Summary
Luteiniserende hormon (LH) pulsatilitet er et kjennetegn på reproduktiv funksjon. Vi beskriver en protokoll for fjernaktivering av spesifikke nevronpopulasjoner knyttet til seriell automatisert blodinnsamling. Denne teknikken tillater tidsbestemt hormonell modulering, multipleksing og minimering av manipulasjonseffekter på LH-nivåer i bevisste, fritt bevegelige og uforstyrrede dyr.
Abstract
Sirkulerende luteiniserende hormon (LH) nivåer er en viktig indeks for funksjonen av hypothalamus-hypofysen kontroll av reproduksjon. Rollen til mange innganger og nevronpopulasjoner i moduleringen av LH-frigjøring er fortsatt ukjent. Måling av endringer i LH-nivåer hos mus er ofte en utfordring siden de lett blir forstyrret av miljøstress. Nåværende teknikker for å måle LH-frigjøring og pulsatilitet krever langsiktig trening for mus for å tilpasse seg manipulasjonsstress, viss tilbakeholdenhet, etterforskerens tilstedeværelse og arbeid med individuelle dyr, noe som reduserer nytten for mange forskningsspørsmål.
Denne artikkelen presenterer en teknikk for å eksternt aktivere spesifikke nevronpopulasjoner ved hjelp av Designer Receptor Exclusive Activated by Designer Drugs (DREADDs) teknologi kombinert med automatisert sekvensiell blodprøvetaking i bevisste, fritt bevegelige og uforstyrrede mus. Vi beskriver først den stereotaktiske kirurgiprotokollen for å levere adeno-associated virus (AAV) vektorer som uttrykker DREADDs til spesifikke nevronpopulasjoner. Deretter beskriver vi protokollen for kanylering av halspulsåren og vena jugularis og postkirurgisk tilkobling til det automatiserte blodprøvesystemet CULEX. Til slutt beskriver vi protokollen for klozapin-N-oksid intravenøs injeksjon for ekstern nevronaktivering og automatisert blodinnsamling. Denne teknikken tillater programmert automatisert prøvetaking hvert 5. minutt eller lenger i en gitt periode, kombinert med intravenøs substansinjeksjon på et ønsket tidspunkt eller varighet. Samlet sett fant vi denne teknikken å være en kraftig tilnærming til forskning på nevroendokrin kontroll.
Introduction
Hypotalamo-hypofyse-gonadal (HPG) aksen er sentralt regulert av pulsatil frigjøring av gonadotropinfrigjørende hormon (GnRH) i hypofyseportalsystemet. I hypofysen styrer GnRH den pulsatile frigjøringen av gonadotropiner, luteiniserende hormon (LH) og follikkelstimulerende hormon (FSH) til sirkulasjonssystemet. LH-pulsatil frigjøring fungerer som et kjennetegn for sentral HPG-akse som fungerer 1,2,3,4. For eksempel viser den effekten av genetiske endringer eller endringer i hormonelle eller miljømessige faktorer på den nevrale delen av aksen 5,6,7. Inntil nylig var måling av LH-pulsatilmønsteret begrenset til store pattedyr8 og rotter9, gitt den høye frekvensen av prøvetaking og store blodvolumer som er nødvendige for å identifisere pulser.
Påvisning av LH-pulser hos mus er ønskelig siden denne arten har brede genetiske modeller tilgjengelig og lett kan manipuleres ved hjelp av genomisk ingeniørteknologi for å studere spesifikke gener og cellepopulasjoner. I det siste tiåret har et stort fremskritt i analysen av LH-konsentrasjoner hos mus ved hjelp av en sandwich LH-enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) gjort det mulig å oppdage LH i en liten mengde blod10. Utviklingen av den hyppige blodprøvetakingsteknikken med halespiss har muliggjort den nødvendige hyppige prøvetaking for å oppdage frekvensen og amplituden av LH-pulser hos mus10,11. Imidlertid er blodprøvetaking med halespiss begrenset til bruk hos bevisste våkne dyr; Det krever en lang treningsperiode for mus å tilpasse seg håndteringen og tilstedeværelsen av en utpekt etterforsker under prøvetaking. Dens suksess er svært utsatt for miljømessige stressorer og kan ikke være egnet for bruk i musestammer som viser høye angstnivåer. Intraatriell kanylering har også blitt brukt til hyppig blodprøvetaking i fritt bevegelige bevisste mus12. Imidlertid krever dette oppsettet fortsatt gjentatt manuell blodprøvetaking og begrenser dyrets bevegelige rom, mens atriekanylering kan føre til dynamiske endringer i hjertefunksjonen. Det er derfor ønskelig å etablere en metode for blodinnsamling under stressfrie forhold i bevisste, fritt bevegelige og uforstyrrede mus uten behov for forutgående trening eller menneskelig håndtering eller tilstedeværelse.
Automatisert blod- eller dialysatprøvetaking har tidligere blitt brukt til å måle forskjellige hormonnivåer (f.eks. melatonin13,14) og deres pulsatile sekresjon (f.eks. veksthormon)15 hos uhemmede gnagere. Vi presenterer her en protokoll for automatisert langvarig hyppig blodprøvetaking hos bevisste og uhemmede dyr, kombinert med en rettidig fjernaktivering av spesifikke nevronpopulasjoner ved hjelp av kjemogenetiske teknologier: designerreseptorene utelukkende aktivert av designermedisiner (DREADDs). Vi vil beskrive stereotaktisk levering av en adenoassosiert virus (AAV) vektor og fjernaktivering ved en automatisert intravenøs (IV) tilførsel av klozapin-N-oksid (CNO)16,17. Denne protokollen tillater sekvensiell påvisning av basale nivåer og induserte endringer i LH-pulsatilitet hos flere dyr samtidig. Både blodprøvetaking og IV-levering av forbindelsen utføres på en tidskontrollert måte via et dataprogram som eliminerer den fysiske tilstedeværelsen av etterforskeren eller kravet om tidligere musetrening. Denne metoden overvinter de viktigste begrensningene ved manuell blodprøvetaking. Det tillater blodprøvetaking i stressfri tilstand, og samtidig IV-sammensatt levering kombinert med ekstern nevronaktivitetskontroll. Vi viser representative resultater av bruk av automatisert blodprøvetaking alene eller kombinert med ekstern nevronaktivering og diskuterer fordeler, begrensninger og tilleggsbruk.
