (0.025 بوصة OD × 0.012 بوصة معرف). نقع جميع القسطرة في 70٪ من الإيثانول طوال الليل قبل الجراحة.
- قم بتقطيع الأطراف المقطوعة لكلا القسطرة بزاوية 45 درجة إلى أطوال مقدرة مسبقا بناء على وزن جسم وطوله.
- العمليات الجراحية
- تخدير التي تقل عن 2٪ إيزوفلوران باستخدام نظام إيزوفلوران منخفض التدفق على سطح الطاولة للتحكم بدقة في مرحلة التخدير والمستوى أثناء الجراحة.
- حقن الجرعة الوقائية من المسكن (كاربروفين 5 ملغ/كغ s.c) وتطبيق مرهم العيون لمنع الجفاف وإصابات القرنية.
- حلق المناطق البطنية والخلفية من الرقبة ونظف البشرة بثلاثة مقشرات من اليود بالتناوب مع 70٪ من الإيثانول. قطع شق الجلد العمودي (12 مم) بين لوحي الكتف وتغطيته بشاش جراحي لاستخدامه لاحقا. ضع في وضع ضعيف مع الرأس نحو الجراح.
- استخدم نطاق تشريح ستيريو لمعظم أجزاء الإجراءات الموضحة أدناه.
- قم بعمل شق عمودي صغير (~ 10 مم) على الجانب الأيمن من الرقبة ، متفوقا على الترقوة لفضح الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي. قطع الجلد بالمقص وإجراء تشريح حاد لفصل الأنسجة تحت الجلد باستخدام ملقط دقيق غير مسنن مع نصائح دقيقة ، وفضح الوريد الوداجي الخارجي الأيمن والشريان السباتي المشترك الأيمن.
- اربط الطرف البعيد من الوريد الوداجي لوقف تدفق الدم وقطع ثقب صغير في الوريد المنهار باستخدام ملقط ومقص دقيق. أدخل القسطرة الوريدية المائلة لأسفل وبشكل قريب باستخدام زوج من الملقط الدقيق لدفعها عبر الوريد الأجوف العلوي للوصول إلى مستوى الأذين الأيمن. الطول المدرج هو ~ 10-12 مم للماوس العجاف 30 جم. اربط القسطرة لتثبيتها بالوعاء باستخدام خيوط حريرية 7-0.
ملاحظة: مع القسطرة في المكان المناسب ، يمكن سحب الدم بسهولة. خلاف ذلك ، قد تكون القسطرة في غير مكانها في الوريد الصدري الجانبي وتحتاج إلى إعادة إدخالها. - تشريح الأنسجة الضامة بعناية لكشف الشريان السباتي المشترك الأيمن الموجود في منطقة مثلثة محاطة بالعضلة القصية اللامية والعضلة القصية الخشائية والعضلات ثنائية المعدة. استخدم مبعدة أسلاك لفصل هذه العضلات إذا لزم الأمر. ربط الشريان على مستوى تشعب الشرايين السباتية الداخلية والخارجية باستخدام 7-0 خيوط الحرير. ضع حلقتين غير مقيدتين عن قرب.
- أوقف تدفق الدم مؤقتا عن طريق سحب حلقة خياطة موضوعة مسبقا وقطع أو ثقب ثقب صغير على جدار الوعاء الدموي باستخدام مقص صغير أو إبرة 27 جرام. أدخل القسطرة الشريانية المائلة لأسفل والقريبة من الطول المقدر مسبقا الذي يصل إلى قوس الشريان الأورطي ولكن دون لمس الصمام الأبهري. الطول المدرج هو ~ 9-10 مم للماوس العجاف 30 جم. اربط القسطرة لتثبيتها بالوعاء باستخدام الغرزات الموضوعة مسبقا.
- قم بنفق جميع القسطرة تحت الجلد وقم بإخراجها من الجزء الخلفي من الرقبة عبر شق مسبق القطع وضمها إلى المنافذ الوريدية أو الشريانية لموصل أنابيب مطلي بالسيليكون مصنوع من أنبوب إبرة 25 G: MASA19 المعدل باستخدام أنبوبين إبرة 25 G وأنبوبين 4.0 سم من أنابيب PE-20 ، بأكمام مع 2.0 سم من 0.062 بوصة أنبوب سيلاستيك معرف متصل بحلقة معدنية صغيرة مصنوعة من الأسلاك. إجمالي حجم التجويف لكل قسطرة بما في ذلك الموصل هو 6-8 ميكرولتر (الشكل 1 أ).
