Summary
황체 형성 호르몬(LH) 박동은 생식 기능의 특징입니다. 우리는 연속적인 자동 혈액 수집과 관련된 특정 신경 세포 집단의 원격 활성화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 시간 제한 호르몬 조절, 다중화 및 의식이 있고 자유롭게 움직이며 방해받지 않는 동물의 LH 수준에 대한 조작 효과를 최소화할 수 있습니다.
Abstract
순환 황체 형성 호르몬(LH) 수치는 시상하부-뇌하수체 생식 조절 기능의 필수 지표입니다. LH 방출의 조절에 있는 수많은 투입 그리고 신경 세포의 역할은 아직도 알려져 있지 않습니다. 생쥐의 LH 수치 변화를 측정하는 것은 환경 스트레스에 의해 쉽게 방해를 받기 때문에 종종 어려운 일입니다. LH 방출 및 박동성을 측정하는 현재의 기술은 마우스가 조작 스트레스, 특정 구속, 연구자의 존재 및 개별 동물에 대한 작업에 적응하도록 장기간 훈련이 필요하므로 많은 연구 질문에 대한 유용성이 떨어집니다.
이 논문은 의식이 있고 자유롭게 움직이며 방해받지 않는 쥐에서 자동화된 순차 혈액 샘플링과 결합된 DREADD(Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs) 기술을 사용하여 특정 신경 세포 집단을 원격으로 활성화하는 기술을 제시합니다. 먼저 DREADD를 발현하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 특정 신경 세포 집단에 전달하기 위한 입체 수술 프로토콜에 대해 설명합니다. 다음으로 경동맥 및 경정맥 캐뉼레이션 프로토콜과 CULEX 자동 혈액 샘플링 시스템에 대한 수술 후 연결에 대해 설명합니다. 마지막으로, 원격 신경 활성화 및 자동 혈액 수집을 위한 클로자핀-N-옥사이드 정맥 주사 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술을 사용하면 주어진 기간 동안 5분 이상마다 프로그래밍된 자동 샘플링과 원하는 시점 또는 기간에 정맥 주사 물질 주입이 가능합니다. 전반적으로, 우리는 이 기술이 신경내분비 조절에 대한 연구를 위한 강력한 접근법이라는 것을 발견했습니다.
Introduction
시상하부-뇌하수체-생식선(HPG) 축은 뇌하수체 문맥계로 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH)의 박동성 방출에 의해 중앙적으로 조절됩니다. 뇌하수체에서 GnRH는 성선 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬(LH) 및 난포 자극 호르몬(FSH)이 순환계로 방출되는 박동성 방출을 조절합니다. LH 박동성 방출은 중앙 HPG 축 기능 1,2,3,4의 특징입니다. 예를 들어, 유전적 변화 또는 호르몬 또는 환경 요인의 변화가 축 5,6,7의 신경 부분에 미치는 영향을 표시합니다. 최근까지 LH 박동성 패턴의 측정은 맥박을 식별하는 데 필요한 높은 샘플링 빈도와 많은 양의 혈액을 감안할 때 대형 포유류8 및 랫트9로 제한되었다.
마우스에서 LH 펄스를 검출하는 것은 이 종이 광범위한 유전 모델을 사용할 수 있고 특정 유전자 및 세포 집단을 추가로 연구하기 위해 게놈 엔지니어링 기술을 사용하여 쉽게 조작할 수 있기 때문에 바람직합니다. 지난 10년 동안, 샌드위치 LH 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 마우스의 LH 농도 분석이 크게 발전함에 따라 미세한 양의 혈액에서 LH를 검출할 수 있게 되었다10. 빈번한 꼬리-팁 혈액 샘플링 기술의 개발은 마우스(10,11)에서 LH 펄스의 주파수 및 진폭을 검출하기 위해 필요한 빈번한 샘플링을 가능하게 하였다. 그러나 꼬리 끝 혈액 샘플링은 의식이 있는 깨어 있는 동물에서만 사용할 수 있습니다. 생쥐가 샘플링 중 지정된 조사관의 취급과 존재에 적응하기 위해 긴 훈련 기간이 필요합니다. 그 성공은 환경 스트레스 요인에 매우 민감하며 높은 수준의 불안을 보이는 마우스 균주에 사용하기에 적합하지 않을 수 있습니다. 심방 내 캐뉼레이션(intra-atrial cannulation)은 또한 자유롭게 움직이는 의식이 있는 마우스(consciousness mouse)에서 빈번한 혈액 샘플링을 위해 사용되어 왔다12. 그러나 이러한 설정은 여전히 반복적인 수동 혈액 샘플링이 필요하고 동물의 이동 공간을 제한하는 반면, 심방 캐뉼레이션은 심장 기능의 동적 변화로 이어질 수 있습니다. 그러므로, 사전 훈련이나 인간의 취급 또는 존재에 대한 필요 없이 의식이 있고, 자유롭게 움직이고, 방해받지 않는 마우스에서 스트레스 없는 조건 하에서 혈액 수집을 위한 방법을 확립하는 것이 바람직하다.
