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Developmental Biology

फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी इंजेक्शन के माध्यम से रहने वाले ड्रोसोफिला भ्रूण में कम बहुतायत प्रोटीन और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की कल्पना

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66080
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1
1School of Life Sciences, SUSTech University, 2Shenzhen PKU-HKUST Medical Center, 3Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल अनुकूलित एंटीबॉडी-आधारित प्रतिदीप्ति लेबलिंग और प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण में इंजेक्शन का वर्णन करता है ताकि पारंपरिक जीएफपी / एमचेरी-टैग दृष्टिकोणों का उपयोग करके पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण कम-बहुतायत प्रोटीन या पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की लाइव इमेजिंग को सक्षम किया जा सके।

Abstract

जीएफपी (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) और अन्य फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के दृश्य ने प्रोटीन स्थानीयकरण, गतिशीलता और कार्य की समझ में काफी सुधार किया है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तुलना में, लाइव इमेजिंग अधिक सटीक रूप से ऊतक निर्धारण से उत्पन्न होने वाली संभावित कलाकृतियों के बिना प्रोटीन स्थानीयकरण को दर्शाता है। महत्वपूर्ण रूप से, लाइव इमेजिंग प्रोटीन के स्तर और स्थानीयकरण के मात्रात्मक और लौकिक लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है, जो गतिशील जैविक प्रक्रियाओं जैसे सेल आंदोलन या विभाजन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, फ्लोरोसेंट टैगिंग दृष्टिकोण की एक प्रमुख सीमा सफल दृश्य को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की आवश्यकता है। नतीजतन, अपेक्षाकृत कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ कई अंतर्जात टैग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता नहीं लगाया जा सकता है। दूसरी ओर, वायरल प्रमोटरों का उपयोग करके एक्टोपिक अभिव्यक्ति कभी-कभी शारीरिक संदर्भों में प्रोटीन मिसलोकलाइजेशन या कार्यात्मक परिवर्तन का कारण बन सकती है। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया जाता है जो जीवित भ्रूण में अत्यधिक संवेदनशील एंटीबॉडी-मध्यस्थता प्रोटीन का पता लगाने का उपयोग करता है, अनिवार्य रूप से ऊतक निर्धारण की आवश्यकता के बिना इम्यूनोफ्लोरेसेंस का प्रदर्शन करता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, अंतर्जात जीएफपी-टैग किए गए नॉच रिसेप्टर जो जीवित भ्रूण में मुश्किल से पता लगाने योग्य है, एंटीबॉडी इंजेक्शन के बाद सफलतापूर्वक कल्पना की जा सकती है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को जीवित भ्रूणों में पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जिससे प्रारंभिक भ्रूणजनन के दौरान टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन पैटर्न में अस्थायी परिवर्तनों का पता लगाने और एपिकल झिल्ली के नीचे फॉस्फोटाइरोसिन (पी-टायर) के एक उपन्यास उप-जनसंख्या का खुलासा हुआ। इस दृष्टिकोण को अन्य प्रोटीन-विशिष्ट, टैग-विशिष्ट, या पीटीएम-विशिष्ट एंटीबॉडी को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और अन्य इंजेक्शन-उत्तरदायी मॉडल जीवों या सेल लाइनों के साथ संगत होना चाहिए। यह प्रोटोकॉल कम बहुतायत प्रोटीन या पीटीएम की लाइव इमेजिंग के लिए नई संभावनाएं खोलता है जो पहले पारंपरिक फ्लोरोसेंट टैगिंग विधियों का उपयोग करके पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण थे।