- أغلق الشق البطني وثبت الموصل تحت الجلد عند إغلاق الجلد الخلفي بالغرز. املأ كلا القسطرة بمحلول ملحي هيبارين (200 وحدة / مل) وقم بتوصيلهما بإحكام في النهاية بأسلاك جراحية من الفولاذ المقاوم للصدأ.
- تتعافى الفئران من تخدير الأيزوفلوران في غضون دقائق وتتعافى تماما من الجراحة في غضون 5 أيام. ضع في غرفة السكن الآلي لجمع الدم بعد 24 ساعة من الجراحة وقم بتوصيلها بالنظام عن طريق ربط خطاف الحبل الخاص بالنظام بالحلقة المعدنية المتصلة بموصل الأنبوب المزروع في الجزء الخلفي من الرقبة. قم بتوصيل القسطرة الشريانية والوريدية بخطوط الحقن وأخذ العينات ، على التوالي ، قبل 24 ساعة من بدء أخذ العينات (الشكل 1 ب) . يبلغ الطول الإجمالي لخط أخذ العينات 55 سم أو 40 ميكرولتر من حجم التجويف.
ملاحظة: تم وصف إعدادات خطوط الحقن وأخذ العينات ، وبرمجة طريقة الجمع ، وآليات توازن القفص لنظام أخذ عينات الدم الآلي بالتفصيل20،21. يحافظ النظام على القسطرة مفتوحة عن طريق توصيل 10 ميكرولتر من محلول ملحي الهيبارين تلقائيا كل 20 دقيقة. - اضبط وقت وتكرار أخذ العينات قبل الحقن والحقن وما بعد الحقن عبر برنامج الكمبيوتر الخاص بالنظام. راجع الخطوة 3.1 أدناه لمعرفة الإعدادات الحالية.
- يسمح النظام للحيوان بالتحرك بحرية دون تشابك خطوط أخذ العينات و / أو التسريب عن طريق استشعار حركة الماوس أثناء تدوير غرفة السكن في اتجاه معاكس لحركة الماوس21 (الشكل 1).
- أعد ملء خط التسريب أو الحقن بالمركب وأعد توصيله بالقسطرة الوريدية قبل 2 ساعة على الأقل من بدء التسريب أو الحقن.
ملاحظة: قد تحدث مضاعفات الجراحة ، ويجب مراقبة الحيوانات عن كثب للتعافي وفي الأيام التالية للجراحة. ارجع إلى بروتوكول للمراقبة الصحيحة ومتطلبات الإنهاء والإجراءات.
3. جمع الدم الآلي والحقن في الوريد
- جمع الدم الآلي
- لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم حجم أخذ عينات يبلغ 20.0 ميكرولتر وقم بتعيين فاصل زمني (أي 7.0 دقيقة) بين كل عينة للحصول على تردد أخذ العينات كل 10.0 دقيقة لكل عينة. الحد الأقصى للمعدل هو أخذ العينات بشكل مستمر عند 3.0 دقيقة / عينة ؛ الحد الأدنى الممكن لحجم أخذ العينات هو 5.0 ميكرولتر. يتم إعادة كمية متساوية من المحلول الملحي تلقائيا بواسطة النظام لاستبدال عينة الدم والحفاظ على توازن سوائل الجسم.
- اضبط إجمالي وقت أخذ العينات على 30 (t = -30 - 0) دقيقة قبل و 30 (t = 0 - 30) دقيقة بعد الحقن الوريدي ل CNO (0.5 مجم / كجم ، الشكل 2).
- يتم تخفيف كل عينة دم تم جمعها (20.0 ميكرولتر) تلقائيا في 50 ميكرولتر من المحلول الملحي (تحتوي على الهيبارين عند 10 وحدة / مل) وتخزينها بشكل فردي في أنبوب دقيق يحتفظ به النظام في دائري عينة مبرد.
- الحقن الآلي في الوريد
- افصل الخط الوريدي عن القسطرة الوريدية لإعادة ملء CNO (الجرعة المحسوبة بشكل فردي بحجم ~ 50-60 ميكرولتر عند 0.5 مجم / كجم) على الأقل 2 ساعة قبل بدء أخذ عينات الدم.
- اسحب المحلول يدويا (أكثر بقليل من الحجم المحسوب) من الخط بأثر رجعي باستخدام حقنة الحقن ، تاركا فقاعة هواء صغيرة بين المحلول والمحلول الملحي الموجود في الخط.
- أعد توصيل خط الحقن بالقسطرة الوريدية واضبط معدل الحقن على 500 ميكرولتر / دقيقة ووقت بدء الحقن عند 2 دقيقة بعد انتهاء أخذ العينات t = 0. إجمالي وقت الحقن لكل هو 5-6 ثوان.
ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن أيضا توصيل المركب عن طريق الحقن اليدوي داخل الصفاق (IP) ، ولكن هذا سيتطلب إزعاج أثناء أو قبل بروتوكول جمع الدم. نعرض أيضا هذا البديل في النتائج.
4. نضح وجمع الدماغ (اختياري)
ملاحظة: يجب اتباع هذا الإجراء فقط إذا كان الدماغ مطلوبا لتحليل موقع الدماغ لتنشيط الخلايا العصبية أو استجابات المصب.
- افصل الماوس عن نظام جمع الدم في نهاية بروتوكول الجمع. بعد ساعتين من الحقن في الوريد ، تابع لتغذية بنسبة 10٪ من الفورمالين المخزن المحايد (NBF) ، باستخدام الطريقة المفضلة أو كما هو موضح في مكان آخر22.
- تشريح الدماغ والحفاظ عليه في 20 ٪ السكروز في 10 ٪ -NBF لمدة 3 ساعات لمواصلة التثبيت.
- بعد 3 ساعات ، انقل الدماغ الثابت إلى 20٪ سكروز في برنامج تلفزيوني واحفظه عند 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للتقسيم.
ملاحظة: تجنب التثبيت الزائد لأن هذا سيخفي مستضدات cFOS. في محلول السكروز 20 ٪ ، يجب أن يغرق الدماغ في قاع الحاوية. - قم بعمل أقسام باستخدام ميكروتوم متجمد أو cryostat واستخدم الطريقة المفضلة للنظر في التنشيط العصبي (على سبيل المثال ، يتم عرض الكيمياء الهيستولوجية المناعية cFOS).
ملاحظة: يتم وصف الأجسام المضادة المستخدمة للنتائج الحالية في جدول المواد.
5. معالجة العينات وتحليلها
- قم بإزالة عينات الدم من جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي فور انتهاء التجربة ووضعها على الثلج.
- أدر العينات عند 14000 × جم لمدة 30 ثانية.
- جمع البلازما. قم بتخزينه في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
- فحص عينات الدم بواسطة LH ELISA كما هو موضح قبل10,23.
Representative Results
الخلايا العصبية المعبرة عن Kisspeptin (جين Kiss1) الموجودة في النواة المقوسة لمنطقة ما تحت المهاد هي محفز قوي ل GnRH ، وبالتالي ، من إطلاق LH من الغدة النخامية24,25. في هذا العرض التوضيحي للبروتوكول ، استخدمنا إفراز LH الناجم عن كيسبيبتين لتوضيح عمل تقنية أخذ عينات الدم الآلية. يوضح الشكل 2 أنماط LH التمثيلية في إناث Kiss1-eYFP البالغة التي تلقت سابقا حقنة مجسمة أحادية الجانب من AAV-hM3Dq-mCherry في النواة المقوسة (AP: -4.95 ، ML: -0.35 ، DV: -5.7). تم استخدام ChR2-eYFP كمراسل فلوري لخلايا Kiss1. بعد شهر واحد من الجراحة التجسيمية ، خضعت الفئران للشريان السباتي وقنية الوريد الوداجي وتم توصيلها بجهاز أخذ عينات الدم الأوتوماتيكي بعد 4 أيام من الجراحة. بدأت عمليات جمع الدم لتحديد مستويات الهرمون اللوتيني القاعدي في اليوم التالي بتردد أخذ العينات لمدة 10 دقائق (فاصل زمني قدره 7 دقائق بين العينات و 3 دقائق / أخذ العينات) متبوعا بحقن CNO الوريدي الآلي وأخذ عينات الدم المستمر كل 10 دقائق لمدة 30 دقيقة. مستويات LH المميتة منخفضة بشكل عام (الشكل 2 أ) ، ولكن عادة ما يتم ملاحظة الاختلافات بسبب إطلاقها النابض (الشكل 2 ب). بعد حقن CNO (وتنشيط الخلايا العصبية kisspeptin) ، كان الارتفاع في LH حادا (في غضون 10 دقائق). يعتمد مستوى الزيادة ومدة الذروة على العديد من العوامل ، بما في ذلك موقع الحقن ، وعدد الخلايا العصبية التي تم تنشيطها ، أو السكان المستهدفين.
يوضح الشكل 3 موقع الحقن في الدماغ في النواة المقوسة لأنثى الفأر الممثلة في الشكل 2 أ. يتم تمييز الخلايا العصبية Kiss1-eYFP باللون الأخضر ، بينما يظهر النشاط المناعي mCherry موقع حقن AAV والتنشيط بعد CNO. تم الكشف عن الخلايا العصبية المنشطة باستخدام التفاعل المناعي cFOS ، المسمى ب DAB. تزامنت معظم الخلايا العصبية mCherry مع Kiss1-eYFP ، وأظهر العديد منها تفاعلا مناعيا cFOS ، مما يدل على أن التنشيط الفيروسي والعصبي كان خاصا بالسكان المستهدفين.