자동화된 혈액 또는 투석액 샘플링은 이전에 억제되지 않은 설치류에서 다양한 호르몬 수치(예: 멜라토닌13,14)와 박동성 분비(예: 성장 호르몬)15를 측정하는 데 사용되었습니다. 본 연구에서는 화학유전학적 기술, 즉 디자이너 약물(DRED)에 의해 독점적으로 활성화되는 디자이너 수용체(designer receptor)를 사용하여 특정 신경 세포 집단의 적시 원격 활성화와 함께 의식이 있고 억제되지 않은 동물에서 자동화된 장기 빈번한 혈액 샘플링을 위한 프로토콜을 제시합니다. 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 입체 전달과 클로자핀-N-옥사이드(CNO)의 자동 정맥 주사(IV) 전달에 의한 원격 활성화에 대해 설명합니다16,17. 이 프로토콜은 동시에 여러 동물에서 기초 수준과 LH 박동성의 유도된 변화를 순차적으로 검출할 수 있습니다. 화합물의 혈액 샘플링과 IV 전달은 모두 컴퓨터 프로그램을 통해 시간 제어 방식으로 수행되므로 조사자의 물리적 존재 또는 사전 마우스 훈련에 대한 요구 사항이 없습니다. 이 방법은 수동 혈액 샘플링의 주요 한계를 극복합니다. 스트레스 없는 상태에서 혈액 샘플링을 할 수 있으며 원격 신경 세포 활동 제어와 결합된 동시 IV 화합물 전달이 가능합니다. 자동 혈액 샘플링을 단독으로 사용하거나 원격 신경 활성화와 함께 사용한 대표적인 결과를 보여주고 장점, 한계 및 추가 용도에 대해 논의합니다.
Protocol
모든 동물 시술은 실험동물의 관리 및 사용에 관한 국가연구위원회(National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)18 및 연방, 주 및 지역 법률에 따라 수행됩니다. 4마리의 C57BL/6J 암컷과 4마리의 Kiss1-Cre를 포함하여 성인 암컷 마우스(3-6개월령)가 이 프로토콜 시연에 사용되었습니다. ChR2-eYFP(Kiss1-eYFP) 암컷. 생쥐는 12:12 빛:어둠 주기 하에서 22°C에서 온도를 조절하고 저식물성 에스트로겐 식단으로 임시 리비텀 을 먹였습니다. 절차 및 프로토콜은 University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC, Animal Protocols: PRO00010420 and PRO00010138)의 승인을 받았습니다.
1. 특정 세포 집단에 대한 AAV의 입체 전달
- 수술 준비
- 모든 도구를 소독하십시오. 각 포장이 5마리 이하의 동물에게 사용되도록 여러 개의 수술 도구 패키지를 준비합니다. 멸균 장갑을 준비하고, 각 동물당 최소 한 켤레를 준비하십시오.
- 천천히 꾸준히 주입되고 쉽게 막히지 않는 길고 얇은 마이크로피펫의 경우 가열 1: 915, 가열 2: 630, 당기기: 630 설정(재료 표 참조)을 사용하여 주입을 위해 유리 마이크로피펫을 당깁니다. 각 풀러에 대해 이러한 설정을 최적화합니다.
- 지정된 수술 공간에서 수술을 시행합니다. 수술 표면을 70% 에탄올로 소독합니다.
- 수술 부위의 멸균 상태를 유지하기 위해 멸균 드레이프를 사용하십시오. 깨끗한 실험복이나 일회용 가운과 마스크를 착용하십시오.
- 흡입 마취 시스템을 준비합니다. 산소 공급 장치를 열고 유량을 0.8L/min으로 조절합니다.
- 외과
- 마우스를 마취 상자에 넣고 이소플루란을 2.5%까지 엽니다. 초기 유도 후 이소플루란 흐름을 2%로 줄입니다. 절차 전반에 걸쳐 흐름을 유지하십시오. 대체 마취 방법은 동물 프로토콜 및 지역 윤리 위원회 지침을 참조하십시오.
- 선제적 진통제(카프로펜 5mg/kg s.c.)를 동물 사용 위원회 권장 사항 및 현지 규정에 따라 주사합니다.
- 가위를 사용하여 마우스 머리를 면도하십시오.
- 동물을 입체 테이블에 설치하고 이어 바를 놓고 헤드가 올바르게 고정되고 안정적인지 확인하십시오. 마우스의 입을 마우스피스에 고정하고 질식을 방지하기 위해 혀를 입 바깥쪽으로 놓아야 합니다.
- 수술을 시작하기 전에 동물이 발가락 꼬집음으로 깊이 마취되었는지 확인하고 수술 내내 쥐의 호흡과 색상을 모니터링하십시오.
- 마우스 아래에 고도 지지대를 배치하여 몸과 머리가 수평 위치에 수평을 유지하도록 합니다. 종이로 덮인 따뜻한 패드로 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 건조하지 않도록 양쪽 눈에 눈 연고를 바르십시오.
- 수술 부위를 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오. 멸균 장갑을 착용하십시오. 피부를 열기 전에 요오드와 알코올로 쥐의 머리를 소독하십시오. 메스를 사용하여 정중선을 따라 대략 눈 뒤에서 람다 봉합사 뒤까지 머리의 피부를 자릅니다. 두개골을 노출된 상태로 유지하고 멸균 0.9% NaCl이 포함된 면봉으로 청소합니다.
- 로스트랄 코 정맥(RRV)을 찾아 멸균 연필로 표시합니다. 나머지 절차에는 스테레오스코프를 사용합니다.