Introduction

इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधुनिक कोशिका जीव विज्ञान की आधारशिला तकनीक है जो मूल रूप से अल्बर्ट कॉन्स द्वारा विकसित की गई है, जो उनके मूल सेलुलर डिब्बों में अणुओं का पता लगाने और उपकोशिकीय ऑर्गेनेल या मशीनरी की आणविक रचनाओं के लक्षण वर्णन को सक्षम बनातीहै। आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ युग्मित, immunofluorescence अब अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते हैं अवधारणा है कि प्रोटीन स्थानीयकरण अपने समारोह2 के लिए आवश्यक है स्थापित करने में मदद करता है. विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और उज्ज्वल फ्लोरोसेंट रंगों के अलावा, इस तकनीक की सफलता निर्धारण और पारगम्यता नामक एक प्रारंभिक प्रक्रिया पर निर्भर करती है, जो सेलुलर आकृति विज्ञान को संरक्षित करती है, एंटीजन को स्थिर करती है, और इंट्रासेल्युलर डिब्बों में एंटीबॉडी की पहुंच को बढ़ाती है। अनिवार्य रूप से, निर्धारण और पारगम्यता प्रक्रिया कोशिकाओं को मार देगी और सभी जैविक प्रक्रियाओं को समाप्त कर देगी3. इसलिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस केवल प्रोटीन की जीवन यात्रा का स्नैपशॉट प्रदान करता है। हालांकि, सेल माइग्रेशन और डिवीजनों जैसे कई जैविक प्रक्रियाएं प्रकृति में गतिशील हैं, एक स्थानिक-अस्थायी रूप से हल किए गए तरीके से प्रोटीन व्यवहार की जांच की आवश्यकता होती है 4,5.

जीवित जीवों में प्रोटीन की गतिशीलता की जांच करने के लिए, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी)6 और उच्च गति वाले कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर आधारित लाइव इमेजिंग विधियों का विकास किया गया है। संक्षेप में, ब्याज की प्रोटीन आनुवंशिक रूप से GFP7 के साथ जुड़े होने के लिए हेरफेर किया जा सकता है, और फिर सनकी रूप से वायरल या खमीर प्रमोटरों जैसे साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी)8 या अपस्ट्रीम सक्रियण अनुक्रम (यूएएस)9से व्यक्त किया जा सकता है। क्योंकि जीएफपी प्रकृति में ऑटोफ्लोरोसेंट है, लक्ष्य प्रोटीन के स्थानीयकरण को प्रकट करने के लिए कोई फ्लोरोफोर-युग्मित एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं होती है, जो निर्धारण या पारगम्यता की प्रारंभिक प्रक्रियाओं की आवश्यकता को दरकिनार करता है। पिछले दो दशकों में, तरंग दैर्ध्य के पूरे स्पेक्ट्रम में फैले फ्लोरोसेंट टैग10 विकसित किए गए हैं, जो एक ही समय में कई लक्ष्य प्रोटीन के बहु-रंग लाइव इमेजिंग को सक्षम करते हैं। हालांकि, ऐसे AlexaFluor या ATTO के रूप में रासायनिक इंजीनियर फ्लोरोसेंट रंगों की तुलना में, इन आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन के autofluorescence अपेक्षाकृत कमजोर और अस्थिर है जब अंतर्जात प्रमोटरों से व्यक्त की, विशेष रूप से लंबे समय तक तराजू10 से अधिक लाइव इमेजिंग के दौरान. हालांकि इस कमी को फ्लोरोसेंटली टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन को अधिक व्यक्त करके कम किया जा सकता है, कई एंजाइमेटिक गतिविधियों जैसे कि किनेसेस और फॉस्फेटेस के साथ शारीरिक स्तर पर व्यक्त नहीं किए जाने पर सामान्य जैविक प्रक्रियाओं को गंभीर रूप से बाधित करते हैं।