Protocol
Alle dyreprosedyrer utføres i samsvar med National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals18 , samt føderale, statlige og lokale lover. Voksne hunnmus (3-6 måneder gamle) ble brukt til denne protokolldemonstrasjonen, inkludert fire C57BL/6J-hunner og fire Kiss1-Cre; ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) kvinner. Mus ble holdt under en 12:12 lys:mørk syklus, temperaturkontrollert ved 22 °C, og matet ad libitum på en lavfytoøstrogendiett. Prosedyrer og protokoller ble godkjent av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Animal Protocols: PRO00010420 and PRO00010138).
1. Stereotaksisk levering av AAV-er til en bestemt cellepopulasjon
- Forberedelse til kirurgi
- Steriliser alle verktøy. Forbered flere pakker med kirurgiske verktøy for å sikre at hver pakke brukes i ikke mer enn fem dyr. Forbered sterile hansker, minst ett par for hvert dyr.
- Trekk glassmikropipetter til injeksjonsvæsker ved hjelp av følgende innstillinger (se materialfortegnelsen) for lange, tynne mikropipetter som injiseres sakte og jevnt og ikke lett tetter seg: Varme 1: 915, Varme 2: 630, Trekk: 630. Optimaliser disse innstillingene for hver avtrekker.
- Utfør operasjoner i et utpekt kirurgisk rom. Desinfiser kirurgiske overflater med 70% etanol.
- Bruk sterile gardiner for å opprettholde steriliteten til det kirurgiske feltet. Bruk en ren laboratoriefrakk eller engangskjole og en maske.
- Forbered innånding anestesi system. Åpne oksygentilførselen og reguler strømningshastigheten til 0,8 l/min.
- Kirurgi
- Plasser musen i en anestesiboks og åpne isofluran til 2,5%. Reduser strømmen av isofluran til 2 % etter første induksjon; opprettholde flyt gjennom hele prosedyren. For alternative anestesimetoder, se dyreprotokoll og lokale etiske komitéretningslinjer.
- Injiser forebyggende analgetika (karprofen 5 mg/kg s.c.) i henhold til anbefaling fra dyrebrukskomiteen og lokale forskrifter.
- Barber musehodet med klippere.
- Installer dyret på et stereotaksisk bord, plasser ørestenger, og sørg for at hodet er riktig fast og stabilt. Fest musens munn til munnstykket, og sørg for å plassere tungen til siden utenfor munnen for å unngå kvelning.
- Kontroller at dyret er dypt bedøvet med en tåklemme før du starter operasjonen og overvåke musens pust og farge gjennom hele prosedyren.
- Plasser høydestøtte under musen for å holde kroppen og hodet i vater i horisontal stilling. Hold dyret varmt med en varm pute dekket av papir. Påfør øyesalve på begge øynene for å unngå tørking.
- Hold operasjonsområdet så rent som mulig. Bruk sterile hansker. Desinfiser musens hode med jod og alkohol før huden åpnes. Med en skalpell, kutt huden på hodet langs midtlinjen, omtrent fra bak øynene til bak lambdasuturen. Hold skallen eksponert og rengjør den med en bomullspinne innebygd i steril 0,9% NaCl.
- Finn den rostrale rhinalvenen (RRV) og merk den med en steril blyant. Bruk stereoskopet for resten av prosedyren.
MERK: Vi får bedre resultater ved å bruke RRV som anteroposterior referanse, men det er standard å bruke bregma som referanse. - Bruk en steril nål som referanse, sørg for at hjerneorienteringen er riktig før du går videre til stereotaktiske målinger. Sørg også for at høyden på skalleoverflaten ved RRV og lambda, samt sidehellingen, er de samme (± 0,02 mm).
MERK: Den laterale tilbøyeligheten blir mer relevant for injeksjon i mer laterale hjernestrukturer. - Legg i en steril glasspipette med den virale oppløsningen som skal injiseres. Ta den med til RRV-referansen for referanse 0 anteroposterior (AP). Gå videre langs sagittal suturen til AP-koordinaten du velger. Merk denne posisjonen med en steril blyant, løft nålen og fortsett til kraniotomi.
- Bor forsiktig en liten sirkel rundt den markerte posisjonen for å unngå å bryte den øvre sagittale sinus. Plasser boret på skrå i stedet for vinkelrett for å redusere trykket mens du borer. Fjern stykket av skallen med små tang.
- Når vaskulaturen er eksponert, bruk midten av superior sagittal sinus til bruk som mediolateral (ML) referanse (punkt 0); Dette er mer presist enn å bruke sagittal sutur. Gå til den valgte ML-plasseringen. Senk pipetten for å berøre dura-materen som dorsoventral (DV) referanse (punkt 0). Bryt dura-materen litt og sett pipetten ned til DV-posisjonen du ønsker.