يظهر الشكل 4 نمطا نابضا تمثيليا للإفراز LH في الفئران من النوع البري المتوحش (C57BL / 6J) متبوعا بالاستجابة لحقن IP من kisspeptin-10. خضع الفأر لقنية الشريان السباتي وتم توصيله بنظام أخذ عينات الدم التلقائي بعد 4 أيام من الجراحة. في صباح اليوم التالي ، تم فحص الدورات الشحمية وتم إجراء جمع الدم وحقن kisspeptin-10 في اليوم26 الوحشي. تم جمع عينات الدم كل 7 دقائق لمدة 2 ساعة (فاصل زمني 4 دقائق ، بالإضافة إلى 3 دقائق / أخذ العينات لمدة 120 دقيقة قبل الحقن) لتحديد مستويات خط الأساس ونبض LH ، تليها حقنة IP من kisspeptin-10 (65 ميكروغرام / كجم) واستمرار جمع الدم كل 7 دقائق لمدة 30 دقيقة إضافية. لوحظت نبضات LH واضحة نموذجية للإناث في ديستروس ، تظهر مستويات LH القاعدية المنخفضة ، وتردد النبض ~ 2 نبضة / ساعة ، وسعة النبض ~ 1 نانوغرام / مل27. تم الكشف عن زيادة فورية وقوية في LH استجابة لإدارة كيسبيبتين28. تتفق أنماط إفراز الهرمون اللوتيني والتغيرات بعد التحفيز مع دراسات أخرى تستخدم جمع الدم اليدوي10،27،29،30. توضح هذه النتائج أن طريقة أخذ عينات الدم الآلية تلتقط إفراز LH النموذجي والمحفز في ظل ظروف خالية من الإجهاد.
الشكل 1: تفاصيل نظام الموصل ووصلات الماوس بأنابيب نظام التسريب وأخذ العينات. (أ) موصل أنابيب مطلي بالسيليكون (MASA) تم إنشاؤه باستخدام أنبوبين إبرة 25G وأنبوبين PE-20 ، بأكمام في أنبوب سيلاستيك متصل بحلقة معدنية صغيرة. ب: فأر متصل بأنبوب التسريب وأخذ العينات في قفص أخذ العينات، ويستريح في عشه أثناء أخذ عينات الدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية لنبضات LH في إناث الفئران Kiss1-Cre المحقونة ب AAV-hM3Dq في النواة المقوسة وتنشيطها عن بعد باستخدام CNO. تم قياس مستويات LH القاعدية كل 10 دقائق لمدة نصف ساعة. في الوقت 0 بعد جمع الدم ، تلقت الأنثى حقنة في الوريد من كلوزابين-N-أكسيد (0.5 ملغم / كغم) واستمر جمع الدم من الشريان السباتي كل 10 دقائق لمدة نصف ساعة إضافية. (أ) يظهر أنثى ذات مستويات LH قاعدية منخفضة. (ب) تظهر أنثى تعرض حقنا أوليا بنبض الهرمون اللوتيني. الاختصارات: Kiss1 = كيسبيبتين. AAV = فيروس مرتبط بالغدي ؛ CNO = كلوزابين-N-أكسيد ؛ LH = هرمون اللوتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تنشيط الدماغ في النواة المقوسة ل Kiss1-Cre ؛ Chr2-eYFP (Kiss1-eYFP) أنثى ممثلة في الشكل 2 أ. تم استخدام ChR2-eYFP فقط كجين مراسل لتسمية الخلايا العصبية kiss1. (أ) صورة مضان منخفضة التكبير توضح موقع حقن AAV في النواة المقوسة. الأخضر: النشاط المناعي eYFP ، أرجواني: mCherry المناعي. (ب) صورة حقل ساطع منخفضة التكبير للمنطقة المقابلة للشكل 3 أ ، توضح النشاط المناعي cFOS (أسود) في موقع حقن AAV في نواة Arcuate. (ج) صورة مضان عالية التكبير وصورة برايت فيلد مجتمعة تظهر نظرة فاحصة للخلايا العصبية في الشكل 3 أ ، ب. الخلايا العصبية Kiss1-eYFP التي تعبر عن AAV-mCherry التي تم تنشيطها هي تلك التي تحتوي على سيتوبلازم أبيض ونواة سوداء (أسهم). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر (أ ، ب) ، 20 ميكرومتر (ج). الاختصارات: Kiss1 = كيسبيبتين. AAV = فيروس مرتبط بالغدي ؛ eYFP = بروتين فلوري أصفر محسن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نبض LH القاعدي في أنثى من النوع البري الوحشي يقاس كل 7 دقائق لمدة 2 ساعة. ثم تلقت الأنثى حقنة داخل الصفاق من كيسبيبتين -10 (65 ميكروغرام / كجم) في الوقت 0 ، وتم جمع عينات الدم باستمرار كل 7 دقائق لمدة نصف ساعة. اختصار: LH = هرمون اللوتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