यह प्रोटोकॉल एक ऐसी विधि प्रस्तुत करता है जो एक लाइव छवि सेटअप में फोटोटेबल एंटीबॉडी-आधारित लक्ष्य रोशनी को सक्षम बनाता है, अनिवार्य रूप से निर्धारण या पारगम्यता(चित्रा 1)की प्रक्रिया के बिना इम्यूनोफ्लोरेसेंस की अनुमति देता है। एक साधारण एनएचएस आधारित प्राथमिक अमाइन प्रतिक्रिया11 के माध्यम से, एक अनिवार्य रूप से किसी भी प्राथमिक एंटीबॉडी या GFP/HA/Myc नैनो12 के साथ AlexaFluor 488 या 594 जैसे फ्लोरोसेंट रंगों को संयुग्मित कर सकता है। एक विकासात्मक विशेषता का लाभ उठाते हुए कि सभी ड्रोसोफिला भ्रूण कोशिकाएं सिंकिटियम चरण13 के दौरान एक सामान्य साइटोप्लाज्म साझा करती हैं, कोई डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी के इंजेक्शन के बाद पूरे भ्रूण में एंटीजन बाइंडिंग और रोशनी प्राप्त कर सकता है। ड्रोसोफिला और अन्य मॉडल सिस्टम14 में उपलब्ध अंतर्जात टैग प्रोटीन के पुस्तकालयों के विस्तार के साथ, इस विधि संभावित रूप से कम बहुतायत फ्लोरोसेंटली टैग प्रोटीन और अन्य गैर fluorescently टैग (एचए / Myc-टैग ) प्रोटीन जीवित ऊतकों में की गतिशीलता का खुलासा करके इन पुस्तकालयों के अनुप्रयोगों को व्यापक बना सकते हैं.

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Protocol

प्रयोग स्कूल ऑफ लाइफ साइंसेज, SUSTech विश्वविद्यालय के दिशानिर्देशों और अनुमोदन के अनुसार आयोजित किए गए थे। उपयोग किया जाने वाला जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर है, और जीनोटाइप नॉच-नॉकिन-जीएफपी (क्रोमोसोम एक्स) और स्क्वायर-एसक्यूएच-जीएफपी (क्रोमोसोम II) हैं, जो क्रमशः डॉ। इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से एंटीबॉडी लेबलिंग और लाइव इमेजिंग के पहलुओं पर केंद्रित है, ड्रोसोफिला भ्रूण संग्रह और इंजेक्शन15,16 के अधिक विस्तृत विवरण के लिए प्रकाशित रिपोर्ट देखें.

1. एंटीबॉडी के फ्लोरोसेंट लेबलिंग

  1. अधिमानतः, ब्याज के प्रोटीन के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या नैनोबॉडी का उपयोग करें। 1 मिलीग्राम / एमएल या उससे अधिक पर एंटीबॉडी की स्टॉक एकाग्रता तैयार करें।
    नोट: इस अध्ययन में, जीएफपी नैनो ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीएफपी नैनो को 1.0 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता और 250 माइक्रोन की मात्रा में पैक किया जाता है। इसके अतिरिक्त, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी लेबलिंग किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया जाता है, जो एलेक्सा फ्लोर 594 को एक succinimidyl एस्टर प्रतिक्रिया11के माध्यम से प्रोटीन के प्राथमिक अमाइन में संयुग्मित करता है। महत्वपूर्ण बात, इस लेबलिंग प्रक्रिया काफी एंटीबॉडी एकाग्रता में परिवर्तन नहीं करता है.
  2. विआयनीकृत पानी के 1 एमएल में घटक बी (एंटीबॉडी लेबलिंग किट में प्रदान की गई) को निलंबित करके 1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान तैयार करें।
  3. एमएल के लिए एंटीबॉडी एकाग्रता को समायोजित करें, फिर 1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान के 1/10वें वॉल्यूम (100 माइक्रोन जीएफपी नैनोबॉडी के लिए 10 माइक्रोन) जोड़ें।
  4. एलेक्सा फ्लोर 594 डाई युक्त ट्यूब में सीधे एंटीबॉडी मिश्रण (चरण 1.3 से) के 110 माइक्रोन जोड़ें। मिश्रण करने के लिए पलटना (भंवर नहीं) और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक रोटेटर पर सेते हैं.
  5. संयुग्मन किट से शुद्धि स्तंभ को इकट्ठा करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। एक 1.5 एमएल राल बिस्तर (एंटीबॉडी लेबलिंग किट में प्रदान की गई) तैयार करें और राल से अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 मिन के लिए 1100 x ग्राम पर कॉलम को अपकेंद्रित्र करें।
  6. लेबल एंटीबॉडी इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए राल स्तंभ और अपकेंद्रित्र के शीर्ष पर 1100 x ग्राम पर ड्रॉपवाइज प्रतिक्रिया मिश्रण (चरण 1.4 से) जोड़ें। एकत्रित एंटीबॉडी रंग में गुलाबी दिखाई देना चाहिए, और मात्रा 100 माइक्रोन से थोड़ा कम होना चाहिए। पन्नी लिपटे या गहरे रंग की ट्यूबों में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. ड्रोसोफिला भ्रूण की तैयारी