참고 : RRV를 전후 참조로 사용하여 더 나은 결과를 얻을 수 있지만 bregma를 참조로 사용하는 것이 표준입니다. - 멸균 바늘을 참조로 사용하여 입체 측정을 진행하기 전에 뇌 방향이 올바른지 확인하십시오. 또한 RRV와 람다에서 두개골 표면의 높이와 측면 기울기가 동일한지 확인하십시오(± 0.02mm).
참고: 측면 기울기는 더 많은 측면 뇌 구조에 주입하는 것과 더 관련이 있습니다. - 멸균 유리 피펫에 주입할 바이러스 용액을 로드합니다. 참조 0 전후(AP)에 대한 RRV 참조로 가져옵니다. 시상 봉합사를 따라 선택한 AP 좌표로 이동합니다. 멸균 연필로 이 위치를 표시하고 바늘을 들어 올린 다음 개두술을 진행합니다.
- 상부 시상동이 부러지지 않도록 표시된 위치 주위에 작은 원을 조심스럽게 뚫습니다. 드릴링하는 동안 압력을 줄이기 위해 드릴을 수직이 아닌 기울어진 위치에 배치하십시오. 작은 집게로 두개골 조각을 제거하십시오.
- 혈관이 노출되면 상시동의 중앙을 사용하여 내측(ML) 기준(지점 0)으로 사용합니다. 이것은 시상 봉합사를 사용하는 것보다 더 정확합니다. 선택한 ML 위치로 이동합니다. 피펫을 내려 등쪽(DV) 기준(지점 0)으로 경막을 접촉합니다. 경막을 약간 부수고 피펫을 선택한 DV 위치로 내려갑니다.
- 원하는 양의 AAV(50-200nL)를 주입하고 적절한 액체 분산을 위해 캐뉼라를 3분 동안 제자리에 두십시오. 뇌에서 피펫을 조심스럽게 꺼냅니다.
- 이어 바에서 마우스를 뗍니다. 수술용 클립이나 선택한 방법을 사용하여 피부를 닫습니다. 회복을 위해 동물을 따뜻한 별도의 케이지에 넣으십시오. 마우스가 깨어난 후의 회복, 반응 및 활동을 모니터링합니다. 완전히 복구되면 마우스를 원래 케이지로 다시 옮깁니다.
- 절차의 두 번째 부분을 진행하기 전에 바이러스 발현을 위해 최소 3-4주 동안 기다리십시오.
2. 경정맥 및 경동맥 캐뉼레이션
- 수술 준비
- 지정된 수술 공간에서 수술을 시행합니다. 시술을 시작하기 전에 수술 표면을 70% 에탄올로 소독하십시오. 각 포장이 5마리 이하의 동물에게 사용되도록 여러 개의 수술 도구 패키지를 준비합니다.
- 모든 수술 기구를 오토클레이브합니다. 그런 다음 멸균수 또는 식염수로 세척하고 수술 사이에 최소 15초(제조업체의 지침에 따라) 동안 뜨거운 비드 멸균기로 도구를 소독합니다.
- 수술 부위의 멸균 상태를 유지하기 위해 멸균 드레이프를 사용하십시오. 깨끗한 실험복이나 일회용 가운과 마스크를 착용하십시오.
- 경동맥과 경정맥의 캐뉼레이션을 위한 마이크로 카테터를 준비합니다. 미세레나단 튜브(0.025인치 외경[OD] x 0.012인치 내경[ID]에서 연장됨)의 작은 세그먼트를 실라스틱 튜브(0.025인치 OD x 0.012인치 ID)와 결합하여 동맥 카테터를 구성합니다. 정맥 카테터는 실라스틱 튜브(0.025인치 OD x 0.012인치 ID)만 사용하여 구성합니다. 수술 전 밤새 모든 카테터를 70% 에탄올에 담그십시오.
- 두 카테터의 절단된 끝을 동물의 체중과 길이에 따라 미리 추정된 길이로 45°로 경사지게 합니다.
- 수술 절차
- 탁상용 저유량 이소플루란 시스템으로 2% 미만의 동물을 마취하여 수술 중 마취 단계와 평면을 정밀하게 제어합니다.
- 진통제(카프로펜 5mg/kg s.c.)를 선제적으로 주사하고 안과 연고를 발라 건조 및 각막 손상을 예방합니다.
- 목의 복부와 뒤쪽 부위를 면도하고 70% 에탄올을 번갈아 가며 요오드 스크럽 3개로 피부를 청소합니다. 견갑골 사이의 수직 피부 절개부(12mm)를 자르고 나중에 사용할 수 있도록 수술용 거즈로 덮습니다. 머리를 외과 의사를 향하게 하여 동물을 앙와위 자세로 놓습니다.
- 아래에 설명된 절차의 대부분의 부분에 스테레오 색인 범위를 사용합니다.
- 쇄골 위쪽의 목 오른쪽에 작은 수직 절개(~10mm)를 하여 오른쪽 경동맥과 경정맥을 노출시킵니다. 가위로 피부를 절개하고 끝이 가는 톱니가 없는 미세 집게를 사용하여 피하 조직을 분리하는 둔기 절개를 수행하여 오른쪽 외부 경정맥과 오른쪽 총경동맥을 노출시킵니다.
- 경정맥의 말단부를 묶어 혈류를 멈추게 하고 무너진 정맥에 미세 집게와 가위를 사용하여 작은 구멍을 뚫습니다. 정맥 카테터를 경사 아래로 삽입하고 한 쌍의 마이크로 겸자를 사용하여 근위부로 삽입하여 상대정맥을 통해 우심방 높이에 도달하도록 전진시킵니다. 삽입 길이는 10g 희박 마우스의 경우 ~12-30mm입니다. 7-0 실크 봉합사를 사용하여 혈관에 고정할 카테터를 묶습니다.
