Summary
De pulsatiliteit van luteïniserend hormoon (LH) is een kenmerk van de voortplantingsfunctie. We beschrijven een protocol voor het op afstand activeren van specifieke neuronale populaties gekoppeld aan seriële geautomatiseerde bloedafname. Deze techniek maakt getimede hormonale modulatie, multiplexing en het minimaliseren van manipulatie-effecten op LH-niveaus mogelijk bij bewuste, vrij bewegende en ongestoorde dieren.
Abstract
Circulerend luteïniserend hormoon (LH)-spiegels zijn een essentiële index van het functioneren van de hypothalamus-hypofyse-controle van de voortplanting. De rol van talrijke inputs en neuronale populaties in de modulatie van LH-afgifte is nog onbekend. Het meten van veranderingen in LH-niveaus bij muizen is vaak een uitdaging, omdat ze gemakkelijk worden verstoord door omgevingsstress. De huidige technieken om LH-afgifte en pulsatiliteit te meten, vereisen langdurige training voor muizen om zich aan te passen aan manipulatiestress, bepaalde terughoudendheid, de aanwezigheid van de onderzoeker en het werken aan individuele dieren, waardoor het nut ervan voor veel onderzoeksvragen wordt verminderd.
Dit artikel presenteert een techniek om specifieke neuronale populaties op afstand te activeren met behulp van Designer Receptor Exclusive Activated by Designer Drugs (DREADDs)-technologie in combinatie met geautomatiseerde sequentiële bloedafname bij bewuste, vrij bewegende en ongestoorde muizen. We beschrijven eerst het protocol voor stereotactische chirurgie om adeno-geassocieerd virus (AAV)-vectoren die DREADD's tot expressie brengen, af te leveren aan specifieke neuronale populaties. Vervolgens beschrijven we het protocol voor de canulatie van de halsslagader en halsader en de postoperatieve verbinding met het geautomatiseerde bloedafnamesysteem van CULEX. Ten slotte beschrijven we het protocol voor clozapine-N-oxide intraveneuze injectie voor neuronale activering op afstand en geautomatiseerde bloedafname. Deze techniek maakt geprogrammeerde geautomatiseerde bemonstering om de 5 minuten of langer gedurende een bepaalde periode mogelijk, in combinatie met intraveneuze stofinjectie op een gewenst tijdstip of duur. Over het algemeen vonden we deze techniek een krachtige benadering voor onderzoek naar neuro-endocriene controle.
Introduction
De hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG)-as wordt centraal gereguleerd door de pulserende afgifte van gonadotropine-releasing hormoon (GnRH) in het hypofyse-portaalsysteem. In de hypofyse regelt GnRH de pulserende afgifte van gonadotropines, luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) aan de bloedsomloop. LH pulserende afgifte dient als een kenmerk voor het functioneren vande centrale HPG-as 1,2,3,4. Het toont bijvoorbeeld de effecten van genetische veranderingen of veranderingen in hormonale of omgevingsfactoren op het neurale deel van de as 5,6,7. Tot voor kort was het meten van het LH-pulsatiele patroon beperkt tot grote zoogdieren8 en ratten9, gezien de hoge frequentie van bemonstering en de grote bloedvolumes die nodig zijn om de pulsen te identificeren.
Het detecteren van LH-pulsen bij muizen is wenselijk omdat deze soort brede genetische modellen beschikbaar heeft en gemakkelijk kan worden gemanipuleerd met behulp van genomische engineeringtechnologieën om specifieke genen en celpopulaties verder te bestuderen. In het afgelopen decennium heeft een grote vooruitgang in de analyse van LH-concentraties bij muizen met behulp van een sandwich LH-enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) het mogelijk gemaakt om LH in een minieme hoeveelheid bloed te detecteren10. De ontwikkeling van de frequente bloedafnametechniek heeft de noodzakelijke frequente bemonstering mogelijk gemaakt voor het detecteren van de frequentie en amplitude van LH-pulsen bij muizen10,11. Bloedafname in de staartpunt is echter beperkt tot het gebruik ervan bij bewuste, wakkere dieren; Het vereist een lange trainingsperiode voor muizen om zich aan te passen aan de hantering en de aanwezigheid van een aangewezen onderzoeker tijdens de bemonstering. Het succes ervan is zeer gevoelig voor omgevingsstressoren en is mogelijk niet geschikt voor gebruik bij muizenstammen die een hoge mate van angst vertonen. Intra-atriale canulatie is ook gebruikt voor frequente bloedafname bij vrij bewegende bewuste muizen12. Die opstelling vereist echter nog steeds herhaalde handmatige bloedafname en beperkt de bewegingsruimte van het dier, terwijl atriale canulatie kan leiden tot dynamische veranderingen in de hartfunctie. Het is daarom wenselijk om een methode vast te stellen voor bloedafname onder stressvrije omstandigheden bij bewuste, vrij bewegende en ongestoorde muizen zonder dat voorafgaande training of menselijke behandeling of aanwezigheid nodig is.
Geautomatiseerde bloed- of dialysaatbemonstering is eerder gebruikt voor het meten van verschillende hormoonspiegels (bijv. melatonine 13,14) en hun pulserende secretie (bijv. groeihormoon)15 bij ongeremde knaagdieren. Hierin presenteren we een protocol voor geautomatiseerde langdurige frequente bloedafname bij bewuste en ongeremde dieren, gekoppeld aan een tijdige activering op afstand van specifieke neuronale populaties met behulp van chemogenetische technologieën: de designerreceptoren die uitsluitend worden geactiveerd door designerdrugs (DREADD's). We zullen de stereotaxische toediening van een adeno-geassocieerd virus (AAV) vector en de activering op afstand door een geautomatiseerde intraveneuze (IV) toediening van clozapine-N-oxide (CNO) beschrijven16,17. Dit protocol maakt de sequentiële detectie van basale niveaus en geïnduceerde veranderingen in LH-pulsatiliteit bij meerdere dieren tegelijk mogelijk. Zowel de bloedafname als de IV-toediening van de verbinding worden op een tijdgestuurde manier uitgevoerd via een computerprogramma, waardoor de fysieke aanwezigheid van de onderzoeker of de vereiste voor voorafgaande muistraining wordt geëlimineerd. Deze methode overwint de belangrijkste beperkingen van handmatige bloedafname. Het maakt bloedafname in een stressvrije toestand mogelijk, en gelijktijdige IV-toediening van verbindingen in combinatie met controle van neuronale activiteit op afstand. We tonen representatieve resultaten van het gebruik van geautomatiseerde bloedafname alleen of in combinatie met neuronale activering op afstand en bespreken de voordelen, beperkingen en aanvullende toepassingen ervan.