  1. 1: 10 के नर-से-महिला अनुपात के साथ प्लास्टिक सिलेंडर के आकार के पिंजरे (व्यास = 5 सेमी, ऊंचाई = 8 सेमी) में 200 नव रचे हुए वयस्क ड्रोसोफिला रखें। वेंटिलेशन के लिए झरझरा धातु की जाली के साथ एक तरफ सील करें और दूसरी तरफ फल-रस/खमीर-पेस्ट अगर प्लेट के साथ।
  2. भ्रूण संग्रह से पहले तीन दिनों के लिए हर 12 घंटे थाली बदलें. यह ड्रोसोफिला अंडे देने के सिंक्रनाइज़ेशन की अनुमति देता है और संग्रह दक्षता में सुधार करता है।
  3. इंजेक्शन के दिन, कम से कम खमीर पेस्ट के साथ एक फल का रस थाली के लिए पिंजरे को बदलने और 1 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण इकट्ठा. संग्रह के पहले दौर पर्याप्त भ्रूण (<50 भ्रूण) उपज नहीं है, तो पहली थाली त्यागें और संग्रह का एक दूसरे दौर के लिए इस कदम को दोहराने जब तक 100 से अधिक भ्रूण 1 घंटे के भीतर रखी जाती हैं.
  4. अंडे बिछाने को रोकने के लिए पिंजरे से प्लेट निकालें और 2-3 घंटे पुराने भ्रूण प्राप्त करने के लिए एक और 2 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एंटीबॉडी इंजेक्शन की सफलता के लिए भ्रूण का सही चरण महत्वपूर्ण है।
  5. भ्रूण के अंडे के छिलके को हटाने के लिए, फल-रस प्लेट में 50% ब्लीच के 2 एमएल जोड़ें और धीरे-धीरे एक तूलिका (चित्रा 2 ए -4) का उपयोग करके प्लेट से भ्रूण को हटा दें। अक्सर, भ्रूण सीधे खमीर पेस्ट के ऊपर रखा जाएगा. इस मामले में, सभी भ्रूणों को इकट्ठा करने के लिए ब्लीच समाधान में खमीर पेस्ट को ब्रश करना स्वीकार्य है।
  6. 2 मिनट के लिए 50% ब्लीच में चल भ्रूण सेते हैं और अंडे हटाने की दक्षता में सुधार करने के लिए हर 30 एस फल का रस प्लेट भंवर.
  7. भ्रूण/ब्लीच मिश्रण को 70 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी(चित्रा 2ए-7)में डालकर स्थानांतरित करें। किसी भी अवशिष्ट ब्लीच और खमीर पेस्ट को हटाने के लिए एक पानी की बोतल का उपयोग कर भ्रूण अच्छी तरह से धो लें. कागज तौलिये के साथ पूरी तरह से सेल झरनी सूखी, सुनिश्चित करना है कि भ्रूण के आसपास किसी भी अतिरिक्त पानी हटा दिया जाता है.

