Summary
Luteiniserende hormon (LH) pulsatilitet er et kendetegn ved reproduktiv funktion. Vi beskriver en protokol til fjernaktivering af specifikke neuronale populationer forbundet med seriel automatiseret blodindsamling. Denne teknik tillader tidsbestemt hormonmodulering, multiplexing og minimering af manipulationseffekter på LH-niveauer i bevidste, frit bevægelige og uforstyrrede dyr.
Abstract
Cirkulerende luteiniserende hormon (LH) niveauer er et væsentligt indeks for funktionen af hypothalamus-hypofyse kontrol af reproduktion. Rollen af talrige input og neuronale populationer i moduleringen af LH-frigivelse er stadig ukendt. Måling af ændringer i LH-niveauer hos mus er ofte en udfordring, da de let forstyrres af miljøstress. Nuværende teknikker til måling af LH-frigivelse og pulsatilitet kræver langsigtet træning for mus at tilpasse sig manipulationsstress, visse tilbageholdenhed, tilstedeværelsen af efterforskeren og arbejde på individuelle dyr, hvilket reducerer dets anvendelighed til mange forskningsspørgsmål.
Dette papir præsenterer en teknik til fjernaktivering af specifikke neuronale populationer ved hjælp af Designer Receptor Exclusive Activated by Designer Drugs (DREADD'er) teknologi kombineret med automatiseret sekventiel blodprøvetagning i bevidste, frit bevægelige og uforstyrrede mus. Vi beskriver først den stereotaxiske kirurgiprotokol for at levere adeno-associerede virusvektorer (AAV), der udtrykker DREADD'er til specifikke neuronale populationer. Dernæst beskriver vi protokollen for halspulsåre og jugular venekanylering og postkirurgisk forbindelse til CULEX automatiseret blodprøvetagningssystem. Endelig beskriver vi protokollen for clozapin-N-oxid intravenøs injektion til fjernneuronal aktivering og automatiseret blodindsamling. Denne teknik giver mulighed for programmeret automatiseret prøveudtagning hvert 5. minut eller længere i en given periode kombineret med intravenøs stofinjektion på et ønsket tidspunkt eller varighed. Samlet set fandt vi, at denne teknik var en stærk tilgang til forskning i neuroendokrin kontrol.
Introduction
Hypothalamo-hypofyse-gonadal (HPG) aksen reguleres centralt af den pulsatile frigivelse af gonadotropinfrigivende hormon (GnRH) i hypofyseportalsystemet. I hypofysen, GnRH styrer pulserende frigivelse af gonadotropiner, luteiniserende hormon (LH), og follikelstimulerende hormon (FSH) til kredsløbssystemet. LH pulserende frigivelse tjener som et kendetegn for central HPG-akse, der fungerer 1,2,3,4. For eksempel viser det virkningerne af genetiske ændringer eller ændringer i hormonelle eller miljømæssige faktorer på den neurale del af aksen 5,6,7. Indtil for nylig var måling af LH-pulseringsmønsteret begrænset til store pattedyr8 og rotter9 på grund af den høje prøveudtagningsfrekvens og store blodvolumener, der er nødvendige for at identificere impulserne.
Det er ønskeligt at detektere LH-pulser hos mus, da denne art har brede genetiske modeller til rådighed og let kan manipuleres ved hjælp af genomiske tekniske teknologier til yderligere undersøgelse af specifikke gener og cellepopulationer. I det sidste årti har et stort fremskridt i analysen af LH-koncentrationer hos mus ved hjælp af et sandwich LH-enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) gjort det muligt at detektere LH i en lille mængde blod10. Udviklingen af teknikken med hyppig blodprøvetagning i halespidserne har muliggjort den nødvendige hyppige prøveudtagning til påvisning af hyppigheden og amplituden af LH-impulser hos mus10,11. Imidlertid er blodprøvetagning fra halespidsen begrænset til dets anvendelse hos bevidste vågne dyr; Det kræver en lang træningsperiode for mus at tilpasse sig håndteringen og tilstedeværelsen af en udpeget investigator under prøveudtagningen. Dens succes er meget modtagelig for miljømæssige stressfaktorer og er muligvis ikke egnet til brug i musestammer, der viser høje niveauer af angst. Intraatriel kanylering er også blevet brugt til hyppig blodprøvetagning i frit bevægelige bevidste mus12. Denne opsætning kræver dog stadig gentagen manuel blodprøvetagning og begrænser dyrs bevægelsesplads, mens atriekanylering kan føre til dynamiske ændringer i hjertefunktionen. Det er derfor ønskeligt at etablere en metode til tapning af blod under stressfrie forhold i bevidste, frit bevægelige og uforstyrrede mus uden behov for forudgående træning eller menneskelig håndtering eller tilstedeværelse.
Automatiseret blodprøvetagning eller dialyseprøvetagning er tidligere blevet brugt til måling af forskellige hormonniveauer (f.eks. melatonin13,14) og deres pulserende sekretion (f.eks. væksthormon)15 hos uhæmmede gnavere. Vi præsenterer hermed en protokol for automatiseret langvarig hyppig blodprøvetagning i bevidste og uhæmmede dyr kombineret med en rettidig fjernaktivering af specifikke neuronale populationer ved hjælp af kemogenetiske teknologier: designerreceptorerne udelukkende aktiveret af designer drugs (DREADD'er). Vi vil beskrive den stereotaksiske levering af en adeno-associeret virus (AAV) vektor og fjernaktivering ved en automatiseret intravenøs (IV) levering af clozapin-N-oxid (CNO)16,17. Denne protokol muliggør sekventiel påvisning af basale niveauer og inducerede ændringer i LH-pulsatilitet hos flere dyr på samme tid. Både blodprøvetagning og IV levering af forbindelsen udføres på en tidsstyret måde via et computerprogram, der eliminerer investigatorens fysiske tilstedeværelse eller kravet om forudgående musetræning. Denne metode overvinder de vigtigste begrænsninger ved manuel blodprøvetagning. Det giver mulighed for blodprøvetagning i en stressfri tilstand og samtidig levering af IV-forbindelse kombineret med fjernkontrol af neuronal aktivitet. Vi viser repræsentative resultater af brugen af automatiseret blodprøvetagning alene eller kombineret med fjernneuronal aktivering og diskuterer dens fordele, begrænsninger og yderligere anvendelser.