Protocol
Alle dierprocedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals18 en met federale, staats- en lokale wetten. Volwassen vrouwelijke muizen (3-6 maanden oud) werden gebruikt voor deze protocoldemonstratie, waaronder vier C57BL/6J-vrouwtjes en vier Kiss1-Cre; ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) vrouwtjes. Muizen werden gehouden onder een 12:12 licht:donker-cyclus, temperatuurgecontroleerd op 22 °C, en ad libitum gevoed met een dieet met weinig fyto-oestrogeen. Procedures en protocollen werden goedgekeurd door de University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Animal Protocols: PRO00010420 and PRO00010138).
1. Stereotaxische afgifte van AAV's aan een specifieke celpopulatie
- Voorbereiding op de operatie
- Steriliseer alle gereedschappen. Bereid meerdere pakketten chirurgische instrumenten voor om ervoor te zorgen dat elke verpakking bij niet meer dan vijf dieren wordt gebruikt. Maak steriele handschoenen klaar, minimaal één paar voor elk dier.
- Trek glazen micropipetten voor injecties met behulp van de volgende instellingen (zie de tabel met materialen) voor lange dunne micropipetten die langzaam en gestaag injecteren en niet gemakkelijk verstopt raken: Warmte 1: 915, Warmte 2: 630, Trekken: 630. Optimaliseer deze instellingen voor elke trekker.
- Voer operaties uit in een aangewezen operatieruimte. Desinfecteer chirurgische oppervlakken met 70% ethanol.
- Gebruik steriele gordijnen om de steriliteit van het operatieveld te behouden. Draag een schone laboratoriumjas of wegwerpjas en een masker.
- Bereid het inhalatie-anesthesiesysteem voor. Open de zuurstoftoevoer en regel het debiet tot 0,8 l/min.
- Chirurgie
- Plaats de muis in een anesthesiedoos en open de isofluraan tot 2,5%. Verlaag de isofluraanstroom tot 2% na de eerste inductie; Zorg voor doorstroming tijdens de procedure. Raadpleeg voor alternatieve anesthesiemethoden het dierenprotocol en de richtlijnen van de lokale ethische commissie.
- Injecteer preventief pijnstillend middel (carprofen 5 mg/kg s.c.) volgens de aanbeveling van de commissie voor diergebruik en de plaatselijke voorschriften.
- Scheer de muizenkop met een tondeuse.
- Installeer het dier op een stereotaxische tafel, plaats oorbalken en zorg ervoor dat het hoofd correct is bevestigd en stabiel. Bevestig de mond van de muis aan het mondstuk en zorg ervoor dat u de tong aan de zijkant buiten de mond plaatst om verstikking te voorkomen.
- Controleer of het dier diep verdoofd is met een teenknijp voordat u met de operatie begint en controleer de adem en kleur van de muis tijdens de procedure.
- Plaats een verhogingssteun onder de muis om het lichaam en het hoofd horizontaal te houden. Houd het dier warm met een warm kussen bedekt met papier. Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
- Houd het operatiegebied zo schoon mogelijk. Draag steriele handschoenen. Desinfecteer de kop van de muis met jodium en alcohol voordat u de huid opent. Snijd met een scalpel de huid op het hoofd langs de middellijn, ongeveer van achter de ogen tot achter de lambdahechting. Houd de schedel bloot en reinig deze met een wattenstaafje ingebed in steriele 0,9% NaCl.
- Zoek de rostrale rhinale ader (RRV) en markeer deze met een steriel potlood. Gebruik de stereoscoop voor de rest van de procedure.
OPMERKING: We verkrijgen betere resultaten met de RRV als anteroposterieure referentie, maar het is standaard om bregma als referentie te gebruiken. - Gebruik een steriele naald als referentie om ervoor te zorgen dat de oriëntatie van de hersenen correct is voordat u overgaat tot stereotaxische metingen. Zorg er ook voor dat de hoogte van het schedeloppervlak bij de RRV en lambda, evenals de laterale helling, hetzelfde zijn (± 0,02 mm).
OPMERKING: De laterale helling wordt relevanter voor injectie in meer laterale hersenstructuren. - Vul een steriele glazen pipet met de te injecteren virale oplossing. Breng het naar de RRV-referentie voor referentie 0 anteroposterior (AP). Ga langs de sagittale hechting naar de AP-coördinaat naar keuze. Markeer deze positie met een steriel potlood, til de naald op en ga verder met craniotomie.
- Boor voorzichtig een kleine cirkel rond de gemarkeerde positie om te voorkomen dat de superieure sagittale sinus breekt. Plaats de boor in een gekantelde in plaats van een loodrechte positie om de druk tijdens het boren te verminderen. Verwijder het stuk van de schedel met een kleine pincet.
- Zodra het vaatstelsel is blootgesteld, gebruikt u het midden van de superieure sagittale sinus om te gebruiken als de mediolaterale (ML) referentie (punt 0); Dit is nauwkeuriger dan het gebruik van de sagittale hechtdraad. Ga naar de ML-positie van uw keuze. Laat de pipet zakken om de dura-mater aan te raken als de dorsoventrale (DV) referentie (punt 0). Breek de dura-mater lichtjes en laat de pipet afdalen naar de DV-positie van uw keuze.