3. भ्रूण संरेखण और निर्जलीकरण

  1. एक 5 सेमी x 5 सेमी x 0.5 सेमी (चौड़ाई, लंबाई, ऊंचाई) 4% agarose जेल (चित्रा 2A-9) तैयार करें और जेल कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं. एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करके 1 सेमी x 3 सेमी x 0.5 सेमी (चौड़ाई, लंबाई, ऊंचाई) अगारोज ब्लॉक काटें और ब्लॉक को ग्लास स्लाइड (चित्र 2A-2) पर रखें। किनारों सीधे कटौती कर रहे हैं कि सुनिश्चित करने के लिए विदारक गुंजाइश के तहत जेल ब्लॉक की जांच, और सतह फ्लैट और सूखी है.
  2. एक तूलिका का उपयोग कर जेल ब्लॉक पर छलनी से भ्रूण स्थानांतरण. धीरे ब्रश करके ब्लॉक के midline के साथ समान रूप से भ्रूण फैलाओ. आदर्श रूप से, भ्रूण के समूहों को एक दूसरे को छूने के बिना एकल या दोहरे में विभाजित किया जाता है।
  3. दो पैरों कसकर एक साथ टेप के साथ एक चिमटी तैयार एक एकल ठीक टिप (चित्रा 2A-5) बनाने के लिए. एक विदारक गुंजाइश के तहत, चिमटी का उपयोग कर अलग-अलग भ्रूण लेने के लिए और जेल ब्लॉक के लंबे किनारे के साथ उन्हें जगह है. 20-30 भ्रूण संरेखित करें, यह सुनिश्चित करना कि उनके पूर्वकाल-पश्च अक्ष किनारे के समानांतर है (चित्र 2C)।
  4. पिपेट 10 माइक्रोन हेप्टेन गोंद (सामग्री की तालिकादेखें) एक 24 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप (चित्रा 2 ए -1) के केंद्र में और एक विंदुक टिप का उपयोग कर एक 0.5 सेमी x 3 सेमी आयताकार क्षेत्र में गोंद फैलाएं। उपयोग करने से पहले गोंद के पूरी तरह से सूखने की प्रतीक्षा करें।
  5. डेस्क के किनारे पर जेल ब्लॉक के साथ ग्लास स्लाइड रखें, भ्रूण बाहर की ओर का सामना करना पड़ के साथ. एक फ्लैट टिप चिमटी (चित्रा 2A-6) का उपयोग गोंद के साथ coverslip लिफ्ट और चारों ओर 45 डिग्री के एक झुका कोण पर भ्रूण की ओर का सामना करना पड़ गोंद पक्ष के साथ, भ्रूण के शीर्ष पर अभी भी पकड़.
    नोट: धीरे जेल ब्लॉक के खिलाफ coverslip प्रेस इतना है कि भ्रूण गोंद के साथ संपर्क में हो जाएगा, और फिर जल्दी से दबाव छोड़ने और coverslip उठा. लागू तनाव की मात्रा महत्वपूर्ण है ताकि भ्रूण को बहुत कठिन और फटने के बिना गोंद से स्थिर रूप से जोड़ा जा सके।
  6. एक नई ग्लास स्लाइड के केंद्र में पिपेट 10 माइक्रोन पानी और इसके शीर्ष पर भ्रूण के साथ कवरस्लिप रखें, भ्रूण के किनारे ऊपर की ओर (चित्रा 2बी) का सामना करना पड़ रहा है। coverslip के इस पक्ष लाइव इमेजिंग के लिए confocal लेंस के शीर्ष पर सीधे रखा जाएगा के रूप में, कांच स्लाइड को coverslip संलग्न करने के लिए नेल पॉलिश या अन्य चिपकने वाला गोंद के बजाय पानी का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें.
  7. विटेलिन झिल्ली झुर्रियों(चित्रा 2ई)तक 10-15 मिनट के लिए एक निर्जलीकरण कक्ष (चित्र 2ए-3)(सामग्री की तालिकादेखें) में भ्रूण को सुखाएं। आवश्यक समय कमरे की आर्द्रता के साथ भिन्न हो सकता है और प्रत्येक प्रयोगशाला स्थिति के लिए प्रयोगात्मक रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए।
  8. भ्रूण पट्टी के एक छोर पर हेलोकार्बन तेल के पिपेट 40 माइक्रोन (मात्रा में 1: 1 अनुपात में टाइप 27 और टाइप 700 का मिश्रण, सामग्री की तालिकादेखें)। स्लाइड झुकाव जब तक halocarbon तेल भ्रूण की पूरी सतह को कवर.