Protocol
Alle dyreforsøg udføres i overensstemmelse med National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals18 samt føderale, statslige og lokale love. Voksne hunmus (3-6 måneder gamle) blev brugt til denne protokoldemonstration, herunder fire C57BL/6J hunner og fire Kiss1-Cre; ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) hunner. Mus blev holdt under en 12:12 lys:mørk cyklus, temperaturkontrolleret ved 22 °C og fodret ad libitum på en diæt med lavt fytoøstrogenindhold. Procedurer og protokoller blev godkendt af University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Animal Protocols: PRO00010420 and PRO00010138).
1. Stereotaksisk levering af AAV'er til en bestemt cellepopulation
- Forberedelse til operation
- Steriliser alle værktøjer. Forbered flere pakker med kirurgiske værktøjer for at sikre, at hver pakke ikke bruges til mere end fem dyr. Forbered sterile handsker, mindst et par til hvert dyr.
- Træk glasmikropipetter til injektioner ved hjælp af følgende indstillinger (se materialetabellen) til lange tynde mikropipetter, der injicerer langsomt og støt og ikke let tilstoppes: Varme 1: 915, Varme 2: 630, Træk: 630. Optimer disse indstillinger for hver aftrækker.
- Udfør operationer i et udpeget kirurgisk rum. Desinficer kirurgiske overflader med 70% ethanol.
- Brug sterile gardiner til at opretholde steriliteten i det kirurgiske felt. Brug en ren laboratoriefrakke eller engangskjole og en maske.
- Forbered inhalationsanæstesisystem. Åbn iltforsyningen og reguler strømningshastigheden til 0,8 l / min.
- Kirurgi
- Placer musen i en anæstesiboks og åbn isofluran til 2,5%. Isofluranflowet reduceres til 2 % efter indledende induktion; opretholde flow gennem hele proceduren. For alternative metoder til anæstesi henvises til dyreprotokol og lokale etiske komitéretningslinjer.
- Injicer forebyggende analgetika (carprofen 5 mg/kg s.c.) i overensstemmelse med anbefaling fra komitéen for anvendelse af dyr og lokale bestemmelser.
- Barber musehovedet ved hjælp af klippere.
- Installer dyret på et stereotaksisk bord, læg ørestænger, og sørg for, at hovedet er korrekt fastgjort og stabilt. Fastgør musens mund til mundstykket, og sørg for at placere tungen til siden uden for munden for at undgå kvælning.
- Kontroller, at dyret er dybt bedøvet med en tåklemme, inden operationen påbegyndes, og overvåg musens åndedræt og farve under hele proceduren.
- Placer højdestøtten under musen for at holde kroppen og hovedet i vandret position. Hold dyret varmt med en varm pude dækket af papir. Påfør øjensalve på begge øjne for at undgå tørring.
- Hold det kirurgiske område så rent som muligt. Brug sterile handsker. Desinficer musens hoved med jod og alkohol, inden huden åbnes. Skær huden på hovedet langs midterlinjen med en skalpel, omtrent bag øjnene, indtil bag lambdasuturen. Hold kraniet udsat og rengør det med en vatpind indlejret i steril 0,9% NaCl.
- Find den rostrale rhinalvene (RRV) og markér den med en steril blyant. Brug stereoskopet til resten af proceduren.
BEMÆRK: Vi opnår bedre resultater ved at bruge RRV som en anteroposterior reference, men det er standard at bruge bregma som reference. - Brug en steril nål som reference og sørg for, at hjernens orientering er korrekt, før du fortsætter med stereotaksiske målinger. Sørg også for, at højden af kranieoverfladen ved RRV og lambda samt den laterale hældning er den samme (± 0,02 mm).
BEMÆRK: Den laterale hældning bliver mere relevant for injektion i mere laterale hjernestrukturer. - Læg en steril glaspipette med den virale opløsning, der skal injiceres. Bring det til RRV-referencen for reference 0 anteroposterior (AP). Gå videre langs sagittal sutur til AP-koordinaten efter eget valg. Marker denne position med en steril blyant, løft nålen og fortsæt til kraniotomi.
- Bor forsigtigt en lille cirkel rundt om den markerede position for at undgå at bryde den overlegne sagittale sinus. Placer boret i en skrå snarere end en vinkelret position for at reducere trykket under boring. Fjern kraniestykket med små tang.
- Når vaskulaturen er eksponeret, skal du bruge midten af den overlegne sagittale sinus til brug som den mediolaterale (ML) reference (punkt 0); Dette er mere præcist end at bruge den sagittale sutur. Gå til den valgte ML-position. Sænk pipetten for at berøre dura-materen som dorsoventra-reference (DV) (punkt 0). Bryd dura-materen lidt, og sænk pipetten ned til den valgte DV-position.
- Injicer den ønskede mængde AAV (50-200 nL) og lad kanylen sidde i 3 minutter for at tillade tilstrækkelig væskedispersion. Fjern pipetten forsigtigt ud af hjernen.