- Injecteer de gewenste hoeveelheid AAV (50-200 nL) en laat de canule 3 minuten op zijn plaats om voldoende vloeistofdispersie mogelijk te maken. Haal de pipet voorzichtig uit de hersenen.
- Haal de muis uit de oorbalken. Sluit de huid met behulp van chirurgische clips of een andere methode naar keuze. Zet het dier in een aparte verwarmde kooi voor herstel. Bewaak herstel, reactiviteit en activiteit nadat de muis wakker is. Als u volledig hersteld bent, verplaatst u de muis terug naar de oorspronkelijke kooi.
- Wacht minimaal 3-4 weken op virale expressie voordat u doorgaat met het tweede deel van de procedure.
2. Canulatie van de halsader en halsslagader
- Voorbereiding op de operatie
- Voer operaties uit in een aangewezen operatieruimte. Desinfecteer chirurgische oppervlakken met 70% ethanol voordat u met de procedures begint. Bereid meerdere pakketten chirurgische instrumenten voor om ervoor te zorgen dat elke verpakking bij niet meer dan vijf dieren wordt gebruikt.
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten. Reinig vervolgens met steriel water of zoutoplossing en desinfecteer het gereedschap met een hete kralensterilisator gedurende ten minste 15 s (volgens de instructies van de fabrikant) tussen de operaties.
- Gebruik steriele gordijnen om de steriliteit van het operatieveld te behouden. Draag een schone laboratoriumjas of wegwerpjas en een masker.
- Bereid microkatheters voor op canulaties in de halsslagader en halsader. Construeer de slagaderkatheter door een klein segment van microrenathaanslang (uitgerekt van 0.025 inch buitendiameter [OD] x 0.012 inch binnendiameter [ID]) te verbinden met silastische slangen (0.025 inch OD x 0.012 inch ID). Construeer de veneuze katheter alleen met behulp van silastische slangen (0.025 inch OD x 0.012 inch ID). Week alle katheters een nacht in 70% ethanol voorafgaand aan de operatie.
- Schuin de afgesneden uiteinden van beide katheters onder een hoek van 45° tot een vooraf geschatte lengte op basis van het lichaamsgewicht en de lengte van het dier.
- Chirurgische ingrepen
- Verdoof de dieren met minder dan 2% isofluraan met een tafelmodel low-flow isofluraansysteem om de anesthesiefase en het anesthesievlak tijdens de operatie nauwkeurig te regelen.
- Injecteer de preventieve dosis pijnstiller (carprofen 5 mg/kg s.c.) en breng oogzalf aan om uitdroging en hoornvliesletsel te voorkomen.
- Scheer de buik- en achterkant van de nek en reinig de huid met drie jodiumscrubs afgewisseld met 70% ethanol. Snijd een verticale huidincisie (12 mm) tussen de schouderbladen en bedek deze met chirurgisch gaas voor later gebruik. Plaats het dier in rugligging met de kop naar de chirurg toe.
- Gebruik een stereo-ontleedscoop voor de meeste onderdelen van de hieronder beschreven procedures.
- Maak een kleine verticale incisie (~10 mm) aan de rechterkant van de nek, boven het sleutelbeen om de rechter halsslagader en halsader bloot te leggen. Knip de huid door met een schaar en voer een stompe dissectie uit om onderhuidse weefsels te scheiden met behulp van een niet-getande micropincet met fijne punten, waardoor de rechter externe halsader en de rechter gemeenschappelijke halsslagader bloot komen te liggen.
- Bind het distale uiteinde van de halsader vast om de bloedstroom te stoppen en knip een klein gaatje in de ingeklapte ader met behulp van een micropincet en een schaar. Breng de veneuze katheter schuin naar beneden en proximaal in met behulp van een micropincet om deze door de superieure vena cava te brengen om het niveau van het rechter atrium te bereiken. De ingestoken lengte is ~10-12 mm voor een magere muis van 30 g. Bind de katheter vast om met het bloedvat te fixeren met behulp van 7-0 zijden hechtingen.
OPMERKING: Met de katheter op de juiste plaats kan bloed gemakkelijk worden afgenomen; Anders kan de katheter verkeerd in de laterale thoracale ader worden geplaatst en moet deze opnieuw worden ingebracht. - Ontleed het bindweefsel zorgvuldig om de rechter gemeenschappelijke halsslagader bloot te leggen, gelegen in een driehoekig gebied omringd door de sternohyoid-spier, de sternomastoïde spier en de digastrische spier. Gebruik indien nodig een draadoprolmechanisme om deze spieren te scheiden. Bind de slagader vast ter hoogte van de vertakking van interne en externe halsslagaders met behulp van 7-0 zijden hechtingen. Plaats twee losgemaakte hechtdraden proximaal.
- Stop de bloedstroom tijdelijk door aan een gestifte hechtlus te trekken en knip of prik een klein gaatje in de vaatwand met een microschaar of een naald van 27 G. Breng de arteriële katheter schuin naar beneden en proximaal in tot een vooraf geschatte lengte die de aortaboog bereikt, maar zonder de aortaklep aan te raken. De ingestoken lengte is ~9-10 mm voor een magere muis van 30 g. Bind de katheter vast aan het bloedvat met behulp van de twee vervangen hechtingen.
- Tunnel alle katheters subcutaan en exterioriseer ze aan de achterkant van de nek via de voorgesneden incisie en verbind ze met de veneuze of arteriële poorten van een met siliconen gecoate slangconnector gemaakt van 25 G naaldslang: gemodificeerde MASA19 met behulp van twee naaldslangen van 25 G en twee PE-20-slangen van 4,0 cm, omhuld met 2,0 cm silastische slang van 0,062 inch ID bevestigd met een kleine ring van metaaldraad. Het totale lumenvolume van elke katheter inclusief de connector is 6-8 μL (Figuur 1A).
- Sluit de ventrale incisie en fixeer de connector subcutaan op de sluiting van de rughuid met hechtingen. Vul beide katheters met gehepariniseerde zoutoplossing (200 E/ml) en sluit ze aan het uiteinde stevig af met roestvrijstalen chirurgische draden.