알림: 카테터를 올바른 위치에 놓으면 혈액을 쉽게 빼낼 수 있습니다. 그렇지 않으면 카테터가 외측 흉부 정맥에 잘못 삽입되어 다시 삽입해야 할 수 있습니다. - 결합 조직을 조심스럽게 절개하여 흉골 설근, 흉골 유돌근 및 이위 근육으로 둘러싸인 삼각형 영역에 위치한 오른쪽 총경동맥을 노출시킵니다. 필요한 경우 와이어 견인기를 사용하여 이러한 근육을 분리하십시오. 7-0 실크 봉합사를 사용하여 내부 및 외부 경동맥의 분기 수준에서 동맥을 묶습니다. 풀린 두 개의 봉합사 루프를 근접하게 배치합니다.
- 교체된 봉합사 고리를 당겨 혈류를 일시적으로 멈추고 마이크로 가위나 27G 바늘을 사용하여 혈관 벽에 작은 구멍을 자르거나 구멍을 뚫습니다. 동맥 카테터를 경사 아래로 삽입하고 대동맥 판막에 닿지 않고 미리 추정된 길이로 근접하게 삽입합니다. 삽입 길이는 9g의 린 마우스의 경우 ~10-30mm입니다. 두 개의 교체된 봉합사를 사용하여 혈관에 고정할 카테터를 묶습니다.
- 모든 카테터를 피하로 터널링하고 미리 절단된 절개를 통해 목 뒤쪽에서 외부로 만들고 25G 바늘 튜브로 만든 실리콘 코팅 튜브 커넥터의 정맥 또는 동맥 포트에 연결합니다: 2개의 25G 바늘 튜브와 2개의 4.0cm PE-20 튜브를 사용하여 수정된 MASA19 , 작은 금속 와이어로 만든 링으로 부착된 2.0cm 0.062인치 ID 실라스틱 튜브로 슬리브. 커넥터를 포함한 각 카테터의 총 루멘 부피는 6-8μL입니다(그림 1A).
- 복부 절개 부위를 봉합하고 봉합사로 등피부를 봉합할 때 커넥터를 피하로 고정합니다. 양쪽 카테터를 헤파린화 식염수(200U/mL)로 채우고 끝 부분을 스테인리스 스틸 수술용 와이어로 단단히 꽂습니다.
- 마우스는 몇 분 안에 이소플루란 마취에서 회복되고 5일 이내에 수술 후 완전히 회복됩니다. 수술 후 24시간 후에 동물을 자동 채혈 하우징 챔버에 넣고 시스템의 테더 후크를 목 뒤쪽에 이식된 튜브 커넥터에 부착된 금속 링에 연결하여 시스템에 연결합니다. 샘플링이 시작되기 24시간 전에 동맥 및 정맥 카테터를 각각 주사 및 샘플링 라인에 연결합니다(그림 1B). 샘플링 라인의 총 길이는 길이 55cm 또는 루멘 부피 기준 40μL입니다.
알림: 주입 및 샘플링 라인의 설정, 수집 방법의 프로그래밍 및 자동 혈액 샘플러 시스템의 케이지 균형 메커니즘은20,21에 자세히 설명되어 있습니다. 이 시스템은 20분마다 10μL의 헤파린화 식염수를 자동으로 전달하여 카테터를 열린 상태로 유지합니다. - 시스템의 컴퓨터 프로그램을 통해 사전 주입 샘플링, 주입 및 주입 후 샘플링 시간 및 주파수를 설정합니다. 현재 설정은 아래 3.1단계를 참조하십시오.
- 이 시스템은 마우스의 움직임(21 )과 반대 방향으로 하우징 챔버를 회전시키면서 마우스의 움직임을 감지함으로써 샘플링 및/또는 주입 라인을 엉키지 않고 동물이 자유롭게 이동할 수 있도록 한다(그림 1).
- 주입 또는 주입 라인을 화합물로 다시 채우고 주입 또는 주입이 시작되기 최소 2시간 전에 정맥 카테터에 다시 연결합니다.
참고: 수술 합병증이 발생할 수 있으며, 회복을 위해 그리고 수술 후 며칠 동안 동물을 면밀히 모니터링해야 합니다. 올바른 모니터링, 살처분 요구 사항 및 절차에 대해서는 동물 프로토콜을 참조하십시오.
3. 자동 채혈 및 정맥 주사
- 자동 채혈
- 이 프로토콜을 따르려면 20.0μL의 샘플링 부피를 사용하고 샘플당 10.0분마다 샘플링 주파수를 갖도록 각 샘플링 사이의 간격(즉, 7.0분)을 설정합니다. 최대 속도는 s를 s하는 것입니다.amp3.0분/샘플로 연속적으로; 가능한 최소 샘플링 부피는 5.0μL입니다. 동일한 양의 식염수가 샘플링된 혈액을 대체하고 체액 균형을 유지하기 위해 시스템에 의해 자동으로 반환됩니다.
- 총 샘플링 시간을 CNO를 정맥 주사하기 전에 30(t = -30 - 0)분, 30(t = 0 - 30)분(0.5mg/kg, 그림 2)으로 설정합니다.