باستخدام هذا البروتوكول ، تمكنا من إظهار نبض LH القاعدي وإفراز LH بعد تحفيز مجموعة الخلايا العصبية. المزايا العظيمة للنظام هي البيئة الخالية من الإجهاد التي يتم فيها أخذ العينات ، مع عدم وجود بشري أو التعامل أثناء أخذ عينات الدم. بالإضافة إلى ذلك ، لم تكن هناك حاجة إلى تدريب حيواني شاق مسبق والتكيف مع الوجود البشري أو التعامل معه أثناء التجربة. تطلبت التجارب السابقة باستخدام أخذ عينات الدم اليدوية قدرا كبيرا من الوقت والجهد لتقليل الضغوطات7،31،32. ومع ذلك ، فإن قطع الذيل وحده هو ضغوط33. قد يكون تنفيذ بيئة غير مرهقة ونموذج تدريب في مرافق المشتركة ، حيث لا يمكن التنبؤ بالانقطاعات ، قيدا أيضا. في بعض المختبرات ، غالبا ما تحتاج إلى نقلها إلى غرف إجراءات بديلة لأخذ عينات الدم. قد تجعل هذه القيود الطريقة اليدوية غير مناسبة للكشف عن التغييرات الطفيفة في مستويات LH ، وبالتالي ، يمكن أن يكون نهج عدم التدخل مفيدا في هذه المواقف. يتم وضع العينات الآلية في غرفة هادئة حيث يتم وضع الفئران قبل عدة أيام للتأقلم مع البيئة الجديدة. قدمت تجربتنا السابقة مع هذا البروتوكول كشفا دقيقا عن أنماط إفراز الكورتيكوستيرون وهرمون النمو النابض في الفئران ، ولم تظهر مستويات مرتفعة من الكورتيكوستيرون أثناء أخذ العينات الآلية15. في التجارب الحالية ، تم تكييف جميع بشكل جيد مع نظام أخذ العينات الذي يظهر بناء العش في غرفة أخذ العينات بعد ~ 24 ساعة ولون الشعر الساطع ، مما يشير إلى نقص الإجهاد والحالة الصحية الجيدة بشكل عام (الشكل 1).
ربما تكون الصعوبة الرئيسية التي تؤدي إلى نتائج سلبية هي الاستهداف غير المناسب ل AAV للسكان الخلايا العصبية المطلوبة. الدقة في الحقن المجسمة أمر ضروري ويجب أن يتم التدريب مسبقا للتحقق من الإحداثيات وأحجام الحقن. يمكن إجراء التدريب عن طريق حقن كمية صغيرة من 0.5-1٪ Evans Blue في الموقع المطلوب في جراحة عدم التعافي ثم أخذ شريحة من الدماغ الذي تم تشريحه حديثا باستخدام مصفوفة دماغ الفأر (على سبيل المثال ، Ted Pella) للتحقق من موقع وحجم الحقن باستخدام مجسم.
من المهم أيضا مراعاة أن الدم والبلازما التي يتم جمعها من نظام أخذ عينات الدم الآلي سيتم تخفيفها في محلول ملحي هيبارين (على سبيل المثال ، 20 ميكرولتر من الدم في 50 ميكرولتر من المحلول الملحي في نتائجنا)20 ، وقد تحتاج نسبة التخفيف إلى تعديلها لحساسية الطريقة التحليلية المختارة. اختبرنا مستويات الهرمون اللوتيني في الدم الكامل المخفف في BSA-PBS (على النحو الموصى به ل LH ELISA فائق الحساسية)10 أو محلول ملحي ولم نجد أي اختلافات في قيم الهرمون اللوتيني. لا يمكن استخدام توين في المادة المخففة لأن هذا سوف ينتشر في نظام الدم لاستخراج العينات عن طريق استبدال سوائلالعينة 20. في تجربتنا ، أعطت التخفيفات الأقل من 1:10 نتائج جيدة ل LH ولكنها قللت قليلا من مستويات LH مقارنة ب 1: 3.5. يشير هذا إلى أنه يمكن تعديل التخفيف بشكل أكبر لتقليل كمية الدم التي يتم جمعها ، إذا لزم الأمر.