- Slip musen fra ørestængerne. Luk huden ved hjælp af kirurgiske klip eller en hvilken som helst metode efter eget valg. Sæt dyret i et separat opvarmet bur til genopretning. Overvåg restitution, reaktivitet og aktivitet, når musen er vågen. Når musen er helt genoprettet, skal du flytte musen tilbage til sit oprindelige bur.
- Vent i mindst 3-4 uger for viral ekspression, før du fortsætter med anden del af proceduren.
2. Jugular vene og halspulsåre kanulering
- Forberedelse til operation
- Udfør operationer i et udpeget kirurgisk rum. Desinficer kirurgiske overflader med 70% ethanol, inden procedurerne påbegyndes. Forbered flere pakker med kirurgiske værktøjer for at sikre, at hver pakke ikke bruges til mere end fem dyr.
- Autoklave alle kirurgiske instrumenter. Rengør derefter med sterilt vand eller saltvand og desinficer værktøjerne med en varm perlesterilisator i mindst 15 s (i henhold til producentens anvisninger) mellem operationer.
- Brug sterile gardiner til at opretholde steriliteten i det kirurgiske felt. Brug en ren laboratoriefrakke eller engangskjole og en maske.
- Forbered mikrokatetre til kanyleringer i halspulsåren og halsvenen. Konstruer arteriekateteret ved at forbinde et lille segment af mikrorenathanrør (strakt fra 0,025 tommer ydre diameter [OD] x 0,012 tommer indvendig diameter [ID]) med silastisk slange (0,025 tommer OD x 0,012 tommer ID). Konstruer kun det venøse kateter ved hjælp af silastisk slange (0,025 tommer OD x 0,012 tommer ID). Blødgør alle katetre i 70% ethanol natten over før operationen.
- Afskårne spidser af begge katetre skal skrånes ved 45° til forudberegnede længder baseret på dyrets kropsvægt og længde.
- Kirurgiske procedurer
- Bedøv dyrene under 2% isofluran med et lavstrømsisofluransystem til præcis kontrol af anæstesistadiet og planet under operationen.
- Injicer den forebyggende dosis smertestillende middel (carprofen 5 mg/kg s.c.) og påfør oftalmisk salve for at forhindre udtørring og hornhindeskader.
- Barber de ventrale og bageste områder af nakken og rengør huden med tre jodscrubs skiftevis med 70% ethanol. Skær et lodret hudsnit (12 mm) mellem skulderbladene og dæk det med kirurgisk gaze til senere brug. Placer dyret i liggende stilling med hovedet mod kirurgen.
- Brug et stereodissekeringsomfang til de fleste dele af de procedurer, der er beskrevet nedenfor.
- Lav et lille lodret snit (~ 10 mm) på højre side af nakken, bedre end kravebenet for at udsætte højre halspulsåre og jugular vene. Skær huden med en saks og udfør en stump dissektion for at adskille subkutant væv ved hjælp af ikke-tandede mikrotang med fine spidser, der udsætter den højre ydre jugularvene og den rigtige fælles halspulsåre.
- Bind den distale ende af halsvenen for at stoppe blodgennemstrømningen og skær et lille hul i den kollapsede vene ved hjælp af mikrotang og saks. Indsæt det venøse kateter skråt ned og proximalt ved hjælp af et par mikrotang for at føre det gennem den overlegne vena cava for at nå niveauet for højre atrium. Den indsatte længde er ~ 10-12 mm for en 30 g mager mus. Bind kateteret for at fastgøre med karret ved hjælp af 7-0 silkesuturer.
BEMÆRK: Med kateteret på det rigtige sted kan blod let trækkes tilbage; Ellers kan kateteret blive forkert placeret i den laterale thoraxvene og skal indsættes igen. - Dissekere forsigtigt bindevæv for at udsætte den rigtige fælles halspulsåre placeret i et trekantområde omgivet af sternohyoidmusklen, sternomastoidmusklen og digastrisk muskel. Brug en wire retractor til at adskille disse muskler, hvis det er nødvendigt. Bind arterien på niveauet af bifurcation af indre og ydre halspulsårer ved hjælp af 7-0 silkesuturer. Præplacer to ubundne sutursløjfer nært.
- Stop blodgennemstrømningen midlertidigt ved at trække i en udskiftet sutursløjfe og skære eller slå et lille hul på karvæggen ved hjælp af en mikrosaks eller en 27 G nål. Indsæt arteriekateteret skråt ned og proximalt til en forudberegnet længde, der når aortabuen, men uden at røre aortaklappen. Den indsatte længde er ~ 9-10 mm for en 30 g mager mus. Bind kateteret for at fastgøre med beholderen ved hjælp af de to udskiftede suturer.
- Tunnel alle katetre subkutant og udvendigt dem bag på halsen via det forskårne snit og sammenføj dem til de venøse eller arterielle porte på et silikonebelagt slangestik lavet af 25 G nåleslange: modificeret MASA19 ved hjælp af to 25 G nåleslanger og to 4,0 cm PE-20 slanger, ærmet med 2,0 cm 0,062 tommer ID silastisk slange fastgjort med en lille metaltrådsfremstillet ring. Det samlede lumenvolumen for hvert kateter inklusive konnektoren er 6-8 μL (figur 1A).
- Luk det ventrale snit og fastgør stikket subkutant ved lukningen af ryghuden med suturer. Fyld begge katetre med hepariniseret saltvand (200 U / ml) og tilslut dem tæt i enden med kirurgiske ledninger i rustfrit stål.