- 수집된 각 혈액 샘플(20.0μL)은 50μL의 식염수(10U/mL의 헤파린 함유)에 자동으로 희석되고 시스템에 의해 냉장 샘플 캐러셀에 보관된 마이크로튜브에 개별적으로 저장됩니다.
- 자동 정맥 주사
- 혈액 샘플링이 시작되기 최소 2시간 전에 CNO(0.5mg/kg에서 ~50-60μL의 부피로 개별적으로 계산된 용량)를 다시 채우기 위해 정맥 카테터에서 정맥 라인을 분리합니다.
- 주입 주사기를 사용하여 라인에서 용액(계산된 부피보다 약간 더 많음)을 수동으로 빼내어 용액과 라인의 기존 식염수 사이에 작은 기포를 남깁니다.
- 주입 라인을 정맥 카테터에 다시 연결하고 주입 속도를 500μL/min 으로 설정하고 t = 0 샘플링 종료 후 주입 시작 시간을 2분 으로 설정합니다. 각 동물의 총 주입 시간은 5-6초입니다.
참고: 필요한 경우 수동 복강 내 주사(IP)로 화합물을 전달할 수도 있지만 혈액 수집 프로토콜 중 또는 그 전에 동물을 방해해야 합니다. 결과에서도 이 대안을 보여줍니다.
4. 동물 관류 및 뇌 채취 (선택 사항)
참고: 이 절차는 뇌가 신경 세포 활성화 또는 다운스트림 반응의 뇌 부위를 분석해야 하는 경우에만 따라야 합니다.
- 채혈 프로토콜이 끝날 때 채혈 시스템에서 마우스를 분리합니다. 정맥 주사 2시간 후, 바람직한 방법을 사용하거나 다른 곳에 기술된 바와 같이 10% 중성 완충 포르말린(NBF)을 동물에게 관류한다22.
- 뇌를 절개하고 10%-NBF의 20% 자당에 3시간 동안 보존하여 고정을 계속합니다.
- 3시간 후, 고정 뇌를 PBS의 20% 자당으로 옮기고 절편할 준비가 될 때까지 4°C에서 보존합니다.
참고: cFOS 항원을 가릴 수 있으므로 과고정을 피하십시오. 20% 자당 용액에서 뇌는 용기 바닥으로 가라앉아야 합니다. - 냉동 마이크로톰 또는 냉동 유지 장치를 사용하여 절편을 만들고 신경 세포 활성화를 관찰하기 위해 선호하는 방법을 사용합니다(예: cFOS 면역조직화학이 표시됨).
참고: 현재 결과에 사용된 항체는 재료 표에 설명되어 있습니다.
5. 시료 처리 및 분석
- 실험이 끝난 직후 자동 샘플러에서 혈액 샘플을 꺼내 얼음 위에 놓습니다.
- 샘플을 14,000× g 에서 30초 동안 회전시킵니다.
- 플라즈마를 수집합니다. 분석할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
- 10,23 전에 설명한 대로 LH ELISA로 혈액 샘플을 분석합니다.
Representative Results
시상하부의 아치형 핵에 위치한 키스펩틴 발현 뉴런(Kiss1 유전자)은 GnRH의 강력한 자극제이며, 따라서 뇌하수체로부터의 LH 방출24,25. 이 프로토콜 시연에서는 키스펩틴 유도 LH 분비를 사용하여 자동 혈액 샘플링 기술의 기능을 설명했습니다. 그림 2는 이전에 아치형 핵에서 AAV-hM3Dq-mCherry의 일방적 입체 주사를 받은 성인 Kiss1-eYFP 암컷의 대표적인 LH 패턴을 보여줍니다(AP: -4.95, ML: -0.35, DV: -5.7). ChR2-eYFP는 Kiss1 세포의 형광 리포터로 사용되었습니다. 입체수술 1개월 후, 마우스는 경동맥 및 경정맥 캐뉼레이션을 받았고 수술 후 4일 후에 자동 혈액 샘플러에 연결되었습니다. 기초 LH 수치를 결정하기 위한 혈액 채취는 다음날 10분 샘플링 빈도(샘플과 3분/샘플링 사이의 7분 간격)로 시작되었으며, 그 후 자동 IV CNO 주입 및 30분 동안 10분마다 계속 혈액 샘플링을 수행했습니다. 다이스트로스 LH 수치는 일반적으로 낮지만(그림 2A), 박동성 방출로 인해 일반적으로 변화가 관찰됩니다(그림 2B). CNO 주입 후(및 키스펩틴 뉴런 활성화) LH의 상승은 급격했습니다(10분 이내). 증가 수준과 피크 지속 시간은 주입 부위, 활성화된 뉴런 수 또는 표적 인구를 포함한 다양한 요인에 따라 달라집니다.
그림 3 은 그림 2A에 표시된 암컷 마우스의 아치형 핵에서 주입된 뇌 부위를 보여줍니다. Kiss1-eYFP 뉴런은 녹색으로 표시되며, mCherry 면역 반응은 CNO 후 AAV 주입 및 활성화 부위를 보여줍니다. 활성화된 뉴런은 DAB로 표지된 cFOS 면역 활성을 사용하여 검출되었습니다. 대부분의 mCherry 뉴런은 Kiss1-eYFP와 함께 국소화되었으며, 많은 뉴런이 cFOS 면역 반응을 보였으며, 이는 바이러스 및 뉴런 활성화가 표적 집단에 특이적임을 보여주었습니다.