- Injiser ønsket mengde AAV (50-200 nL) og la kanylen være på plass i 3 minutter for tilstrekkelig væskedispersjon. Fjern pipetten forsiktig ut fra hjernen.
- Slipp musen fra ørestengene. Lukk huden ved hjelp av kirurgiske klipp eller en hvilken som helst metode du velger. Sett dyret i et eget oppvarmet bur for utvinning. Overvåk gjenoppretting, reaktivitet og aktivitet etter at musen er våken. Når den er helt gjenopprettet, flytt musen tilbake til det opprinnelige buret.
- Vent i minst 3-4 uker for viralt uttrykk før du fortsetter med den andre delen av prosedyren.
2. Jugularvenen og karoten arterie kanulering
- Forberedelse til kirurgi
- Utfør operasjoner i et utpekt kirurgisk rom. Desinfiser kirurgiske overflater med 70% etanol før prosedyrene igangsettes. Forbered flere pakker med kirurgiske verktøy for å sikre at hver pakke brukes i ikke mer enn fem dyr.
- Autoklav alle kirurgiske instrumenter. Rengjør deretter med sterilt vann eller saltvann og desinfiser verktøyene med en varm perlesterilisator i minst 15 s (i henhold til produsentens instruksjoner) mellom operasjonene.
- Bruk sterile gardiner for å opprettholde steriliteten til det kirurgiske feltet. Bruk en ren laboratoriefrakk eller engangskjole og en maske.
- Forbered mikrokatetre for kanyleringer i halspulsåren og halsvenen. Konstruer arteriekateteret ved å bli med i et lite segment av mikrorenatanrør (strukket fra 0,025 tommer ytre diameter [OD] x 0,012 tommer indre diameter [ID]) med silastisk rør (0,025 tommer OD x 0,012 tommer ID). Konstruer venekateteret bare ved hjelp av silastiske rør (0,025 tommer OD x 0,012 tommer ID). Bløtlegg alle katetre i 70% etanol over natten før operasjonen.
- Skrått kuttspissene på begge katetrene ved 45 ° til forhåndsestimerte lengder basert på dyrets kroppsvekt og lengde.
- Kirurgiske prosedyrer
- Bedøv dyrene under 2% isofluran med et lavstrømningsisofluransystem for å nøyaktig kontrollere anestesistadiet og planet under operasjonen.
- Injiser den forebyggende dosen av smertestillende (karprofen 5 mg / kg s.c.) og bruk oftalmisk salve for å forhindre uttørking og hornhinneskader.
- Barbere ventrale og bakre områder av nakken og rengjør huden med tre jodskrubb vekslet med 70% etanol. Klipp et vertikalt hudsnitt (12 mm) mellom skulderbladene og dekk det med kirurgisk gasbind for senere bruk. Plasser dyret i liggende stilling med hodet mot kirurgen.
- Bruk en stereo dissekere omfang for de fleste deler av prosedyrene beskrevet nedenfor.
- Lag et lite vertikalt snitt (~ 10 mm) på høyre side av nakken, bedre enn kragebenet for å eksponere høyre halspulsåre og halsvenen. Klipp huden med saks og utfør en stump disseksjon for å skille subkutant vev ved hjelp av ikke-tannede mikrotang med fine tips, og utsett høyre ytre halsvene og høyre arteria carotis communis.
- Bind den distale enden av halsvenen for å stoppe blodstrømmen og kutt et lite hull i den kollapsede venen ved hjelp av mikrotang og saks. Sett venekateterskråningen ned og proksimalt ved hjelp av et par mikrotang for å føre den gjennom vena cava superior for å nå nivået på høyre atrium. Den innsatte lengden er ~ 10-12 mm for en 30 g mager mus. Bind kateteret for å feste med fartøyet ved hjelp av 7-0 silkeuturer.
MERK: Med kateteret på rett sted, kan blodet lett trekkes ut; Ellers kan kateteret bli feilplassert i den laterale thoraxvenen og må settes inn igjen. - Forsiktig dissekere bindevev for å avsløre den rette felles halspulsåren som ligger i et trekantområde omgitt av sternohyoidmuskelen, sternomastoidmuskelen og digastrisk muskel. Bruk en wire retractor for å skille disse musklene om nødvendig. Tie arterien på nivået av bifurkasjonen av indre og eksterne karoten arterier ved bruk av 7-0 silke suturer. Plasser to ubundne suturløkker proksimalt.
- Stopp blodstrømmen midlertidig ved å trekke en erstattet suturløkke og klipp eller slå et lite hull på karveggen ved hjelp av mikrosaks eller en 27 G nål. Sett det arterielle kateteret skrått ned og proksimalt til en forhåndsbestemt lengde som når aortabuen, men uten å berøre aortaklaffen. Den innsatte lengden er ~ 9-10 mm for en 30 g mager mus. Bind kateteret for å feste med karet ved hjelp av de to erstattede suturene.
- Tunneler alle katetre subkutant og utvendig på baksiden av nakken via det forhåndskuttede snittet og koble dem til venøse eller arterielle porter i en silikonbelagt slangekontakt laget av 25 G nålslange: modifisert MASA19 ved hjelp av to 25 G nålslanger og to 4,0 cm PE-20-slanger, hylst med 2,0 cm 0,062 tommers ID silastisk rør festet med en liten metalltrådlaget ring. Det totale lumenvolumet for hvert kateter inkludert koblingen er 6-8 μL (figur 1A).
- Lukk det ventrale snittet og fest kontakten subkutant ved lukking av bakhuden med suturer. Fyll begge katetrene med heparinisert saltvann (200 U / ml) og plugg dem tett i enden med kirurgiske ledninger i rustfritt stål.