بديل للتسليم الآلي للمركب هو إجراء الحقن اليدوي عبر القسطرة الوريدية. في هذه الحالة ، يكون المحقق حاضرا لفترة وجيزة في الغرفة لتسليم الحقن. ومع ذلك ، لا يوجد اتصال مباشر مع أو مساكنها والمناطق المحيطة بها ، وعلى عكس الحقن داخل الصفاق أو تحت الجلد ، غالبا ما يكون الإجراء بأكمله دون أن يلاحظه أحد. وتتمثل مزايا الحقن اليدوي في أن التخفيف المركب لا يحتاج إلى إعداده مسبقا، وهو ما قد يكون حاسما بالنسبة للمركبات المكلفة للغاية بحيث لا يمكن استخدامها بكميات أكبر أو الحساسة للتحلل بمرور الوقت؛ نظرا لأن حجم التشغيل أصغر منه في التسليم الآلي ، حيث يجب ملء خط التسريب والقسطرة مسبقا بمحلول أكثر مركبا.
يوفر أخذ عينات الدم التلقائي فرصة فريدة لدراسة تغيرات الهرمون اللوتيني أثناء النوم على سبيل المثال. لقد لاحظنا بانتظام التي تنام في أعشاشها أثناء وقت أخذ العينات. من الممكن ربط هذه العينات بتسجيلات EEG لإنشاء تحليل أكثر تفصيلا للعلاقة بين النشاط العصبي ونمط LH34. كما هو موضح هنا ، فإن إمكانيات استخدام أخذ عينات الدم الآلية كثيرة: من أخذ عينات LH القاعدية إلى اختبار استجابة LH للمركبات الداخلية أو الخارجية ، أو لتنشيط أو قمع المجموعات العصبية. يمكن تنفيذ التلاعب بالخلايا العصبية بشكل حاد باستخدام علم الوراثة الكيميائي أو علم البصريات الوراثي ، أو بشكل دائم باستخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا وأدوات إسكات الخلايا المبرمج أو الخلايا العصبية. يسمح أخذ عينات الدم الآلي أيضا بقياس الهرمونات الأخرى ذات الأنماط الإفرازية شديدة النبض (على سبيل المثال ، هرمون النمو15). في إناث الفئران ، إذا كانت هناك حاجة إلى مرحلة معينة من الدورة الشبقية ، يمكن جمع اللطاخات المهبلية بعناية قبل ساعات من بدء البروتوكول26 دون تعطيل خطوط التسريب وأخذ العينات. يمكن توصيل بنظام أخذ العينات لمدة 7-10 أيام مع زيادة خطر تخثر الخط الشرياني مع مرور الوقت.
ومع ذلك ، تقتصر هذه التقنية على الاستخدام في ذات المنزل الواحد ، وبالتالي قد لا تكون مناسبة لدراسة التفاعلات الاجتماعية. كما أنه غازي ويتطلب جراحة صعبة تقنيا ، لذلك قد لا يكون من الممكن تنفيذه مع اليافعة أو نماذج مرضية معينة. أخيرا ، نظرا لأن تكلفة شراء النظام قد تكون مرتفعة للغاية بالنسبة لمختبر أبحاث واحد ، فمن المستحسن إعداده في مختبر أساسي يقدم البروتوكول التجريبي المذكور كخدمات.