- Muizen herstellen binnen enkele minuten van isofluraananesthesie en herstellen binnen 5 dagen volledig van een operatie. Plaats de dieren 24 uur na de operatie in de geautomatiseerde bloedafnamekamer en sluit ze aan op het systeem door de bevestigingshaak van het systeem te verbinden met de metalen ring die is bevestigd aan de slangconnector die aan de achterkant van de nek is geïmplanteerd. Sluit de arteriële en veneuze katheters 24 uur voor aanvang van de bemonstering aan op respectievelijk de injectie- en bemonsteringslijnen (figuur 1B). De totale lengte van de bemonsteringsleiding is 55 cm lang of 40 μL in lumenvolume.
OPMERKING: De opstelling van injectie- en bemonsteringslijnen, de programmering van de afnamemethode en de kooibalansmechanismen van het geautomatiseerde bloedafnamesysteem zijn in detail beschreven 20,21. Het systeem houdt de katheter open door elke 20 minuten automatisch 10 μL gehepariniseerde zoutoplossing toe te dienen. - Stel de bemonsteringstijd en -frequentie vóór de injectie, de injectie en de bemonsteringsfrequentie in via het computerprogramma van het systeem. Zie stap 3.1 hieronder voor de huidige instellingen.
- Het systeem stelt het dier in staat zich vrij te bewegen zonder de bemonsterings- en/of infusielijnen in de knoop te brengen door de muisbeweging te detecteren terwijl de huisvestingskamer in een tegenovergestelde richting wordt gedraaid dan de muisbeweging21 (figuur 1).
- Vul de infusie- of injectielijn opnieuw met het middel en sluit deze ten minste 2 uur voordat de infusie of injectie begint opnieuw aan op de veneuze katheter.
OPMERKING: Er kunnen complicaties bij de operatie optreden en dieren moeten nauwlettend worden gecontroleerd voor herstel en op de dagen na de operatie. Raadpleeg het dierprotocol voor de juiste bewaking, beëindigingsvereisten en procedures.
3. Geautomatiseerde bloedafname en intraveneuze injectie
- Geautomatiseerde bloedafname
- Om dit protocol te volgen, gebruikt u een bemonsteringsvolume van 20,0 μL en stelt u een interval ( d.w.z. 7,0 min) in tussen elke bemonstering om een bemonsteringsfrequentie van elke 10,0 min per monster te hebben. De maximale snelheid is om continu te bemonsteren met 3,0 min/monster; het minimaal mogelijke bemonsteringsvolume is 5,0 μL. Een gelijke hoeveelheid zoutoplossing wordt automatisch teruggegeven door het systeem om het bemonsterde bloed te vervangen en de vochtbalans van het lichaam op peil te houden.
- Stel de totale bemonsteringstijd in op 30 (t = -30 - 0) min vóór en 30 (t = 0 - 30) min na de intraveneuze injectie van CNO (0,5 mg/kg, figuur 2).
- Elk afgenomen bloedmonster (20,0 μL) wordt automatisch verdund in 50 μL zoutoplossing (met heparine van 10 E/ml) en afzonderlijk opgeslagen in een microbuisje dat door het systeem in een gekoelde monstercarrousel wordt gehouden.
- Geautomatiseerde intraveneuze injectie
- Koppel de veneuze lijn los van de veneuze katheter om CNO (individueel berekende volumedosis van ~50-60 μL bij 0,5 mg/kg) bij te vullen, ten minste 2 uur voordat de bloedafname begint.
- Zuig de oplossing (iets meer dan het berekende volume) handmatig retrograde uit de lijn met de injectiespuit, waarbij u een kleine luchtbel laat tussen de oplossing en de bestaande zoutoplossing in de leiding.
- Sluit de injectielijn weer aan op de veneuze katheter en stel de injectiesnelheid in op 500 μL/min en de starttijd van de injectie op 2 minuten nadat t = 0 bemonstering is voltooid. De totale injectietijd voor elk dier is 5-6 s.
OPMERKING: Indien nodig kan de verbinding ook worden toegediend door middel van een handmatige intraperitoneale injectie (IP), maar hiervoor moet het dier tijdens of vóór het bloedafnameprotocol worden gestoord. Dit alternatief laten we ook zien in de resultaten.
4. Dierlijke perfusie en hersenverzameling (OPTIONEEL)
OPMERKING: Deze procedure mag alleen worden gevolgd als de hersenen nodig zijn om de hersenplaats van neuronale activering of stroomafwaartse reacties te analyseren.
- Koppel de muis los van het bloedafnamesysteem aan het einde van het afnameprotocol. Twee uur na de intraveneuze injectie moet het dier worden doordrenkt met 10% neutraal gebufferde formaline (NBF), volgens de voorkeursmethode of zoals elders beschreven22.
- Ontleed de hersenen en bewaar ze gedurende 3 uur in 20% sucrose in 10%-NBF om de fixatie voort te zetten.
- Breng na 3 uur de vaste hersenen over op 20% sucrose in PBS en bewaar bij 4 °C tot ze klaar zijn voor sectie.
OPMERKING: Vermijd overfixatie, omdat dit de cFOS-antigenen maskeert. In de 20% sucrose-oplossing moeten de hersenen naar de bodem van de container zinken. - Maak secties met behulp van een vriesmicrotoom of cryostaat en gebruik de voorkeursmethode om naar neuronale activering te kijken (bijv. cFOS-immunohistochemie wordt getoond).
OPMERKING: De antilichamen die voor de huidige resultaten worden gebruikt, worden beschreven in de materiaaltabel.
5. Verwerking en analyse van monsters
- Verwijder direct na het einde van het experiment bloedmonsters uit de automatische monsternemer en leg ze op ijs.
- Draai de monsters gedurende 30 s rond op 14.000 × g .
- Verzamel het plasma. Bewaar het bij -80 °C tot analyse.
- Test de bloedmonsters met LH ELISA zoals beschreven voor10,23.