- Mus kommer sig efter isofluranbedøvelse inden for få minutter og kommer sig helt efter operationen inden for 5 dage. Anbring dyrene i det automatiske blodopsamlingskammer 24 timer efter operationen, og tilslut dem til systemet ved at forbinde systemets tøjrekrog med metalringen, der er fastgjort til slangestikket, der er implanteret på bagsiden af nakken. De arterielle og venøse katetre forbindes med henholdsvis injektions- og prøvetagningsledningerne 24 timer, før prøveudtagningen begynder (figur 1B) . Prøvetagningsledningens samlede længde er 55 cm lang eller 40 μL efter lumenvolumen.
BEMÆRK: Opstillingen af injektions- og prøvetagningslinjer, programmeringen af indsamlingsmetoden og burbalancemekanismerne i det automatiserede blodprøvesystem er beskrevet detaljeret20,21. Systemet holder kateteret åbent ved automatisk at levere 10 μL hepariniseret saltvand hvert 20. minut. - Indstil tid og hyppighed for prøveudtagning før injektion, injektion og efter injektion via systemets computerprogram. Se trin 3.1 nedenfor for de aktuelle indstillinger.
- Systemet gør det muligt for dyret at bevæge sig frit uden at vikle prøveudtagnings- og/eller infusionsslangerne sammen ved at registrere musens bevægelse, mens kammeret roteres i modsat retning af musens bevægelse21 (figur 1).
- Genopfyld infusions- eller injektionsslangen med forbindelsen, og tilslut igen til det venøse kateter mindst 2 timer, før infusionen eller injektionen begynder.
BEMÆRK: Kirurgiske komplikationer kan forekomme, og dyr skal overvåges nøje for genopretning og i dagene efter operationen. Se dyreprotokollen for korrekt overvågning, krav til afslutning og procedurer.
3. Automatisk blodindsamling og intravenøs injektion
- Automatiseret blodindsamling
- For at følge denne protokol skal du bruge et prøveudtagningsvolumen på 20,0 μL og indstille et interval (dvs. 7,0 min) mellem hver prøveudtagning for at have en prøveudtagningsfrekvens på hver 10,0 min pr. prøve. Den maksimale prøvetagning er at udtage prøver kontinuerligt ved 3,0 min. pr. prøve. det mindste mulige prøveudtagningsvolumen er 5,0 μL. En tilsvarende mængde saltvand gives automatisk tilbage af systemet for at erstatte det udtagne blod og opretholde kropsvæskebalancen.
- Indstil den samlede prøvetagningstid til 30 (t = -30 - 0) min før og 30 (t = 0 - 30) min efter intravenøs injektion af CNO (0,5 mg/kg, figur 2).
- Hver indsamlet blodprøve (20,0 μL) fortyndes automatisk i 50 μL saltvand (indeholdende heparin ved 10 E / ml) og opbevares individuelt i et mikrorør, der opbevares i en køleprøvekarrusel af systemet.
- Automatisk intravenøs injektion
- Afbryd veneslangen fra det venøse kateter for at genopfylde CNO (individuelt beregnet volumendosis på ~50-60 μL ved 0,5 mg/kg) mindst 2 timer, før blodprøvetagningen begynder.
- Træk opløsningen (lidt mere end det beregnede volumen) ud af slangen retrograd med injektionssprøjten, så der efterlades en lille luftboble mellem opløsningen og den eksisterende saltvand i slangen.
- Tilslut injektionsslangen til venekateteret igen, og indstil injektionshastigheden til 500 μL/min og injektionens starttidspunkt til 2 minutter efter t = 0 prøvetagningens afslutning. Den samlede injektionstid for hvert dyr er 5-6 s.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, kan forbindelsen også leveres ved en manuel intraperitoneal injektion (IP), men dette vil kræve forstyrrelse af dyret under eller før blodindsamlingsprotokollen. Vi viser også dette alternativ i resultaterne.
4. Dyreperfusion og hjernesamling (VALGFRIT)
BEMÆRK: Denne procedure skal kun følges, hvis hjernen er forpligtet til at analysere hjernens sted for neuronal aktivering eller nedstrøms reaktioner.
- Afbryd musen fra blodindsamlingssystemet i slutningen af indsamlingsprotokollen. To timer efter den intravenøse injektion fortsættes med at perfusere dyret med 10 % neutralt bufret formalin (NBF) ved hjælp af den foretrukne metode eller som beskrevet andetsteds22.
- Disseker hjernen og bevar den i 20% saccharose i 10% -NBF i 3 timer for at fortsætte fikseringen.
- Efter 3 timer overføres den faste hjerne til 20 % saccharose i PBS, og den opbevares ved 4 °C, indtil den er klar til sektionering.
BEMÆRK: Undgå overfiksering, da dette maskerer cFOS-antigenerne. I 20% saccharoseopløsningen skal hjernen synke til bunden af beholderen. - Lav sektioner ved hjælp af et frysemikrotomt eller kryostat, og brug den foretrukne metode til at se på neuronal aktivering (f.eks. cFOS immunhistokemi vises).
BEMÆRK: De antistoffer, der anvendes til de aktuelle resultater, er beskrevet i materialetabellen.
5. Behandling og analyse af prøver
- Fjern blodprøver fra den automatiske prøveudtager umiddelbart efter forsøgets afslutning, og læg dem på is.
- Drej prøverne ved 14.000 × g i 30 sekunder.
- Saml plasmaet. Den opbevares ved -80 °C indtil analyse.
- Blodprøverne analyseres med LH ELISA som beskrevet før10,23.