- Mus gjenopprette fra isofluran anestesi i løpet av minutter og fullstendig gjenopprette fra kirurgi innen 5 dager. Plasser dyrene i det automatiserte blodoppsamlingskammeret 24 timer etter operasjonen og koble dem til systemet ved å koble båndkroken til systemet til metallringen festet til slangekontakten implantert på baksiden av nakken. Koble arterielle og venøse katetre til injeksjons- og prøvetakingslinjene, henholdsvis 24 timer før prøvetakingen begynner (figur 1B) . Den totale lengden på prøvetakingslinjen er 55 cm i lengde eller 40 μL av lumenvolum.
MERK: Oppsettene av injeksjons- og prøvetakingslinjer, programmeringen av innsamlingsmetoden og burbalansemekanismene til det automatiserte blodprøvesystemet er beskrevet i detalj20,21. Systemet holder kateteret åpent ved automatisk å levere 10 μL heparinert saltvann hvert 20. minutt. - Still inn prøvetakings-, injeksjons- og frekvensen før injeksjon før injeksjon via systemets dataprogram. Se trinn 3.1 nedenfor for gjeldende innstillinger.
- Systemet lar dyret bevege seg fritt uten å floke prøvetakings- og/eller infusjonsslangene ved å registrere musebevegelsen mens kammeret roteres i motsatt retning av musebevegelsen21 (figur 1).
- Fyll infusjons- eller injeksjonsslangen med forbindelsen og koble til venekateteret igjen minst 2 timer før infusjonen eller injeksjonen starter.
MERK: Kirurgiske komplikasjoner kan oppstå, og dyr må overvåkes nøye for utvinning og i dagene etter operasjonen. Se dyreprotokollen for korrekt overvåking, oppsigelseskrav og prosedyrer.
3. Automatisert blodoppsamling og intravenøs injeksjon
- Automatisert blodoppsamling
- For å følge denne protokollen, bruk et samplingsvolum på 20,0 μL og angi et intervall (dvs. 7,0 min) mellom hver sampling for å ha en samplingsfrekvens på hver 10,0 min per prøve. Maksimal hastighet er å prøve kontinuerlig på 3,0 min / prøve; Minste mulige prøvetakingsvolum er 5,0 μL. En lik mengde saltvann blir automatisk gitt tilbake av systemet for å erstatte det samplede blodet og opprettholde kroppsvæskebalansen.
- Sett total prøvetakingstid til 30 (t = -30 - 0) min før og 30 (t = 0 - 30) min etter intravenøs injeksjon av CNO (0,5 mg/kg, figur 2).
- Hver innsamlede blodprøve (20,0 μL) fortynnes automatisk i 50 μL saltvann (inneholdende heparin ved 10 E/ml) og lagres individuelt i et mikrorør som holdes i en kjøleprøvekarusell av systemet.
- Automatisert intravenøs injeksjon
- Koble venelinjen fra venekateteret for å etterfylle CNO (individuelt beregnet volumdose på ~50-60 μL ved 0,5 mg/kg) minst 2 timer før blodprøvetakingen starter.
- Trekk oppløsningen manuelt (litt mer enn beregnet volum) ut av slangen retrograd med injeksjonssprøyten, og la det være en liten luftboble mellom oppløsningen og den eksisterende saltoppløsningen i slangen.
- Koble injeksjonsslangen til venekateteret igjen og sett injeksjonshastigheten til 500 μl/min og injeksjonens starttid til 2 minutter etter at t = 0 prøvetaking er ferdig. Den totale injeksjonstiden for hvert dyr er 5-6 s.
MERK: Om nødvendig kan forbindelsen også leveres ved manuell intraperitoneal injeksjon (IP), men dette vil kreve å forstyrre dyret under eller før blodinnsamlingsprotokollen. Dette alternativet viser vi også i resultatene.
4. Animal perfusjon og hjernen samling (valgfritt)
MERK: Denne prosedyren skal bare følges hvis hjernen er nødvendig for å analysere hjernens nettsted for nevronaktivering eller nedstrøms responser.
- Koble musen fra blodinnsamlingssystemet på slutten av oppsamlingsprotokollen. To timer etter intravenøs injeksjon gjennomsyres dyret med 10 % nøytral bufret formalin (NBF), ved bruk av foretrukket metode eller som beskrevet andre steder22.
- Dissekere hjernen og bevare den i 20% sukrose i 10%-NBF i 3 timer for å fortsette fiksering.
- Etter 3 timer, overfør den faste hjernen til 20% sukrose i PBS og konserver ved 4 °C til den er klar for seksjonering.
MERK: Unngå overfiksering da dette vil maskere cFOS antigenene. I 20% sukroseoppløsningen skal hjernen synke til bunnen av beholderen. - Lag seksjoner ved hjelp av en frysende mikrotome eller kryostat og bruk den foretrukne metoden for å se på nevronaktivering (f.eks. cFOS immunhistokjemi er vist).
MERK: Antistoffene som brukes for de nåværende resultatene, er beskrevet i materialfortegnelsen.
5. Prøvebehandling og analyse
- Fjern blodprøver fra den automatiske prøvetakeren umiddelbart etter at forsøket er avsluttet og legg dem på is.
- Spinn prøvene på 14 000 × g i 30 s.
- Samle plasmaet. Oppbevares ved -80 °C inntil analyse.
- Analyser blodprøvene av LH ELISA som beskrevet før10,23.