Representative Results
Neuronen die kisspeptine tot expressie brengen (Kiss1-gen) die zich in de boogvormige kern van de hypothalamus bevinden, zijn een krachtige stimulator van GnRH en dus van LH-afgifte uit de hypofyse24,25. In deze protocoldemonstratie hebben we kisspeptine-geïnduceerde LH-secretie gebruikt om de werking van de geautomatiseerde bloedafnametechniek te illustreren. Figuur 2 toont representatieve LH-patronen bij volwassen Kiss1-eYFP-vrouwtjes die eerder een unilaterale stereotaxische injectie van AAV-hM3Dq-mCherry in de boogvormige kern kregen (AP: -4,95, ML: -0,35, DV: -5,7). De ChR2-eYFP werd gebruikt als een fluorescerende reporter voor Kiss1-cellen. Een maand na de stereotaxische operatie ondergingen de muizen een canulatie van de halsslagader en de halsader en werden ze 4 dagen na de operatie aangesloten op de automatische bloedmonsternemer. Bloedafnames voor het bepalen van basale LH-waarden werden de volgende dag gestart met een bemonsteringsfrequentie van 10 minuten (interval van 7 minuten tussen monsters en 3 min/bemonstering), gevolgd door een geautomatiseerde IV CNO-injectie en voortgezette bloedafname om de 10 minuten gedurende 30 minuten. Diëstrous LH-niveaus zijn over het algemeen laag (Figuur 2A), maar variaties worden meestal waargenomen vanwege de pulserende afgifte (Figuur 2B). Na de CNO-injectie (en activering van kisspeptine-neuronen) was de stijging van LH sterk (binnen 10 minuten). Het niveau van de toename en de duur van de piek hangt af van tal van factoren, waaronder de plaats van de injectie, het aantal geactiveerde neuronen of de beoogde populatie.
Figuur 3 toont de injectieplaats in de hersenen in de boogvormige kern van de vrouwelijke muis, weergegeven in figuur 2A. Kiss1-eYFP-neuronen zijn groen gelabeld, terwijl de mCherry-immunoreactiviteit de plaats van de AAV-injectie en activering na CNO aangeeft. Geactiveerde neuronen werden gedetecteerd met behulp van cFOS-immunoreactiviteit, gelabeld met DAB. De meeste mCherry-neuronen co-lokaliseerden met Kiss1-eYFP, en velen vertoonden cFOS-immunoreactiviteit, wat aantoont dat de virale en neuronale activering specifiek was voor de beoogde populatie.
Een representatief LH-pulsatiel patroon van afgifte in diestrous wildtype (C57BL/6J) muizen, gevolgd door de respons op een IP-injectie van kisspeptine-10, wordt weergegeven in figuur 4. De muis onderging een canulatie van de halsslagader en werd 4 dagen na de operatie aangesloten op het automatische bloedafnamesysteem. De volgende ochtend werden de oestrische cycli gecontroleerd en werden de bloedafname en kisspeptine-10-injectie uitgevoerd op de diestrous dag26. Bloedmonsters werden elke 7 minuten verzameld gedurende 2 uur (interval van 4 minuten, plus 3 minuten/bemonstering gedurende 120 minuten vóór de injectie) om de basislijnwaarden en LH-pulsatiliteit te bepalen, gevolgd door een IP-injectie van kisspeptine-10 (65 μg/kg) en voortgezette bloedafname om de 7 minuten gedurende nog eens 30 minuten. Er werden duidelijke LH-pulsen waargenomen die typisch zijn voor een vrouw in diestrous, met lage basale LH-waarden, een pulsfrequentie van ~2 pulsen/uur en een pulsamplitude van ~1 ng/ml27. Een onmiddellijke en robuuste toename van LH werd gedetecteerd als reactie op toediening van kisspeptine28. De LH-secretiepatronen en veranderingen na stimulatie zijn in overeenstemming met andere onderzoeken met handmatige bloedafname 10,27,29,30. Deze resultaten tonen aan dat de geautomatiseerde bloedafnamemethode typische en gestimuleerde LH-secretie vastlegt onder een stressvrije toestand.
Afbeelding 1: Details van het connectorsysteem en de muisaansluitingen op de slangen van het infuus- en bemonsteringssysteem. (A) Een met siliconen beklede slangconnector (MASA) geconstrueerd met behulp van twee 25G-naaldslangen en twee PE-20-slangen, omhuld in een silastische slang die is bevestigd met een kleine metalen ring. (B) Een muis die is aangesloten op de infusie- en bemonsteringsslang in de bemonsteringskooi en die tijdens de bloedafname in zijn nest rust. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten voor LH-pulsen in vrouwelijke muizen van Kiss1-Cre geïnjecteerd met AAV-hM3Dq in de boogvormige kern en op afstand geactiveerd met CNO. De basale LH-waarden werden gedurende een half uur elke 10 minuten gemeten. Op tijdstip 0 na de bloedafname kreeg de vrouw een intraveneuze injectie met clozapine-N-oxide (0,5 mg/kg) en werd er gedurende nog eens een half uur elke 10 minuten bloed afgenomen uit de halsslagader. (A) Toont een vrouwtje met lage basale LH-waarden. (B) Toont een vrouwtje dat een LH-puls pre-injectie vertoont. Afkortingen: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = adeno-geassocieerd virus; CNO = clozapine-N-oxide; LH = luteïniserend hormoon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Hersenactivatie in de boogvormige kern van de Kiss1-Cre; Chr2-eYFP (Kiss1-eYFP) vrouw weergegeven in figuur 2A. ChR2-eYFP werd alleen gebruikt als een reporter-gen om kiss1-neuronen te labelen. (A) Fluorescentiebeeld met lage vergroting dat de plaats van de AAV-injectie in de boogvormige kern toont. Groen: eYFP-immunoreactiviteit, Magenta: mCherry-immunoreactiviteit. (B) Helder veldbeeld met lage vergroting van het gebied dat