في الختام ، يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء التسليم التجسيمي ل AAV جنبا إلى جنب مع أخذ عينات الدم الآلي. إن التحكم المكاني والزماني الدقيق الذي تم تحقيقه باستخدام هذه التقنية ، إلى جانب مرونتها في التطبيق على النماذج المختلفة وبروتوكولات القياس والهرمونات ، يجعلها طريقة قوية لدراسة التنظيم الهرموني في القوارض. الأهم من ذلك ، توفر الطريقة بيئة خالية من الإجهاد من خلال القضاء على الوجود البشري والتعامل معه أثناء الحقن و / أو أخذ العينات ، والتدريب الحيواني المسبق. هذه المزايا ، إلى جانب إمكانية تعدد الإرسال ، تجعل هذه الطريقة أداة فريدة لدراسة التحكم العصبي في التغيرات الهرمونية في الفئران الواعية والمتحركة بحرية وغير المضطربة.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتور دانيال هايزنليدر على مساعدته في اختبار طرق تخفيف الدم المختلفة. تم إجراء فحوصات هرمون المصل في مركز جامعة فيرجينيا للأبحاث في فحص وتحليل التكاثر الأساسي بدعم من HD102061 يونيس كينيدي شرايفر NICHD Grant R24. يتم دعم مركز ميشيغان للتنميط الظاهري الأيضي للفأر من قبل NIH Center Grant U2C DK135066. يتم دعم JF و NQ من خلال منح DK020572 (MDRC) و DK089503 (MNORC). يتم دعم CFE و CSM من خلال منحة NICHD R21 HD109485 و R01 HD096324.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Not necessarily this virus but this was the one used for representative results |
| Alcohol | Disinfection | ||
| Anesthesia Induction box | Vetequip | ||
| Anesthesia induction machine | Kent Scientific Equipment | SomnoSuite | |
| Anesthesia masks for mice | Kent Scientific Equipment | SOMNO-0801 | |
| Autoclip applier 9 mm | Clay Adams | 427630 | |
| Autoclip remover 9 mm | Clay Adams | 427637 | |
| Autoclips 9 mm | Clay Adams | 427631 | |
| BASi Culex Controller | Culex | SN: 2151, 2152, 2156, 2158 | 4 stations |
| BASi Honey Comb Fraction Collector | Honey Comb | SN: 2105, 2106, 2107, 2108 | 4 stations |
| BASi Ratrun Rotation Control | RATURN 2 | SN: 5680, 5681, 5682, 5683 | 4 stations |
| C57BL/6J mice | JAX # 000664 | ||
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl | Analgesic |
| Clippers | Braun | ||
| Clozapine-N-oxide | ENZO | BLM-NS105-0005 | |
| Cotton tipped applicators | |||
| CULEX Automated In Vivo Sampling System | BASi | DS000627 | with CX-4000S Replacement Tubing Sets |
| Curved forceps serrated | FST | 11151-10 | |
| Drill | Dremel | 61100 | |
| Empis control Module | EMPIS CM | SN: 174 | |
| Empis Programmable Infusion System | EMPIS | SN: 2125 , 2126, 2127, 2128 | With CX-7010S 4 BAS-2 Infusion Sets; 4 stations |
| Envigo 2016 diet | low-phytoestrogen diet | ||
| Eye ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment | Petrolatum Ophtalmic oinment |
| Glass pipettes | World Precision Instruments | MIB100-6 | |
| Hemostats | Roboz Surgical | RS-7101 | |
| Iodine | Betadine Surgical scrub | ||
| Isoflurane | VetOne | Fluriso | Anesthetic |
| Isoflurane Vaporizer or SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Surgivet or Kent Scientific Corp | SS-01 | Anesthesia Machine |
| Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) mice | JAX # 023436 and #024109 | ||
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals | 048-56 | |
| Micro-renathane tubing | Braintree Scientific | MRE025 | Surgical catheterization |
| Micro-Scissors | Roboz Surgical | RS-5606 | |
| Needle Holder | Roboz Surgical | RS-7842 | |
| Picoliter injector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P30 | |
| Rodent Warmer X2 | Stoelting | 53850 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 | |
| Scissors | Roboz Surgical | RS-6808 | |
| Silicon tubing | Liveo Laboratory Tubing | NO.508-001 | 0.012 in I.D x 0.025 in O.D. |
| Stereotaxic table | RWD | E06208 | |
| Sterile 0.9% saline | Baxter | 2F7124 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical blades | SKLAR | 06-3011 | |
| Surgical stereoscope | Zeiss | f-160 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4972 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-5058 | |
| Antibodies | |||
| Anti-cFos | Millipore | ABE457 | Antigen target: N-terminus cFos; Host organism: Rabbit; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2631318 |
| Anti-GFP | Aves Labs | GFP-1010 | Antigen target: recombinant GFP null; Host organism: Chicken; Dilution used: 1:10,000; RRID: AB_2307313 |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs | 711-065-152 | Antigen target: Rabbit IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:1,000; RRID: AB_2340593 |
| Donkey anti-Rat IgG, AlexaFluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21209 | Antigen target: Rat IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2535795 |
| Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | Antigen target: Chicken, IgY (H+L); Host organism: Goat; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2534096 |
| mCherry monoclonal (16D7) | Thermo Fisher Scientific | M11217 | Antigen target: mCherry tag; Host organism: Rat; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2536611 |
References
- Kokoris, G. J., Lam, N. Y., Ferin, M., Silverman, A. J., Gibson, M. J. Transplanted gonadotropin-releasing hormone neurons promote pulsatile luteinizing hormone secretion in congenitally hypogonadal (hpg) male mice. Neuroendocrinology. 48 (1), 45-52 (1988).
- Coquelin, A., Desjardins, C. Luteinizing hormone and testosterone in young and old male mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 243 (3), E257-E263 (1982).