Representative Results
Kisspeptin-uttrykkende nevroner (Kiss1-genet) lokalisert i hypothalamusens bueformede kjerne er en potent stimulator for GnRH, og dermed av LH-frigjøring fra hypofysen24,25. I denne protokolldemonstrasjonen har vi brukt kisspeptin-indusert LH-sekresjon for å illustrere funksjonen til den automatiserte blodprøvetakingsteknikken. Figur 2 viser representative LH-mønstre hos voksne Kiss1-eYFP-hunner som tidligere har fått en ensidig stereotaktisk injeksjon av AAV-hM3Dq-mCherry i den bueformede kjernen (AP: -4,95, ML: -0,35, DV: -5,7). ChR2-eYFP ble brukt som fluorescerende reporter for Kiss1-celler. En måned etter den stereotaktiske operasjonen gjennomgikk musene halspulsåren og jugularvenylering og ble koblet til den automatiske blodprøvetakeren 4 dager etter operasjonen. Blodinnsamling for bestemmelse av basale LH-nivåer ble startet neste dag med 10 min prøvetakingsfrekvens (7 minutters intervall mellom prøver og 3 min/prøvetaking) etterfulgt av en automatisert IV CNO-injeksjon og fortsatt blodprøvetaking hvert 10. minutt i 30 minutter. Diestrøse LH-nivåer er generelt lave (figur 2A), men variasjoner observeres vanligvis på grunn av dens pulsatile frigjøring (figur 2B). Etter CNO-injeksjonen (og aktivering av kysseptinnevroner) var økningen i LH kraftig (innen 10 minutter). Nivået av økning og varigheten av toppen avhenger av mange faktorer, inkludert injeksjonsstedet, antall nevroner aktivert eller populasjonen som er målrettet.
Figur 3 viser hjerneinjeksjonsstedet i den bueformede kjernen til hunnmusen representert i figur 2A. Kiss1-eYFP-nevroner er merket med grønt, mens mCherry-immunreaktiviteten viser stedet for AAV-injeksjonen og aktiveringen etter CNO. Aktiverte nevroner ble påvist ved hjelp av cFOS immunoreaktivitet, merket med DAB. De fleste mCherry-nevroner samlokalisert med Kiss1-eYFP, og mange viste cFOS immunoreaktivitet, noe som viser at viral og nevronaktivering var spesifikk for den målrettede befolkningen.
Et representativt LH-pulsatilt frigjøringsmønster hos diestrous wildtype (C57BL/6J) mus etterfulgt av respons på en IP-injeksjon av kisspeptin-10 er vist i figur 4. Musen gjennomgikk halspulsårekanylering og ble koblet til det automatiske blodprøvetakingssystemet 4 dager etter operasjonen. Neste morgen ble brunstsyklusene kontrollert, og blodinnsamling og kisspeptin-10-injeksjon ble utført på diestrous dag26. Blodprøver ble tatt hvert 7. minutt i 2 timer (4 minutters intervall, pluss 3 min/prøvetaking i 120 minutter før injeksjonen) for å bestemme utgangsnivået og LH-pulsatiliteten, etterfulgt av en IP-injeksjon av kisspeptin-10 (65 μg/kg) og fortsatt blodinnsamling hvert 7. minutt i ytterligere 30 minutter. Klare LH-pulser typisk for en kvinne i diestrous ble observert, og viste lave basale LH-nivåer, pulsfrekvens på ~2 pulser/t og pulsamplitude ~1 ng/ml27. En umiddelbar og robust økning i LH ble oppdaget som respons på administrering av kisspeptin28. LH-sekresjonsmønstre og endringer etter stimulering er i samsvar med andre studier ved bruk av manuell blodinnsamling 10,27,29,30. Disse resultatene viser at den automatiserte blodprøvetakingsmetoden fanger opp typisk og stimulert LH-sekresjon under stressfri tilstand.
Figur 1: Detaljer om koblingssystemet og musetilkoblinger til infusjons- og prøvetakingssystemslangen. (A) En silikonbelagt slangekontakt (MASA) konstruert ved hjelp av to 25G nålslanger og to PE-20-slanger, hylst i en silastisk slange festet med en liten metallring. (B) En mus som er koblet til infusjons- og prøvetakingsslangen i prøvetakingsburet, hviler i reiret under blodprøvetakingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative resultater for LH-pulser hos Kiss1-Cre hunnmus injisert med AAV-hM3Dq i bueformet kjerne og eksternt aktivert med CNO. Basale LH-nivåer ble målt hvert 10. minutt i en halv time. På tidspunkt 0 etter blodinnsamlingen fikk hunnen en intravenøs injeksjon med klozapin-N-oksid (0,5 mg/kg), og blod fortsatte å bli samlet fra halspulsåren hvert 10. minutt i ytterligere en halv time. (A) Viser en hunn med lave basale LH-nivåer. (B) Viser en hunn som viser en LH-puls før injeksjon. Forkortelser: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = adenoassosiert virus; CNO = klozapin-N-oksid; LH = luteiniserende hormon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Hjerneaktivering i den bueformede kjernen i Kiss1-Cre; Chr2-eYFP (Kiss1-eYFP) kvinne representert i figur 2A. ChR2-eYFP ble bare brukt som et reportergen for å merke kiss1-nevroner . (A) Fluorescensbilde med lav forstørrelse som viser stedet for AAV-injeksjonen i den bueformede kjernen. Grønn: eYFP immunoreaktivitet, Magenta: mCherry immunoreaktivitet. (B) Brightfield-bilde med lav forstørrelse av området som tilsvarer figur 3A, som viser cFOS immunoreaktivitet (svart) på stedet for AAV-injeksjonen i Arcuate-kjernen. (C) Fluorescens med høy forstørrelse og lysfeltbilde kombinert som viser en nærmere titt på nevronene i figur 3A, B. Kiss1-eYFP-nevroner som uttrykker AAV-mCherry som har blitt aktivert, er de med hvit cytoplasma og svart kjerne (piler). Skalastenger = 50 μm (A,B), 20 μm (C). Forkortelser: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = adenoassosiert virus; eYFP = forbedret gult fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Basal LH-pulsatilitet