overeenkomt met figuur 3A, met cFOS-immunoreactiviteit (zwart) op de plaats van de AAV-injectie in de Arcuate-kern. (C) Fluorescentie met hoge vergroting en helderveldbeeld gecombineerd met een nadere blik op de neuronen in figuur 3A,B. Kiss1-eYFP-neuronen die AAV-mCherry tot co-expressie brengen en die zijn geactiveerd, zijn die met wit cytoplasma en zwarte kern (pijlen). Schaalbalken = 50 μm (A,B), 20 μm (C). Afkortingen: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = adeno-geassocieerd virus; eYFP = versterkt geel fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Basale LH-pulsatiliteit bij een diestrous wildtype vrouwtje gemeten om de 7 minuten gedurende 2 uur. Het vrouwtje kreeg vervolgens een intraperitoneale injectie van kisspeptine-10 (65 μg/kg) op tijdstip 0, en gedurende een half uur werden continu bloedmonsters verzameld. Afkorting: LH = luteïniserend hormoon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Met behulp van dit protocol waren we in staat om basale LH-pulsatiliteit en LH-secretie aan te tonen na stimulatie van een neuronale populatie. De grote voordelen van het systeem zijn de stressvrije omgeving waarin de bemonstering plaatsvindt, zonder menselijke aanwezigheid of handeling tijdens de bloedafname. Bovendien was er geen voorafgaande moeizame training van de dieren en aanpassing aan menselijke aanwezigheid of behandeling tijdens het experiment vereist. Eerdere experimenten met handmatige bloedafname vereisten veel tijd en moeite om stressoren te minimaliseren 7,31,32. Alleen het afknippen van de staart is echter een stressfactor33. Het implementeren van een niet-stressvolle omgeving en trainingsparadigma in gedeelde dierenfaciliteiten, waar onderbrekingen onvoorspelbaar zijn, kan ook een beperking zijn. In sommige laboratoria moeten dieren vaak naar alternatieve behandelkamers worden vervoerd voor bloedafname. Deze beperkingen kunnen de handmatige methode ongeschikt maken voor het detecteren van subtiele veranderingen in LH-niveaus, en daarom kan een hands-off benadering in deze situaties nuttig zijn. Geautomatiseerde bemonstering vindt plaats in een stille ruimte waar de muizen enkele dagen van tevoren worden geplaatst om te acclimatiseren aan de nieuwe omgeving. Onze eerdere ervaring met dit protocol leverde een nauwkeurige detectie op van corticosteron- en pulsatiele groeihormoonsecretiepatronen bij muizen, waarbij geen verhoogde corticosteronspiegels werden vertoond tijdens de geautomatiseerde bemonstering15. In de huidige experimenten waren alle dieren goed aangepast aan het bemonsteringssysteem dat nestbouw in de bemonsteringskamer na ~24 uur en een heldere haarkleur liet zien, wat wijst op een gebrek aan stress en een algehele goede gezondheidstoestand (Figuur 1).
De grootste moeilijkheid die tot negatieve resultaten leidt, is waarschijnlijk de ongepaste targeting van de AAV op de vereiste neuronale populatie. Precisie bij de stereotaxische injecties is essentieel en er moet van tevoren training worden gegeven om de coördinaten en injectievolumes te verifiëren. Training kan worden gedaan door een kleine hoeveelheid 0,5-1% Evans Blue op de gewenste locatie te injecteren bij een niet-hersteloperatie en vervolgens een plakje van de vers ontlede hersenen te nemen met behulp van een muizenhersenmatrix (bijv. Ted Pella) om de plaats en grootte van de injectie te controleren met behulp van een stereoscoop.
Het is ook belangrijk om er rekening mee te houden dat bloed en plasma dat wordt verzameld uit het geautomatiseerde bloedafnamesysteem zal worden verdund in gehepariniseerde zoutoplossing (bijv. 20 μL bloed in 50 μL zoutoplossing in onze resultaten)20, en dat de verdunningsverhouding mogelijk moet worden aangepast aan de gevoeligheid van de geselecteerde analysemethode. We testten LH-waarden in volbloed verdund in BSA-PBS (zoals aanbevolen voor Ultra-Sensitive LH ELISA)10 of zoutoplossing en vonden geen verschillen in LH-waarden. Tween kan niet in het verdunningsmiddel worden gebruikt, omdat dit in het bloedsysteem zal circuleren om de monsters te extraheren door de monstervloeistoffente vervangen 20. Onze ervaring is dat verdunningen van minder dan 1:10 goede LH-resultaten gaven, maar de LH-waarden enigszins werden onderschat in vergelijking met 1:3,5. Dit geeft aan dat de verdunning verder kan worden aangepast om de hoeveelheid afgenomen bloed te verminderen, indien nodig.
Een alternatief voor geautomatiseerde toediening van verbindingen is het uitvoeren van handmatige injecties via de veneuze katheter. In dit geval is de onderzoeker kort aanwezig in de kamer om de injectie toe te dienen. Er is echter geen direct contact met de dieren of hun huisvesting en omgeving en, in tegenstelling tot intraperitoneale of subcutane injecties, wordt de hele procedure vaak niet opgemerkt door het dier. De voordelen van een handmatige injectie zijn dat de verdunning van de verbinding niet van tevoren hoeft te worden ingesteld, wat van cruciaal belang kan zijn voor verbindingen die te duur zijn om in grotere hoeveelheden te gebruiken of gevoelig zijn voor afbraak in de loop van de tijd; omdat het werkvolume kleiner is dan bij geautomatiseerde toediening, waar de infuuslijn en de katheter moeten worden voorgevuld met meer samengestelde oplossing.