키스펩틴-10의 IP 주입에 대한 반응에 따른 다이스트러스 야생형(C57BL/6J) 마우스의 대표적인 LH 박동성 방출 패턴이 그림 4에 나와 있습니다. 마우스는 경동맥 캐뉼레이션을 받았고 수술 4일 후 자동 혈액 샘플링 시스템에 연결되었습니다. 이튿날 아침, 발정 주기를 확인하고26일째 되는 날에 채혈 및 키스펩틴-10 주사를 실시하였다. 기준선 수준과 LH 박동성을 결정하기 위해 2시간(4분 간격, 주사 전 120분 동안 3분/샘플링) 동안 7분마다 혈액 샘플을 수집한 후 키스펩틴-10(65μg/kg)을 IP 주입하고 추가 30분 동안 7분마다 혈액 수집을 계속했습니다. 이발성 여성의 전형적인 맑은 LH 펄스가 관찰되었으며, 낮은 기초 LH 수준, ~2 pulses/h의 펄스 주파수, ~1ng/mL27의 펄스 진폭을 보여주었습니다. LH의 즉각적이고 강력한 증가는 키스펩틴 투여에 대한 반응으로 검출되었다28. 자극 후 LH 분비 패턴과 변화는 수동 채혈을 사용한 다른 연구와 일치한다 10,27,29,30. 이러한 결과는 자동 혈액 샘플링 방법이 스트레스가 없는 조건에서 전형적이고 자극된 LH 분비를 포착한다는 것을 보여줍니다.
그림 1: 주입 및 샘플링 시스템 튜빙에 대한 커넥터 시스템 및 마우스 연결부의 세부 정보. (A) 2개의 25G 니들 튜빙과 2개의 PE-20 튜빙을 사용하여 구성된 실리콘 코팅 튜빙 커넥터(MASA)로, 작은 금속 링으로 부착된 실라스틱 튜빙에 슬리브가 있습니다. (B) 샘플링 케이지의 주입 및 샘플링 튜브에 연결된 쥐가 혈액 샘플링 중에 둥지에서 휴식을 취하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 아치형 핵에 AAV-hM3Dq를 주입하고 CNO로 원격으로 활성화한 Kiss1-Cre 암컷 마우스의 LH 펄스에 대한 대표적인 결과. 기초 LH 수치는 30분 동안 10분마다 측정되었습니다. 혈액 채취 후 시간 0에서 여성은 클로자핀-N-옥사이드(0.5mg/kg)의 정맥 주사를 받았고 추가로 30분 동안 10분마다 경동맥에서 혈액을 계속 채취했습니다. (A) 기초 LH 수치가 낮은 암컷을 보여줍니다. (B) LH 펄스 사전 주입을 표시하는 암컷을 보여줍니다. 약어: Kiss1 = 키스펩틴; AAV = 아데노 관련 바이러스; CNO = 클로자핀-N-옥사이드; LH = 황체 형성 호르몬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Kiss1-Cre의 아치형 핵에서의 뇌 활성화; Chr2-eYFP(Kiss1-eYFP) 암컷은 도 2A에 나타난다. ChR2-eYFP는 kiss1 뉴런을 표지하기 위한 리포터 유전자로만 사용되었습니다. (A) 아치형 핵의 AAV 주입 부위를 보여주는 저배율 형광 이미지. 녹색: eYFP 면역 활성, 마젠타: mCherry 면역 활성. (B) 그림 3A에 해당하는 영역의 저배율 명시야 이미지로, 아치형 핵의 AAV 주입 부위에서 cFOS 면역 반응(검은색)을 보여줍니다. (C) 그림 3A,B에서 뉴런을 자세히 볼 수 있는 고배율 형광 및 명시야 이미지를 결합했습니다. 활성화된 AAV-mCherry를 공동 발현하는 Kiss1-eYFP 뉴런은 백색 세포질과 흑색 핵(화살표)을 가진 뉴런입니다. 스케일 바 = 50 μm (A,B), 20 μm (C). 약어: Kiss1 = 키스펩틴; AAV = 아데노 관련 바이러스; eYFP = enhanced yellow fluorescent protein(향상된 노란색 형광 단백질). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 2시간 동안 7분마다 측정된 다이스트러스 야생형 암컷의 기초 LH 박동. 그 후, 여성은 시간 0에 키스펩틴-10(65μg/kg)의 복강내 주사를 받았고, 혈액 샘플을 30분 동안 7분마다 연속적으로 수집하였다. 약어: LH = 황체 형성 호르몬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜을 사용하여 신경 세포 집단을 자극한 후 기초 LH 박동성과 LH 분비를 보여줄 수 있었습니다. 이 시스템의 가장 큰 장점은 혈액 샘플링 중에 사람이 존재하거나 취급하지 않고 샘플링이 이루어지는 스트레스 없는 환경입니다. 또한, 실험 중 인간의 존재 또는 취급에 대한 사전 힘든 동물 훈련 및 적응이 필요하지 않았습니다. 수동 혈액 샘플링을 사용한 이전 실험은 스트레스 요인을 최소화하기 위해 많은 시간과 노력이 필요했습니다 7,31,32. 그러나 꼬리를 자르는 것만으로도 스트레스 요인이 된다33. 중단을 예측할 수 없는 공유 동물 시설에서 스트레스가 없는 환경과 훈련 패러다임을 구현하는 것도 제약 조건이 될 수 있습니다. 일부 실험실에서는 혈액 채취를 위해 동물을 대체 시술실로 이송해야 하는 경우가 많습니다. 이러한 한계로 인해 수동 분석법은 LH 수준의 미묘한 변화를 감지하는 데 부적절할 수 있으므로 이러한 상황에서는 수동 접근 방식이 도움이 될 수 있습니다. 자동 샘플링은 새로운 환경에 적응하기 위해 생쥐를 며칠 전에 배치하는 조용한 방에 설정됩니다. 이 프로토콜에 대한 우리의 이전 경험은 마우스에서 코르티코스테론 및 박동성 성장 호르몬 분비 패턴을 정밀하게 검출할 수 있게 해주었으며, 자동 샘플링 동안 코르티코스테론 수치가 상승하지 않았음을 보여주었다15. 현재 실험에서 모든 동물은 샘플링 시스템에 잘 적응하여 ~ 24 시간 후에 샘플링 챔버에서 둥지를 짓고 밝은 털 색깔을 보였으며, 이는 스트레스가 부족하고 전반적인 건강 상태가 양호함을 나타냅니다 (그림 1).