hos en diestrøs villtypehunn målt hvert 7. minutt i 2 timer. Hunnen fikk da intraperitoneal injeksjon med kisspeptin-10 (65 μg/kg) på tidspunktet 0, og blodprøver ble kontinuerlig tatt hvert 7. minutt i en halv time. Forkortelse: LH = luteiniserende hormon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Ved hjelp av denne protokollen kunne vi vise basal LH-pulsatilitet og LH-sekresjon etter stimulering av en nevronpopulasjon. De store fordelene med systemet er det stressfrie miljøet der prøvetaking foregår, uten menneskelig tilstedeværelse eller håndtering under blodprøvetakingen. I tillegg var det ikke nødvendig med tidligere arbeidskrevende dyreopplæring og tilpasning til menneskelig tilstedeværelse eller håndtering under forsøket. Tidligere eksperimenter med manuell blodprøvetaking krevde mye tid og krefter for å minimere stressorer 7,31,32. Å kutte halen alene er imidlertid en stressfaktor33. Implementering av et ikke-stressende miljø og treningsparadigme i felles dyrefasiliteter, der avbrudd er uforutsigbare, kan også være en begrensning. I noen laboratorier må dyr ofte transporteres til alternative prosedyrerom for blodprøvetaking. Disse begrensningene kan gjøre den manuelle metoden uegnet for påvisning av subtile endringer i LH-nivåer, og derfor kan en hands-off tilnærming være nyttig i disse situasjonene. Automatisert prøvetaking foregår i et stille rom hvor musene plasseres flere dager i forveien for å akklimatisere seg til det nye miljøet. Vår tidligere erfaring med denne protokollen ga presis påvisning av kortikosteron og pulsatil veksthormonsekresjonsmønstre hos mus, og viste ingen forhøyede kortikosteronnivåer under den automatiserte prøvetakingen15. I de aktuelle forsøkene var alle dyrene godt tilpasset prøvetakingssystemet som viste reirbygging i prøvetakingskammeret etter ~24 timer og lys hårfarge, noe som indikerer mangel på stress og generelt god helsetilstand (figur 1).
Den største vanskeligheten med å føre til negative resultater er sannsynligvis den uhensiktsmessige målrettingen av AAV mot den nødvendige nevronpopulasjonen. Presisjon i de stereotaktiske injeksjonene er viktig, og opplæring bør gjøres på forhånd for å verifisere koordinatene og injeksjonsvolumene. Trening kan gjøres ved å injisere en liten mengde 0,5-1% Evans Blue til ønsket sted i ikke-utvinning kirurgi og deretter ta en bit av den ferske dissekert hjernen ved hjelp av en mus hjerne matrise (f.eks Ted Pella) for å sjekke stedet og størrelsen på injeksjonen ved hjelp av et stereoskop.
Det er også viktig å ta hensyn til at blod og plasma samlet fra det automatiserte blodprøvetakingssystemet vil bli fortynnet i heparinert saltvann (f.eks. 20 μl blod i 50 μl saltvann i våre resultater)20, og det kan være nødvendig å justere fortynningsforholdet for sensitiviteten til den valgte analysemetoden. Vi testet LH-nivåer i fullblod fortynnet i BSA-PBS (som anbefalt for ultrasensitiv LH ELISA)10 eller saltvann, og fant ingen forskjeller i LH-verdier. Tween kan ikke brukes i fortynningsvæsken siden dette vil sirkulere inn i blodsystemet for å trekke ut prøvene ved å erstatte prøvevæskene20. Vår erfaring er at fortynninger mindre enn 1:10 ga gode LH-resultater, men litt underestimerte LH-nivåene sammenlignet med 1:3,5. Dette indikerer at fortynningen kan justeres ytterligere for å redusere mengden blod som samles opp, om nødvendig.
Et alternativ til automatisert sammensatt levering er å gjøre manuelle injeksjoner via venekateteret. I dette tilfellet er etterforskeren kort til stede i rommet for å levere injeksjonen. Imidlertid er det ingen direkte kontakt med dyrene eller deres boliger og omgivelser, og i motsetning til intraperitoneale eller subkutane injeksjoner, er hele prosedyren ofte ubemerket av dyret. Fordelene med en manuell injeksjon er at forbindelsesfortynningen ikke trenger å settes opp på forhånd, noe som kan være kritisk for forbindelser som er for dyre å bruke i større volumer eller er følsomme for nedbrytning over tid; Siden driftsvolumet er mindre enn ved automatisert levering, må infusjonsslangen og kateteret forhåndsfylles med mer sammensatt oppløsning.
Automatisk blodprøvetaking gir en unik mulighet til å studere LH-variasjoner for eksempel under søvn. Vi har jevnlig observert dyr som sover i reirene sine i prøvetakingstiden. Det er mulig å koble denne prøvetakingen med EEG-opptak for å generere en mer detaljert analyse av forholdet mellom nevral aktivitet og LH-mønster34. Som vist her er mulighetene for bruk av automatisert blodprøvetaking mange: fra basal LH-prøvetaking til testing av LH-respons på endogene eller eksogene forbindelser, eller til aktivering eller undertrykkelse av nevronpopulasjoner. De nevrale manipulasjonene kan implementeres akutt med kjemogenetikk eller optogenetikk, eller permanent ved hjelp av transgene musemodeller og apoptotiske eller neuronale silencingverktøy. Automatisert blodprøvetaking tillater også måling av andre hormoner med svært pulserende sekretoriske mønstre (f.eks. Veksthormon15). Hos hunnmus, hvis en bestemt fase av brunstsyklusen er nødvendig, kan vaginale utstryk samles forsiktig timer før du starter protokollen26 uten å forstyrre infusjons- og prøvetakingslinjene. Dyr kan kobles til prøvetakingssystemet i 7-10 dager med risiko for koagulering av arterielle linjen øker med tiden.