Representative Results
Kisspeptin-ekspressive neuroner (Kiss1-genet) placeret i hypothalamusens bueformede kerne er en potent stimulator af GnRH og dermed af LH-frigivelse fra hypofysen24,25. I denne protokoldemonstration har vi brugt kisspeptin-induceret LH-sekretion til at illustrere funktionen af den automatiserede blodprøvetagningsteknik. Figur 2 viser repræsentative LH-mønstre hos voksne Kiss1-eYFP-hunner, der tidligere har fået en ensidig stereotaxisk injektion af AAV-hM3Dq-mCherry i den bueformede kerne (AP: -4,95, ML: -0,35, DV: -5,7). ChR2-eYFP blev brugt som fluorescerende reporter til Kiss1-celler. En måned efter stereotaksoperationen gennemgik musene halspulsåre og jugular venekanylering og blev forbundet til den automatiske blodprøvetager 4 dage efter operationen. Blodindsamlinger til bestemmelse af basale LH-niveauer blev startet den næste dag med 10 minutters prøveudtagningsfrekvens (7 minutters interval mellem prøver og 3 minutter / prøveudtagning) efterfulgt af en automatiseret IV CNO-injektion og fortsat blodprøvetagning hvert 10. minut i 30 minutter. Diestrous LH-niveauer er generelt lave (figur 2A), men variationer observeres normalt på grund af dets pulserende frigivelse (figur 2B). Efter CNO-injektionen (og aktivering af kisspeptinneuroner) var stigningen i LH skarp (inden for 10 minutter). Stigningsniveauet og varigheden af toppen afhænger af adskillige faktorer, herunder injektionsstedet, antallet af aktiverede neuroner eller den målrettede befolkning.
Figur 3 viser hjernens injektionssted i den bueformede kerne hos hunmusen, der er repræsenteret i figur 2A. Kiss1-eYFP-neuroner er mærket med grønt, mens mCherry-immunreaktiviteten viser stedet for AAV-injektionen og aktiveringen efter CNO. Aktiverede neuroner blev påvist ved hjælp af cFOS immunreaktivitet, mærket med DAB. De fleste mCherry-neuroner colokaliserede med Kiss1-eYFP, og mange viste cFOS-immunreaktivitet, hvilket viste, at den virale og neuronale aktivering var specifik for målgruppen.
Figur 4 viser et repræsentativt LH-pulserende frigivelsesmønster hos diestrous wildtype-mus (C57BL/6J) efterfulgt af respons på en IP-injektion af kisspeptin-10. Musen gennemgik halspulsårekanylering og blev tilsluttet det automatiske blodprøvetagningssystem 4 dage efter operationen. Næste morgen blev østruscyklusserne kontrolleret, og blodindsamlingen og kisspeptin-10-injektionen blev udført på diestrousdagen26. Blodprøver blev indsamlet hvert 7. minut i 2 timer (4 minutters interval plus 3 min/prøveudtagning i 120 minutter før injektionen) for at bestemme baselineniveauerne og LH-pulsatiliteten, efterfulgt af en IP-injektion af kisspeptin-10 (65 μg/kg) og fortsat blodindsamling hvert 7. minut i yderligere 30 minutter. Klare LH-pulser, der er typiske for en kvinde i diestrous, blev observeret, hvilket viste lave basale LH-niveauer, pulsfrekvens på ~ 2 pulser / h og pulsamplitude ~ 1 ng / ml27. En øjeblikkelig og robust stigning i LH blev påvist som reaktion på administration af kisspeptin28. LH-sekretionsmønstre og ændringer efter stimulering er i overensstemmelse med andre undersøgelser ved hjælp af manuel blodtapning 10,27,29,30. Disse resultater viser, at den automatiserede blodprøvetagningsmetode fanger typisk og stimuleret LH-sekretion under en stressfri tilstand.
Figur 1: Nærmere oplysninger om tilslutningssystemet og musetilslutningerne til infusions- og prøvetagningssystemets slange. (A) En silikonebelagt slangekonnektor (MASA) konstrueret ved hjælp af to 25G nåleslanger og to PE-20-slanger, hylsteret i en silastisk slange fastgjort med en lille metalring. B) En mus, der er forbundet med infusions- og prøveudtagningsslangen i prøvetagningsburet, og som hviler i sin rede under blodprøvetagningen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater for LH-impulser i Kiss1-Cre-hunmus injiceret med AAV-hM3Dq i den bueformede kerne og fjernaktiveret med CNO. Basal LH niveauer blev målt hvert 10. minut i en halv time. På tidspunktet 0 efter blodindsamlingen fik kvinden en intravenøs injektion af clozapin-N-oxid (0,5 mg/kg), og blod fortsatte med at blive opsamlet fra halspulsåren hvert 10. minut i yderligere en halv time. (A) Viser en hun med lave basale LH-niveauer. (B) Viser en hun, der udviser en præinjektion med LH-puls. Forkortelser: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = adeno-associeret virus; CNO = clozapin-N-oxid; LH = luteiniserende hormon. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Hjerneaktivering i den bueformede kerne i Kiss1-Cre; Chr2-eYFP (Kiss1-eYFP) kvinde repræsenteret i figur 2A. ChR2-eYFP blev kun brugt som et reportergen til at mærke kiss1-neuroner . (A) Fluorescensbillede med lav forstørrelse, der viser stedet for AAV-injektionen i den bueformede kerne. Grøn: eYFP immunreaktivitet, Magenta: mCherry immunreaktivitet. (B) Brightfield-billede med lav forstørrelse af det område, der svarer til figur 3A, og som viser cFOS-immunreaktivitet (sort) på stedet for AAV-injektionen i Arcuate-kernen. (C) Fluorescens med høj forstørrelse og brightfield-billede kombineret viser et nærmere kig på neuronerne i figur 3A, B. Kiss1-eYFP-neuroner, der coudtrykker AAV-mCherry, der er blevet aktiveret, er dem med hvid cytoplasma og sort kerne (pile). Skalastænger = 50 μm (A,B), 20 μm (C). Forkortelser: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = adeno-associeret virus; eYFP = forbedret gult fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Basal LH-pulsatilitet hos en diestrous vildtypehun målt hvert 7. minut i 2 timer. Kvinden modtog derefter en intraperitoneal injektion af kisspeptin-10 (65 μg / kg) på tidspunktet 0, og blodprøver blev kontinuerligt indsamlet hvert 7. minut i en halv time. Forkortelse: LH = luteiniserende hormon. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Ved hjælp af denne protokol var vi i stand til at vise basal LH-pulsatilitet og LH-sekretion efter stimulering af en neuronal population. De store fordele ved systemet er det stressfrie miljø, hvor prøveudtagning finder sted, uden menneskelig tilstedeværelse eller håndtering under blodprøvetagningen. Derudover var der ikke behov for forudgående møjsommelig dyretræning og tilpasning til menneskelig tilstedeværelse eller håndtering under forsøget. Tidligere eksperimenter med manuel blodprøvetagning krævede en stor mængde tid og kræfter for at minimere stressorer 7,31,32. Men at skære halen alene er en stressor33. Implementering af et ikke-stressende miljø og træningsparadigme i fælles dyrefaciliteter, hvor afbrydelser er uforudsigelige, kan også være en begrænsning. I nogle laboratorier skal dyr ofte transporteres til alternative procedurerum til blodprøvetagning. Disse begrænsninger kan gøre den manuelle metode uegnet til påvisning af subtile ændringer i LH-niveauer, og derfor kan en hands-off tilgang være nyttig i disse situationer. Automatiseret prøveudtagning er indstillet i et stille rum, hvor musene placeres flere dage i forvejen for at akklimatisere sig til det nye miljø. Vores tidligere erfaring med denne protokol gav præcis påvisning af kortikosteron og pulserende væksthormonsekretionsmønstre hos mus, hvilket ikke viste forhøjede kortikosteronniveauer under den automatiserede prøveudtagning15. I de nuværende forsøg var alle dyr godt tilpasset prøvetagningssystemet, der viste redebygning i prøvetagningskammeret efter ~ 24 timer og lys hårfarve, hvilket indikerer mangel på stress og generel god sundhedstilstand (figur 1).
Den største vanskelighed, der fører til negative resultater, er sandsynligvis den uhensigtsmæssige målretning af AAV til den krævede neuronale population. Præcision i stereotaksiske injektioner er afgørende, og træning bør udføres på forhånd for at kontrollere koordinater og injektionsvolumener. Træning kan udføres ved at injicere en lille mængde 0,5-1% Evans Blue til det ønskede sted i ikke-genopretningskirurgi og derefter tage et stykke af den nyligt dissekerede hjerne ved hjælp af en musehjernematrix (f.eks. Ted Pella) for at kontrollere injektionsstedet og størrelsen ved hjælp af et stereoskop.
Det er også vigtigt at tage højde for, at blod og plasma indsamlet fra det automatiserede blodprøvetagningssystem vil blive fortyndet i hepariniseret saltvand (f.eks. 20 μL blod i 50 μL saltvand i vores resultater)20, og fortyndingsforholdet skal muligvis justeres for følsomheden af den valgte analysemetode. Vi testede LH-niveauer i fuldblod fortyndet i BSA-PBS (som anbefalet til ultrafølsom LH ELISA)10 eller saltvand og fandt ingen forskelle i LH-værdier. Tween kan ikke anvendes i fortyndingsmidlet, da dette vil cirkulere ind i blodsystemet for at ekstrahere prøverne ved at erstatte prøvevæskerne20. Det er vores erfaring, at fortyndinger under 1:10 gav gode LH-resultater, men lidt undervurderede LH-niveauer sammenlignet med 1:3,5. Dette indikerer, at fortyndingen kan justeres yderligere for at reducere mængden af opsamlet blod, hvis det er nødvendigt.
Et alternativ til automatiseret sammensat levering er at gøre manuelle injektioner via det venøse kateter. I dette tilfælde er efterforskeren kortvarigt til stede i rummet for at levere injektionen. Der er imidlertid ingen direkte kontakt med dyrene eller deres boliger og omgivelser, og i modsætning til intraperitoneale eller subkutane injektioner er hele proceduren ofte ubemærket af dyret. Fordelene ved en manuel injektion er, at den sammensatte fortynding ikke behøver at blive indstillet på forhånd, hvilket kan være kritisk for forbindelser, der er for dyre at bruge i større mængder eller er følsomme over for nedbrydning over tid; da driftsvolumen er mindre end ved automatiseret levering, hvor infusionsslangen og kateteret skal fyldes med mere sammensat opløsning.
Automatisk blodprøvetagning giver en unik mulighed for at studere LH-variationer under f.eks. søvn. Vi har regelmæssigt observeret dyr, der sover i deres reder under prøvetagningstiden. Det er muligt at koble denne sampling med EEG-optagelser for at generere en mere detaljeret analyse af forholdet mellem neural aktivitet og LH mønster34. Som vist her er mulighederne for at bruge automatiseret blodprøvetagning mange: fra basal LH-prøveudtagning til test af LH-respons på endogene eller eksogene forbindelser eller til aktivering eller undertrykkelse af neuronale populationer. De neuronale manipulationer kan implementeres akut med kemogenetik eller optogenetik eller permanent ved hjælp af transgene musemodeller og apoptotiske eller neuronale hæmningsværktøjer. Automatiseret blodprøvetagning giver også mulighed for måling af andre hormoner med stærkt pulserende sekretoriske mønstre (fx, væksthormon15). Hos hunmus, hvis der kræves en bestemt fase af østruscyklussen, kan vaginale udstrygninger omhyggeligt indsamles timer før protokol26 påbegyndes uden at forstyrre infusions- og prøveudtagningslinjerne. Dyr kan tilsluttes prøveudtagningssystemet i 7-10 dage med risikoen for koagulation af arterielinjen stigende med tiden.