부정적인 결과를 초래하는 주요 어려움은 아마도 필요한 신경 집단에 대한 AAV의 부적절한 표적화일 것입니다. 입체 주입의 정밀도는 필수적이며 좌표와 주입량을 확인하기 위해 사전에 교육을 받아야 합니다. 훈련은 비회복 수술에서 원하는 위치에 소량의 0.5-1% Evans Blue를 주입한 다음 마우스 뇌 매트릭스(예: Ted Pella)를 사용하여 갓 절개한 뇌의 일부를 채취하여 입체경으로 주사 부위와 크기를 확인하는 방식으로 수행할 수 있습니다.
또한 자동 혈액 샘플링 시스템에서 수집된 혈액 및 혈장은 헤파린화 식염수(예: 결과에서 식염수 50μL에 혈액 20μL)로 희석되며(예: 결과에서 50μL의 식염수에 혈액 20μL)20 선택한 분석 방법의 감도에 따라 희석 비율을 조정해야 할 수도 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. BSA-PBS(초민감 LH ELISA에 권장됨)10 또는 식염수로 희석한 전혈에서 LH 수치를 테스트한 결과 LH 값에 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 트윈은 희석제에 사용될 수 없는데, 이는 이것이 샘플 유체(20)를 대체하여 샘플을 추출하기 위해 혈액 시스템으로 순환할 것이기 때문이다. 경험상 1:10 미만의 희석은 LH 결과는 양호했지만 1:3.5에 비해 LH 수치를 약간 과소평가했습니다. 이는 필요한 경우 채취되는 혈액의 양을 줄이기 위해 희석액을 추가로 조정할 수 있음을 나타냅니다.
자동 화합물 전달의 대안은 정맥 카테터를 통해 수동 주입을 수행하는 것입니다. 이 경우 조사관은 주사를 전달하기 위해 방에 잠시 있습니다. 그러나 동물이나 동물의 주거 및 주변 환경과의 직접적인 접촉은 없으며 복강 내 또는 피하 주사와 달리 전체 절차는 동물이 알아차리지 못하는 경우가 많습니다. 수동 주입의 장점은 화합물 희석을 미리 설정할 필요가 없다는 것인데, 이는 너무 비싸서 대량으로 사용할 수 없거나 시간이 지남에 따라 분해에 민감한 화합물에 중요할 수 있습니다. 주입 라인과 카테터를 더 많은 복합 용액으로 미리 채워야 하는 자동 전달보다 작동 부피가 작기 때문입니다.
자동 혈액 채취는 예를 들어 수면 중 LH 변화를 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 우리는 표본 채취 시간 동안 둥지에서 잠을 자는 동물들을 정기적으로 관찰했습니다. 이 샘플링을 EEG 기록과 연결하여 신경 활동과 LH 패턴34 사이의 관계에 대한 보다 상세한 분석을 생성할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이 자동 혈액 샘플링을 사용할 수 있는 가능성은 기초 LH 샘플링에서 내인성 또는 외인성 화합물에 대한 LH 반응 테스트 또는 신경 세포 집단의 활성화 또는 억제에 이르기까지 다양합니다. 신경 조작은 화학 유전학 또는 광유전학으로 급성으로 구현하거나 형질 전환 마우스 모델 및 세포 사멸 또는 신경 세포 침묵 도구를 사용하여 영구적으로 구현할 수 있습니다. 자동 혈액 샘플링을 통해 박동성이 높은 분비 패턴을 가진 다른 호르몬(예: 성장 호르몬15)도 측정할 수 있습니다. 암컷 마우스에서, 발정 주기의 특정 단계가 요구된다면, 질 도말은 주입 및 샘플링 라인을 방해하지 않고 프로토콜(26 )을 시작하기 몇 시간 전에 조심스럽게 수집될 수 있다. 동물은 7-10일 동안 샘플링 시스템에 연결할 수 있으며 시간이 지남에 따라 동맥 라인이 응고될 위험이 증가합니다.