Denne teknikken er imidlertid begrenset til bruk i enkelthusdyr, og det kan derfor ikke være egnet for å studere sosiale interaksjoner. Det er også invasivt og krever teknisk utfordrende kirurgi, så det kan ikke være mulig å implementere med unge dyr eller visse sykdomsmodeller. Til slutt, fordi kostnaden for å kjøpe systemet kan være for høyt for et enkelt forskningslaboratorium, vil det være tilrådelig å sette det opp i et kjernelaboratorium som gir den nevnte eksperimentelle protokollen som tjenester.
Avslutningsvis viser denne protokollen hvordan man utfører stereotaksisk levering av AAV kombinert med automatisert blodprøvetaking. Den nøyaktige romlige og tidsmessige kontrollen som oppnås med denne teknikken, sammen med dens fleksibilitet i bruk på forskjellige modeller, måleprotokoller og hormoner, gjør den til en kraftig metode for studier av hormonell regulering hos gnagere. Viktigst av alt, gir metoden et stressfritt miljø ved å eliminere menneskelig tilstedeværelse og håndtering under injeksjon og / eller prøvetaking, og tidligere dyreopplæring. Disse fordelene, sammen med muligheten for multipleksing, gjør denne metoden til et unikt verktøy for å studere nevral kontroll av hormonelle forandringer i bevisste, fritt bevegelige og uforstyrrede mus.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Daniel Haisenleder for hans hjelp med å teste ulike blodfortynningsmetoder. Serumhormonanalyser ble utført ved University of Virginia Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core støttet av Eunice Kennedy Shriver NICHD Grant R24 HD102061. Michigan Mouse Metabolic Phenotyping Center-Live støttes av NIH Center Grant U2C DK135066. JF og NQ støttes av DK020572 (MDRC) og DK089503 (MNORC) tilskudd. CFE og CSM støttes av NICHD grant R21 HD109485 og R01 HD096324.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Not necessarily this virus but this was the one used for representative results |
| Alcohol | Disinfection | ||
| Anesthesia Induction box | Vetequip | ||
| Anesthesia induction machine | Kent Scientific Equipment | SomnoSuite | |
| Anesthesia masks for mice | Kent Scientific Equipment | SOMNO-0801 | |
| Autoclip applier 9 mm | Clay Adams | 427630 | |
| Autoclip remover 9 mm | Clay Adams | 427637 | |
| Autoclips 9 mm | Clay Adams | 427631 | |
| BASi Culex Controller | Culex | SN: 2151, 2152, 2156, 2158 | 4 stations |
| BASi Honey Comb Fraction Collector | Honey Comb | SN: 2105, 2106, 2107, 2108 | 4 stations |
| BASi Ratrun Rotation Control | RATURN 2 | SN: 5680, 5681, 5682, 5683 | 4 stations |
| C57BL/6J mice | JAX # 000664 | ||
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl | Analgesic |
| Clippers | Braun | ||
| Clozapine-N-oxide | ENZO | BLM-NS105-0005 | |
| Cotton tipped applicators | |||
| CULEX Automated In Vivo Sampling System | BASi | DS000627 | with CX-4000S Replacement Tubing Sets |
| Curved forceps serrated | FST | 11151-10 | |
| Drill | Dremel | 61100 | |
| Empis control Module | EMPIS CM | SN: 174 | |
| Empis Programmable Infusion System | EMPIS | SN: 2125 , 2126, 2127, 2128 | With CX-7010S 4 BAS-2 Infusion Sets; 4 stations |
| Envigo 2016 diet | low-phytoestrogen diet | ||
| Eye ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment | Petrolatum Ophtalmic oinment |
| Glass pipettes | World Precision Instruments | MIB100-6 | |
| Hemostats | Roboz Surgical | RS-7101 | |
| Iodine | Betadine Surgical scrub | ||
| Isoflurane | VetOne | Fluriso | Anesthetic |
| Isoflurane Vaporizer or SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Surgivet or Kent Scientific Corp | SS-01 | Anesthesia Machine |
| Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) mice | JAX # 023436 and #024109 | ||
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals | 048-56 | |
| Micro-renathane tubing | Braintree Scientific | MRE025 | Surgical catheterization |
| Micro-Scissors | Roboz Surgical | RS-5606 | |
| Needle Holder | Roboz Surgical | RS-7842 | |
| Picoliter injector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P30 | |
| Rodent Warmer X2 | Stoelting | 53850 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 | |
| Scissors | Roboz Surgical | RS-6808 | |
| Silicon tubing | Liveo Laboratory Tubing | NO.508-001 | 0.012 in I.D x 0.025 in O.D. |
| Stereotaxic table | RWD | E06208 | |
| Sterile 0.9% saline | Baxter | 2F7124 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical blades | SKLAR | 06-3011 | |
| Surgical stereoscope | Zeiss | f-160 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-4972 | |
| Tweezers | Roboz Surgical | RS-5058 | |
| Antibodies | |||
| Anti-cFos | Millipore | ABE457 | Antigen target: N-terminus cFos; Host organism: Rabbit; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2631318 |
| Anti-GFP | Aves Labs | GFP-1010 | Antigen target: recombinant GFP null; Host organism: Chicken; Dilution used: 1:10,000; RRID: AB_2307313 |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Labs | 711-065-152 | Antigen target: Rabbit IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:1,000; RRID: AB_2340593 |
| Donkey anti-Rat IgG, AlexaFluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21209 | Antigen target: Rat IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2535795 |
| Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | Antigen target: Chicken, IgY (H+L); Host organism: Goat; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2534096 |
| mCherry monoclonal (16D7) | Thermo Fisher Scientific | M11217 | Antigen target: mCherry tag; Host organism: Rat; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2536611 |
References
- Kokoris, G. J., Lam, N. Y., Ferin, M., Silverman, A. J., Gibson, M. J. Transplanted gonadotropin-releasing hormone neurons promote pulsatile luteinizing hormone secretion in congenitally hypogonadal (hpg) male mice. Neuroendocrinology. 48 (1), 45-52 (1988).