Denne teknik er imidlertid begrænset til brug i enkelthusede dyr, og derfor er den muligvis ikke egnet til at studere sociale interaktioner. Det er også invasivt og kræver teknisk udfordrende kirurgi, så det er muligvis ikke muligt at implementere med unge dyr eller visse sygdomsmodeller. Endelig, fordi omkostningerne ved at købe systemet kan være for høje for et enkelt forskningslaboratorium, ville det være tilrådeligt at oprette det i et kernelaboratorium, der leverer den nævnte eksperimentelle protokol som tjenester.
Afslutningsvis viser denne protokol, hvordan man udfører stereotaksisk levering af AAV kombineret med automatiseret blodprøvetagning. Den præcise rumlige og tidsmæssige kontrol, der opnås med denne teknik, sammen med dens fleksibilitet i anvendelsen på forskellige modeller, måleprotokoller og hormoner, gør det til en kraftfuld metode til undersøgelse af hormonregulering hos gnavere. Vigtigst af alt giver metoden et stressfrit miljø ved at eliminere menneskelig tilstedeværelse og håndtering under injektion og / eller prøveudtagning og forudgående dyretræning. Disse fordele sammen med muligheden for multiplexing gør denne metode til et unikt værktøj til at studere den neurale kontrol af hormonelle ændringer hos bevidste, frit bevægelige og uforstyrrede mus.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Daniel Haisenleder for hans hjælp med at teste forskellige blodfortyndingsmetoder. Serumhormonanalyser blev udført på University of Virginia Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core støttet af Eunice Kennedy Shriver NICHD Grant R24 HD102061. Michigan Mouse Metabolic Phenotyping Center-Live understøttes af NIH Center Grant U2C DK135066. JF og NQ støttes af DK020572 (MDRC) og DK089503 (MNORC) tilskud. CFE og CSM støttes af NICHD-tilskud R21 HD109485 og R01 HD096324.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Not necessarily this virus but this was the one used for representative results |
| Alcohol | Disinfection | ||
| Anesthesia Induction box | Vetequip | ||
| Anesthesia induction machine | Kent Scientific Equipment | SomnoSuite | |
| Anesthesia masks for mice | Kent Scientific Equipment | SOMNO-0801 | |
| Autoclip applier 9 mm | Clay Adams | 427630 | |
| Autoclip remover 9 mm | Clay Adams | 427637 | |
| Autoclips 9 mm | Clay Adams | 427631 | |
| BASi Culex Controller | Culex | SN: 2151, 2152, 2156, 2158 | 4 stations |
| BASi Honey Comb Fraction Collector | Honey Comb | SN: 2105, 2106, 2107, 2108 | 4 stations |
| BASi Ratrun Rotation Control | RATURN 2 | SN: 5680, 5681, 5682, 5683 | 4 stations |
| C57BL/6J mice | JAX # 000664 | ||
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl | Analgesic |
| Clippers | Braun | ||
| Clozapine-N-oxide | ENZO | BLM-NS105-0005 | |
| Cotton tipped applicators | |||
| CULEX Automated In Vivo Sampling System | BASi | DS000627 | with CX-4000S Replacement Tubing Sets |
| Curved forceps serrated | FST | 11151-10 | |
| Drill | Dremel | 61100 | |
| Empis control Module | EMPIS CM | SN: 174 | |
| Empis Programmable Infusion System | EMPIS | SN: 2125 , 2126, 2127, 2128 | With CX-7010S 4 BAS-2 Infusion Sets; 4 stations |
| Envigo 2016 diet | low-phytoestrogen diet | ||
| Eye ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment | Petrolatum Ophtalmic oinment |
| Glass pipettes | World Precision Instruments | MIB100-6 | |
| Hemostats | Roboz Surgical | RS-7101 | |
| Iodine | Betadine Surgical scrub | ||
| Isoflurane | VetOne | Fluriso | Anesthetic |
| Isoflurane Vaporizer or SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Surgivet or Kent Scientific Corp | SS-01 | Anesthesia Machine |
| Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) mice | JAX # 023436 and #024109 | ||
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals | 048-56 | |
| Micro-renathane tubing | Braintree Scientific | MRE025 | Surgical catheterization |
| Micro-Scissors | Roboz Surgical | RS-5606 | |
| Needle Holder | Roboz Surgical | RS-7842 | |
| Picoliter injector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P30 | |
| Rodent Warmer X2 | Stoelting | 53850 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 | |
| Scissors | Roboz Surgical | RS-6808 | |
| Silicon tubing | Liveo Laboratory Tubing | NO.508-001 | 0.012 in I.D x 0.025 in O.D. |
| Stereotaxic table | RWD | E06208 | |
| Sterile 0.9% saline | Baxter | 2F7124 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical blades | SKLAR | 06-3011 | |
| Surgical stereoscope | Zeiss | f-160 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4972 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-5058 | |
| Antibodies | |||
| Anti-cFos | Millipore | ABE457 | Antigen target: N-terminus cFos; Host organism: Rabbit; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2631318 |
| Anti-GFP | Aves Labs | GFP-1010 | Antigen target: recombinant GFP null; Host organism: Chicken; Dilution used: 1:10,000; RRID: AB_2307313 |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs | 711-065-152 | Antigen target: Rabbit IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:1,000; RRID: AB_2340593 |
| Donkey anti-Rat IgG, AlexaFluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21209 | Antigen target: Rat IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2535795 |
| Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | Antigen target: Chicken, IgY (H+L); Host organism: Goat; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2534096 |
| mCherry monoclonal (16D7) | Thermo Fisher Scientific | M11217 | Antigen target: mCherry tag; Host organism: Rat; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2536611 |
References
- Kokoris, G. J., Lam, N. Y., Ferin, M., Silverman, A. J., Gibson, M. J. Transplanted gonadotropin-releasing hormone neurons promote pulsatile luteinizing hormone secretion in congenitally hypogonadal (hpg) male mice. Neuroendocrinology. 48 (1), 45-52 (1988).