그러나 이 기술은 단일 사육 동물에서만 사용할 수 있으므로 사회적 상호 작용을 연구하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 또한 침습적이고 기술적으로 어려운 수술이 필요하기 때문에 어린 동물이나 특정 질병 모델에는 구현이 불가능할 수 있습니다. 마지막으로, 시스템 구매 비용이 단일 연구 실험실에 비해 너무 높을 수 있으므로 언급된 실험 프로토콜을 서비스로 제공하는 핵심 실험실에 설치하는 것이 좋습니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 자동 혈액 샘플링과 결합된 AAV의 입체 전달을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 기술로 달성된 정확한 공간적 및 시간적 제어는 다양한 모델, 측정 프로토콜 및 호르몬에 적용할 수 있는 유연성과 함께 설치류의 호르몬 조절 연구를 위한 강력한 방법입니다. 가장 중요한 것은 이 방법이 주입 및/또는 샘플링 및 사전 동물 훈련 중 사람의 존재와 취급을 제거하여 스트레스 없는 환경을 제공한다는 것입니다. 이러한 장점은 다중화의 가능성과 함께 이 방법을 의식이 있고 자유롭게 움직이며 방해받지 않는 쥐의 호르몬 변화에 대한 신경 제어를 연구하기 위한 고유한 도구로 만듭니다.
Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
다양한 혈액 희석 방법을 테스트하는 데 도움을 주신 Daniel Haisenleder 박사님께 감사드립니다. 혈청 호르몬 분석은 유니스 케네디 슈라이버 NICHD 보조금 R24 HD102061의 지원을 받는 버지니아 대학교 생식 리간드 분석 및 분석 연구 센터에서 수행되었습니다. Michigan Mouse Metabolic Phenotyping Center-Live는 NIH Center Grant U2C DK135066의 지원을 받습니다. JF 및 NQ는 DK020572(MDRC) 및 DK089503(MNORC) 보조금으로 지원됩니다. CFE 및 CSM은 NICHD 보조금 R21 HD109485 및 R01 HD096324에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Not necessarily this virus but this was the one used for representative results |
| Alcohol | Disinfection | ||
| Anesthesia Induction box | Vetequip | ||
| Anesthesia induction machine | Kent Scientific Equipment | SomnoSuite | |
| Anesthesia masks for mice | Kent Scientific Equipment | SOMNO-0801 | |
| Autoclip applier 9 mm | Clay Adams | 427630 | |
| Autoclip remover 9 mm | Clay Adams | 427637 | |
| Autoclips 9 mm | Clay Adams | 427631 | |
| BASi Culex Controller | Culex | SN: 2151, 2152, 2156, 2158 | 4 stations |
| BASi Honey Comb Fraction Collector | Honey Comb | SN: 2105, 2106, 2107, 2108 | 4 stations |
| BASi Ratrun Rotation Control | RATURN 2 | SN: 5680, 5681, 5682, 5683 | 4 stations |
| C57BL/6J mice | JAX # 000664 | ||
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl | Analgesic |
| Clippers | Braun | ||
| Clozapine-N-oxide | ENZO | BLM-NS105-0005 | |
| Cotton tipped applicators | |||
| CULEX Automated In Vivo Sampling System | BASi | DS000627 | with CX-4000S Replacement Tubing Sets |
| Curved forceps serrated | FST | 11151-10 | |
| Drill | Dremel | 61100 | |
| Empis control Module | EMPIS CM | SN: 174 | |
| Empis Programmable Infusion System | EMPIS | SN: 2125 , 2126, 2127, 2128 | With CX-7010S 4 BAS-2 Infusion Sets; 4 stations |
| Envigo 2016 diet | low-phytoestrogen diet | ||
| Eye ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment | Petrolatum Ophtalmic oinment |
| Glass pipettes | World Precision Instruments | MIB100-6 | |
| Hemostats | Roboz Surgical | RS-7101 | |
| Iodine | Betadine Surgical scrub | ||
| Isoflurane | VetOne | Fluriso | Anesthetic |
| Isoflurane Vaporizer or SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Surgivet or Kent Scientific Corp | SS-01 | Anesthesia Machine |
| Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) mice | JAX # 023436 and #024109 | ||
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals | 048-56 | |
| Micro-renathane tubing | Braintree Scientific | MRE025 | Surgical catheterization |
| Micro-Scissors | Roboz Surgical | RS-5606 | |
| Needle Holder | Roboz Surgical | RS-7842 | |
| Picoliter injector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P30 | |
| Rodent Warmer X2 | Stoelting | 53850 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 | |
| Scissors | Roboz Surgical | RS-6808 | |
| Silicon tubing | Liveo Laboratory Tubing | NO.508-001 | 0.012 in I.D x 0.025 in O.D. |
| Stereotaxic table | RWD | E06208 | |
| Sterile 0.9% saline | Baxter | 2F7124 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical blades | SKLAR | 06-3011 | |
| Surgical stereoscope | Zeiss | f-160 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4972 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-5058 | |
| Antibodies | |||
| Anti-cFos | Millipore | ABE457 | Antigen target: N-terminus cFos; Host organism: Rabbit; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2631318 |
| Anti-GFP | Aves Labs | GFP-1010 | Antigen target: recombinant GFP null; Host organism: Chicken; Dilution used: 1:10,000; RRID: AB_2307313 |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs | 711-065-152 | Antigen target: Rabbit IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:1,000; RRID: AB_2340593 |
| Donkey anti-Rat IgG, AlexaFluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21209 | Antigen target: Rat IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2535795 |
| Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | Antigen target: Chicken, IgY (H+L); Host organism: Goat; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2534096 |
| mCherry monoclonal (16D7) | Thermo Fisher Scientific | M11217 | Antigen target: mCherry tag; Host organism: Rat; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2536611 |
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