Automatische bloedafname biedt een unieke mogelijkheid om LH-variaties tijdens bijvoorbeeld de slaap te bestuderen. We hebben regelmatig dieren waargenomen die tijdens de bemonsteringstijd in hun nest sliepen. Het is mogelijk om deze bemonstering te koppelen aan EEG-opnames om een meer gedetailleerde analyse te genereren van de relatie tussen neurale activiteit en LH-patroon34. Zoals hier wordt aangetoond, zijn de mogelijkheden voor het gebruik van geautomatiseerde bloedafname talrijk: van basale LH-bemonstering tot het testen van de LH-respons op endogene of exogene verbindingen, of tot activering of onderdrukking van neuronale populaties. De neuronale manipulaties kunnen acuut worden geïmplementeerd met chemogenetica of optogenetica, of permanent met behulp van transgene muismodellen en apoptotische of neuronale uitschakelingstools. Geautomatiseerde bloedafname maakt het ook mogelijk om andere hormonen met zeer pulserende secretoire patronen te meten (bijv. groeihormoon15). Bij vrouwelijke muizen kunnen, als een specifieke fase van de oestrische cyclus vereist is, vaginale uitstrijkjes zorgvuldig worden verzameld uren voordat het protocolwordt gestart 26 zonder de infusie- en bemonsteringslijnen te verstoren. Dieren kunnen gedurende 7-10 dagen op het bemonsteringssysteem worden aangesloten, waarbij het risico op stolling van de arteriële lijn in de loop van de tijd toeneemt.
Deze techniek is echter beperkt tot gebruik bij dieren met één huis en is daarom mogelijk niet geschikt voor het bestuderen van sociale interacties. Het is ook invasief en vereist technisch uitdagende chirurgie, dus het is misschien niet mogelijk om het te implementeren met jonge dieren of bepaalde ziektemodellen. Ten slotte, omdat de kosten voor de aanschaf van het systeem te hoog kunnen zijn voor een enkel onderzoekslaboratorium, zou het raadzaam zijn om het op te zetten in een kernlaboratorium dat het genoemde experimentele protocol als diensten aanbiedt.
Concluderend laat dit protocol zien hoe stereotactische toediening van AAV kan worden uitgevoerd in combinatie met geautomatiseerde bloedafname. De nauwkeurige ruimtelijke en temporele controle die met deze techniek wordt bereikt, samen met de flexibiliteit van toepassing op verschillende modellen, meetprotocollen en hormonen, maakt het een krachtige methode voor de studie van hormonale regulatie bij knaagdieren. Het belangrijkste is dat de methode een stressvrije omgeving biedt door menselijke aanwezigheid en hantering tijdens injectie en/of bemonstering en voorafgaande training van de dieren te elimineren. Deze voordelen, samen met de mogelijkheid van multiplexing, maken deze methode tot een uniek hulpmiddel voor het bestuderen van de neurale controle van hormonale veranderingen bij bewuste, vrij bewegende en ongestoorde muizen.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
We danken Dr. Daniel Haisenleder voor zijn hulp bij het testen van verschillende bloedverdunningsmethoden. Serumhormoontesten werden uitgevoerd aan het University of Virginia Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core, ondersteund door de Eunice Kennedy Shriver NICHD Grant R24 HD102061. Het Michigan Mouse Metabolic Phenotyping Center-Live wordt ondersteund door NIH Center Grant U2C DK135066. JF en NQ worden ondersteund door DK020572 (MDRC) en DK089503 (MNORC) subsidies. CFE en CSM worden ondersteund door de NICHD-subsidie R21 HD109485 en R01 HD096324.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Not necessarily this virus but this was the one used for representative results |
| Alcohol | Disinfection | ||
| Anesthesia Induction box | Vetequip | ||
| Anesthesia induction machine | Kent Scientific Equipment | SomnoSuite | |
| Anesthesia masks for mice | Kent Scientific Equipment | SOMNO-0801 | |
| Autoclip applier 9 mm | Clay Adams | 427630 | |
| Autoclip remover 9 mm | Clay Adams | 427637 | |
| Autoclips 9 mm | Clay Adams | 427631 | |
| BASi Culex Controller | Culex | SN: 2151, 2152, 2156, 2158 | 4 stations |
| BASi Honey Comb Fraction Collector | Honey Comb | SN: 2105, 2106, 2107, 2108 | 4 stations |
| BASi Ratrun Rotation Control | RATURN 2 | SN: 5680, 5681, 5682, 5683 | 4 stations |
| C57BL/6J mice | JAX # 000664 | ||
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl | Analgesic |
| Clippers | Braun | ||
| Clozapine-N-oxide | ENZO | BLM-NS105-0005 | |
| Cotton tipped applicators | |||
| CULEX Automated In Vivo Sampling System | BASi | DS000627 | with CX-4000S Replacement Tubing Sets |
| Curved forceps serrated | FST | 11151-10 | |
| Drill | Dremel | 61100 | |
| Empis control Module | EMPIS CM | SN: 174 | |
| Empis Programmable Infusion System | EMPIS | SN: 2125 , 2126, 2127, 2128 | With CX-7010S 4 BAS-2 Infusion Sets; 4 stations |
| Envigo 2016 diet | low-phytoestrogen diet | ||
| Eye ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment | Petrolatum Ophtalmic oinment |
| Glass pipettes | World Precision Instruments | MIB100-6 | |
| Hemostats | Roboz Surgical | RS-7101 | |
| Iodine | Betadine Surgical scrub | ||
| Isoflurane | VetOne | Fluriso | Anesthetic |
| Isoflurane Vaporizer or SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Surgivet or Kent Scientific Corp | SS-01 | Anesthesia Machine |
| Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) mice | JAX # 023436 and #024109 | ||
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals | 048-56 | |
| Micro-renathane tubing | Braintree Scientific | MRE025 | Surgical catheterization |
| Micro-Scissors | Roboz Surgical | RS-5606 | |
| Needle Holder | Roboz Surgical | RS-7842 | |
| Picoliter injector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P30 | |
| Rodent Warmer X2 | Stoelting | 53850 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 | |
| Scissors | Roboz Surgical | RS-6808 | |
| Silicon tubing | Liveo Laboratory Tubing | NO.508-001 | 0.012 in I.D x 0.025 in O.D. |
| Stereotaxic table | RWD | E06208 | |
| Sterile 0.9% saline | Baxter | 2F7124 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical blades | SKLAR | 06-3011 | |
| Surgical stereoscope | Zeiss | f-160 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4972 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-5058 | |
| Antibodies | |||
| Anti-cFos | Millipore | ABE457 | Antigen target: N-terminus cFos; Host organism: Rabbit; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2631318 |
| Anti-GFP | Aves Labs | GFP-1010 | Antigen target: recombinant GFP null; Host organism: Chicken; Dilution used: 1:10,000; RRID: AB_2307313 |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs | 711-065-152 | Antigen target: Rabbit IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:1,000; RRID: AB_2340593 |
| Donkey anti-Rat IgG, AlexaFluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21209 | Antigen target: Rat IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2535795 |
| Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | Antigen target: Chicken, IgY (H+L); Host organism: Goat; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2534096 |
| mCherry monoclonal (16D7) | Thermo Fisher Scientific | M11217 | Antigen target: mCherry tag; Host organism: Rat; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2536611 |
References
- Kokoris, G. J., Lam, N. Y., Ferin, M., Silverman, A. J., Gibson, M. J. Transplanted gonadotropin-releasing hormone neurons promote pulsatile luteinizing hormone secretion in congenitally hypogonadal (hpg) male mice. Neuroendocrinology. 48 (1), 45-52 (1988).