- Carmel, P. W., Araki, S., Ferin, M. Pituitary stalk portal blood collection in rhesus monkeys: Evidence for pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH). Endocrinology. 99 (1), 243-248 (1976).
- Schuiling, G., Gnodde, H. Site of origin of the pulsatile secretion of luteinizing hormone in long-term ovariectomized rats. Journal of Endocrinology. 70 (1), 97-104 (1976).
- Hackwell, E. C. R., Ladyman, S. R., Brown, R. S. E., Grattan, D. R. Mechanisms of lactation-induced infertility in female mice. Endocrinology. 164 (5), 1-12 (2023).
- Bahougne, T., Kretz, M., Angelopoulou, E., Jeandidier, N., Simonneaux, V. Impact of circadian disruption on female mice reproductive function. Endocrinology. 161 (4), (2020).
- Kreisman, M. J., McCosh, R. B., Tian, K., Song, C. I., Breen, K. M. Estradiol Enables Chronic Corticosterone to Inhibit Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion and Suppress Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Neuroendocrinology. 110 (6), 501-516 (2020).
- Moenter, S. M., Evans, N. P. Gonadotropin-releasing hormone GnRH measurements in pituitary portal blood. Journal of Neuroendocrinology. 34 (5), 13065 (2022).
- Maeda, K. I., et al. The LHRH pulse generator: A mediobasal hypothalamic location. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 19 (3), 427-437 (1995).
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
- Minabe, S., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K. Analysis of pulsatile and surge-like luteinizing hormone secretion with frequent blood sampling in female mice. Journal of Reproduction and Development. 57 (5), 660-664 (2011).
- Perreau-Lenz, S., Kalsbeek, A., Pévet, P., Buijs, R. M. Glutamatergic clock output stimulates melatonin synthesis at night. European Journal of Neuroscience. 19 (2), 318-324 (2004).
- Herwig, A., Pévet, P., Bothorel, B., Steinlechner, S., Saboureau, M. Trans-pineal microdialysis in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): A tool to study seasonal changes of circadian clock activities. Journal of Pineal Research. 40 (2), 177-183 (2006).
- Adams, J. M., Otero-Corchon, V., Hammond, G. L., Veldhuis, J. D., Qi, N., Low, M. J. Somatostatin is essential for the sexual dimorphism of GH secretion, corticosteroid-binding globulin production, and corticosterone levels in mice. Endocrinology. 156 (3), 1052-1065 (2015).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).
- Krashes, M. J., et al. reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eighth edition. National Research Council. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188 (2011).
- Peters, S., et al. Culex ABS Part I: Introduction to automated blood sampling. Current Separations. 18 (4), 139-145 (2000).
- Bohs, C., Cregor, M., Gunaratna, G., Kissinger, C. Culex Automated blood sampler part II Managing freely-moving animals and monitoring their activity. Current Separations. 18 (4), 147-151 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kreisman, M. J., Mccosh, R. B., Breen, K. M. A Modified ultra-sensitive ELISA for measurement of LH in mice. Endocrinology. 163 (9), (2022).
- Pielecka-Fortuna, J., Chu, Z., Moenter, S. M. Kisspeptin acts directly and indirectly to increase gonadotropin-releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by estradiol. Endocrinology. 149 (4), 1979-1986 (2008).
- Kumar, D., et al. Specialized subpopulations of kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in female mice. Endocrinology. 156 (1), 32-38 (2015).
- Caligioni, C. S.
- Czieselsky, K., et al. Pulse and surge profiles of luteinizing hormone secretion in the mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Wang, L., et al. Genetic dissection of the different roles of hypothalamic kisspeptin neurons in regulating female reproduction. eLife. 8, 43999 (2019).
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), e57894 (2018).
- Vanacker, C., Defazio, R. A., Sykes, C. M., Moenter, S. M. A role for glial fibrillary acidic protein (Gfap)-expressing cells in the regulation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) but not arcuate kisspeptin neuron output in male mice. eLife. 10, e68205 (2021).
- Dulka, E. A., Defazio, R. A., Moenter, S. M. Chemogenetic suppression of GnRH neurons during pubertal development can alter adult GnRH neuron firing rate and reproductive parameters in female mice. eNeuro. 7 (3), 0223 (2020).
- Talbi, R., et al. Characterization of the Action of Tachykinin Signaling on Pulsatile LH Secretion in Male Mice. Endocrinology. 162 (8), 1-9 (2021).
- Tuli, J., Smith, J., Morton, D. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animals. 29 (1), 90-95 (1995).
- Lucien, J. N., Ortega, M. T., Shaw, N. D.