- Coquelin, A., Desjardins, C. Luteinizing hormone and testosterone in young and old male mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 243 (3), E257-E263 (1982).
- Carmel, P. W., Araki, S., Ferin, M. Pituitary stalk portal blood collection in rhesus monkeys: Evidence for pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH). Endocrinology. 99 (1), 243-248 (1976).
- Schuiling, G., Gnodde, H. Site of origin of the pulsatile secretion of luteinizing hormone in long-term ovariectomized rats. Journal of Endocrinology. 70 (1), 97-104 (1976).
- Hackwell, E. C. R., Ladyman, S. R., Brown, R. S. E., Grattan, D. R. Mechanisms of lactation-induced infertility in female mice. Endocrinology. 164 (5), 1-12 (2023).
- Bahougne, T., Kretz, M., Angelopoulou, E., Jeandidier, N., Simonneaux, V. Impact of circadian disruption on female mice reproductive function. Endocrinology. 161 (4), (2020).
- Kreisman, M. J., McCosh, R. B., Tian, K., Song, C. I., Breen, K. M. Estradiol Enables Chronic Corticosterone to Inhibit Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion and Suppress Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Neuroendocrinology. 110 (6), 501-516 (2020).
- Moenter, S. M., Evans, N. P. Gonadotropin-releasing hormone GnRH measurements in pituitary portal blood. Journal of Neuroendocrinology. 34 (5), 13065 (2022).
- Maeda, K. I., et al. The LHRH pulse generator: A mediobasal hypothalamic location. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 19 (3), 427-437 (1995).
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
- Minabe, S., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K. Analysis of pulsatile and surge-like luteinizing hormone secretion with frequent blood sampling in female mice. Journal of Reproduction and Development. 57 (5), 660-664 (2011).
- Perreau-Lenz, S., Kalsbeek, A., Pévet, P., Buijs, R. M. Glutamatergic clock output stimulates melatonin synthesis at night. European Journal of Neuroscience. 19 (2), 318-324 (2004).
- Herwig, A., Pévet, P., Bothorel, B., Steinlechner, S., Saboureau, M. Trans-pineal microdialysis in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): A tool to study seasonal changes of circadian clock activities. Journal of Pineal Research. 40 (2), 177-183 (2006).
- Adams, J. M., Otero-Corchon, V., Hammond, G. L., Veldhuis, J. D., Qi, N., Low, M. J. Somatostatin is essential for the sexual dimorphism of GH secretion, corticosteroid-binding globulin production, and corticosterone levels in mice. Endocrinology. 156 (3), 1052-1065 (2015).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).
- Krashes, M. J., et al. reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eighth edition. National Research Council. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188 (2011).
- Peters, S., et al. Culex ABS Part I: Introduction to automated blood sampling. Current Separations. 18 (4), 139-145 (2000).
- Bohs, C., Cregor, M., Gunaratna, G., Kissinger, C. Culex Automated blood sampler part II Managing freely-moving animals and monitoring their activity. Current Separations. 18 (4), 147-151 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kreisman, M. J., Mccosh, R. B., Breen, K. M. A Modified ultra-sensitive ELISA for measurement of LH in mice. Endocrinology. 163 (9), (2022).
- Pielecka-Fortuna, J., Chu, Z., Moenter, S. M. Kisspeptin acts directly and indirectly to increase gonadotropin-releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by estradiol. Endocrinology. 149 (4), 1979-1986 (2008).
- Kumar, D., et al. Specialized subpopulations of kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in female mice. Endocrinology. 156 (1), 32-38 (2015).
- Caligioni, C. S.
- Czieselsky, K., et al. Pulse and surge profiles of luteinizing hormone secretion in the mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Wang, L., et al. Genetic dissection of the different roles of hypothalamic kisspeptin neurons in regulating female reproduction. eLife. 8, 43999 (2019).
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), e57894 (2018).
- Vanacker, C., Defazio, R. A., Sykes, C. M., Moenter, S. M. A role for glial fibrillary acidic protein (Gfap)-expressing cells in the regulation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) but not arcuate kisspeptin neuron output in male mice. eLife. 10, e68205 (2021).
- Dulka, E. A., Defazio, R. A., Moenter, S. M. Chemogenetic suppression of GnRH neurons during pubertal development can alter adult GnRH neuron firing rate and reproductive parameters in female mice. eNeuro. 7 (3), 0223 (2020).
- Talbi, R., et al. Characterization of the Action of Tachykinin Signaling on Pulsatile LH Secretion in Male Mice. Endocrinology. 162 (8), 1-9 (2021).
- Tuli, J., Smith, J., Morton, D. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animals. 29 (1), 90-95 (1995).
- Lucien, J. N., Ortega, M. T., Shaw, N. D.