- Coquelin, A., Desjardins, C. Luteinizing hormone and testosterone in young and old male mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 243 (3), E257-E263 (1982).
- Carmel, P. W., Araki, S., Ferin, M. Pituitary stalk portal blood collection in rhesus monkeys: Evidence for pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH). Endocrinology. 99 (1), 243-248 (1976).
- Schuiling, G., Gnodde, H. Site of origin of the pulsatile secretion of luteinizing hormone in long-term ovariectomized rats. Journal of Endocrinology. 70 (1), 97-104 (1976).
- Hackwell, E. C. R., Ladyman, S. R., Brown, R. S. E., Grattan, D. R. Mechanisms of lactation-induced infertility in female mice. Endocrinology. 164 (5), 1-12 (2023).
- Bahougne, T., Kretz, M., Angelopoulou, E., Jeandidier, N., Simonneaux, V. Impact of circadian disruption on female mice reproductive function. Endocrinology. 161 (4), (2020).
- Kreisman, M. J., McCosh, R. B., Tian, K., Song, C. I., Breen, K. M. Estradiol Enables Chronic Corticosterone to Inhibit Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion and Suppress Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Neuroendocrinology. 110 (6), 501-516 (2020).
- Moenter, S. M., Evans, N. P. Gonadotropin-releasing hormone GnRH measurements in pituitary portal blood. Journal of Neuroendocrinology. 34 (5), 13065 (2022).
- Maeda, K. I., et al. The LHRH pulse generator: A mediobasal hypothalamic location. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 19 (3), 427-437 (1995).
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
- Minabe, S., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K. Analysis of pulsatile and surge-like luteinizing hormone secretion with frequent blood sampling in female mice. Journal of Reproduction and Development. 57 (5), 660-664 (2011).
- Perreau-Lenz, S., Kalsbeek, A., Pévet, P., Buijs, R. M. Glutamatergic clock output stimulates melatonin synthesis at night. European Journal of Neuroscience. 19 (2), 318-324 (2004).
- Herwig, A., Pévet, P., Bothorel, B., Steinlechner, S., Saboureau, M. Trans-pineal microdialysis in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): A tool to study seasonal changes of circadian clock activities. Journal of Pineal Research. 40 (2), 177-183 (2006).
- Adams, J. M., Otero-Corchon, V., Hammond, G. L., Veldhuis, J. D., Qi, N., Low, M. J. Somatostatin is essential for the sexual dimorphism of GH secretion, corticosteroid-binding globulin production, and corticosterone levels in mice. Endocrinology. 156 (3), 1052-1065 (2015).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).
- Krashes, M. J., et al. reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eighth edition. National Research Council. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188 (2011).
- Peters, S., et al. Culex ABS Part I: Introduction to automated blood sampling. Current Separations. 18 (4), 139-145 (2000).
- Bohs, C., Cregor, M., Gunaratna, G., Kissinger, C. Culex Automated blood sampler part II Managing freely-moving animals and monitoring their activity. Current Separations. 18 (4), 147-151 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kreisman, M. J., Mccosh, R. B., Breen, K. M. A Modified ultra-sensitive ELISA for measurement of LH in mice. Endocrinology. 163 (9), (2022).
- Pielecka-Fortuna, J., Chu, Z., Moenter, S. M. Kisspeptin acts directly and indirectly to increase gonadotropin-releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by estradiol. Endocrinology. 149 (4), 1979-1986 (2008).
- Kumar, D., et al. Specialized subpopulations of kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in female mice. Endocrinology. 156 (1), 32-38 (2015).
- Caligioni, C. S.
- Czieselsky, K., et al. Pulse and surge profiles of luteinizing hormone secretion in the mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Wang, L., et al. Genetic dissection of the different roles of hypothalamic kisspeptin neurons in regulating female reproduction. eLife. 8, 43999 (2019).
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), e57894 (2018).
- Vanacker, C., Defazio, R. A., Sykes, C. M., Moenter, S. M. A role for glial fibrillary acidic protein (Gfap)-expressing cells in the regulation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) but not arcuate kisspeptin neuron output in male mice. eLife. 10, e68205 (2021).
- Dulka, E. A., Defazio, R. A., Moenter, S. M. Chemogenetic suppression of GnRH neurons during pubertal development can alter adult GnRH neuron firing rate and reproductive parameters in female mice. eNeuro. 7 (3), 0223 (2020).
- Talbi, R., et al. Characterization of the Action of Tachykinin Signaling on Pulsatile LH Secretion in Male Mice. Endocrinology. 162 (8), 1-9 (2021).
- Tuli, J., Smith, J., Morton, D. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animals. 29 (1), 90-95 (1995).
- Lucien, J. N., Ortega, M. T., Shaw, N. D.