- Coquelin, A., Desjardins, C. Luteinizing hormone and testosterone in young and old male mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 243 (3), E257-E263 (1982).
- Carmel, P. W., Araki, S., Ferin, M. Pituitary stalk portal blood collection in rhesus monkeys: Evidence for pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH). Endocrinology. 99 (1), 243-248 (1976).
- Schuiling, G., Gnodde, H. Site of origin of the pulsatile secretion of luteinizing hormone in long-term ovariectomized rats. Journal of Endocrinology. 70 (1), 97-104 (1976).
- Hackwell, E. C. R., Ladyman, S. R., Brown, R. S. E., Grattan, D. R. Mechanisms of lactation-induced infertility in female mice. Endocrinology. 164 (5), 1-12 (2023).
- Bahougne, T., Kretz, M., Angelopoulou, E., Jeandidier, N., Simonneaux, V. Impact of circadian disruption on female mice reproductive function. Endocrinology. 161 (4), (2020).
- Kreisman, M. J., McCosh, R. B., Tian, K., Song, C. I., Breen, K. M. Estradiol Enables Chronic Corticosterone to Inhibit Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion and Suppress Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Neuroendocrinology. 110 (6), 501-516 (2020).
- Moenter, S. M., Evans, N. P. Gonadotropin-releasing hormone GnRH measurements in pituitary portal blood. Journal of Neuroendocrinology. 34 (5), 13065 (2022).
- Maeda, K. I., et al. The LHRH pulse generator: A mediobasal hypothalamic location. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 19 (3), 427-437 (1995).
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
- Minabe, S., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K. Analysis of pulsatile and surge-like luteinizing hormone secretion with frequent blood sampling in female mice. Journal of Reproduction and Development. 57 (5), 660-664 (2011).
- Perreau-Lenz, S., Kalsbeek, A., Pévet, P., Buijs, R. M. Glutamatergic clock output stimulates melatonin synthesis at night. European Journal of Neuroscience. 19 (2), 318-324 (2004).
- Herwig, A., Pévet, P., Bothorel, B., Steinlechner, S., Saboureau, M. Trans-pineal microdialysis in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): A tool to study seasonal changes of circadian clock activities. Journal of Pineal Research. 40 (2), 177-183 (2006).
- Adams, J. M., Otero-Corchon, V., Hammond, G. L., Veldhuis, J. D., Qi, N., Low, M. J. Somatostatin is essential for the sexual dimorphism of GH secretion, corticosteroid-binding globulin production, and corticosterone levels in mice. Endocrinology. 156 (3), 1052-1065 (2015).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).
- Krashes, M. J., et al. reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eighth edition. National Research Council. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188 (2011).
- Peters, S., et al. Culex ABS Part I: Introduction to automated blood sampling. Current Separations. 18 (4), 139-145 (2000).
- Bohs, C., Cregor, M., Gunaratna, G., Kissinger, C. Culex Automated blood sampler part II Managing freely-moving animals and monitoring their activity. Current Separations. 18 (4), 147-151 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kreisman, M. J., Mccosh, R. B., Breen, K. M. A Modified ultra-sensitive ELISA for measurement of LH in mice. Endocrinology. 163 (9), (2022).
- Pielecka-Fortuna, J., Chu, Z., Moenter, S. M. Kisspeptin acts directly and indirectly to increase gonadotropin-releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by estradiol. Endocrinology. 149 (4), 1979-1986 (2008).
- Kumar, D., et al. Specialized subpopulations of kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in female mice. Endocrinology. 156 (1), 32-38 (2015).
- Caligioni, C. S.
- Czieselsky, K., et al. Pulse and surge profiles of luteinizing hormone secretion in the mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Wang, L., et al. Genetic dissection of the different roles of hypothalamic kisspeptin neurons in regulating female reproduction. eLife. 8, 43999 (2019).
- McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), e57894 (2018).
- Vanacker, C., Defazio, R. A., Sykes, C. M., Moenter, S. M. A role for glial fibrillary acidic protein (Gfap)-expressing cells in the regulation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) but not arcuate kisspeptin neuron output in male mice. eLife. 10, e68205 (2021).
- Dulka, E. A., Defazio, R. A., Moenter, S. M. Chemogenetic suppression of GnRH neurons during pubertal development can alter adult GnRH neuron firing rate and reproductive parameters in female mice. eNeuro. 7 (3), 0223 (2020).
- Talbi, R., et al. Characterization of the Action of Tachykinin Signaling on Pulsatile LH Secretion in Male Mice. Endocrinology. 162 (8), 1-9 (2021).
- Tuli, J., Smith, J., Morton, D. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animals. 29 (1), 90-95 (1995).
- Lucien, J. N., Ortega, M. T., Shaw, N. D.