4. एंटीबॉडी इंजेक्शन और इमेजिंग

  1. एक माइक्रोपिपेट पुलर (पैरामीटर सेटिंग्स के लिए सामग्री की तालिकादेखें ) का उपयोग करके कुछ इंजेक्शन ग्लास सुइयों को तैयार करें और प्रत्येक सुई को एलेक्साफ्लोर-लेबल एंटीबॉडी समाधान (चरण 1.6 से) के 5 माइक्रोन के साथ लोड करें।
  2. एक गिलास स्लाइड के शीर्ष पर एक 25 मिमी x 25 मिमी coverslip रखें. हेलोकार्बन तेल के पिपेट 40 माइक्रोन और इसे कवरस्लिप के किनारे पर फैलाएं।
  3. इंजेक्शन गुंजाइश के तहत, तेल के नीचे coverslip के किनारे के खिलाफ सुई की नोक संरेखित. पिकोपंप के इंजेक्शन हवा के दबाव को समायोजित करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ताकि एक पंप एंटीबॉडी से भरा एक बुलबुला उत्पन्न करे। बुलबुला व्यास 20-50 माइक्रोन (चित्रा 2 एफ) तक सीमित होना चाहिए।
  4. तेल के नीचे भ्रूण युक्त एक के साथ खाली गिलास स्लाइड बदलें. इंजेक्शन सुई टिप लंबवत भ्रूण के पूर्वकाल-पीछे अक्ष (चित्रा 2 डी, जी) के खिलाफ संरेखित करें।
  5. यह सुनिश्चित करने के लिए भ्रूण के चरण की जांच करें कि अधिकांश ने सेलुलराइजेशन शुरू कर दिया है, लेकिन अभी तक गैस्ट्रुलेशन (चरण 4 और चरण 5) शुरू नहीं किया है, एक सिंकिटियम (चित्रा 2एफ, जी) के रूप में शेष है।
    नोट: इस चरण की पहचान किसी भी खांचे या सिलवटों की अनुपस्थिति और भ्रूण के केंद्र में दिखाई देने वाली अंडाकार आकार की, गहरे रंग की जर्दी थैली की उपस्थिति है। तेल के तहत भ्रूण चरण का रूपात्मक लक्षण वर्णन वोल्कर हार्टेनस्टीन17 द्वारा पुस्तक अध्याय "ड्रोसोफिला भ्रूणजनन के चरण" पर आधारित है।
  6. एक्सवाई चरण मैनिपुलेटर का उपयोग सुई की ओर भ्रूण ले जाने के लिए जब तक टिप जर्दी के केंद्र में आता है. जर्दी में एंटीबॉडी इंजेक्ट करने के लिए दो से तीन बार पंप करें। सफल इंजेक्शन vitelline झिल्ली शिकन के त्वरित गायब होने के रूप में भ्रूण एंटीबॉडी समाधान (चित्रा 2G) से मात्रा लाभ द्वारा संकेत दिया है.
  7. इंजेक्शन के बाद सुई से दूर भ्रूण ले जाने के लिए एक्सवाई चरण मैनिपुलेटर का उपयोग करें और अगले भ्रूण के लिए नीचे की ओर ले जाएं। 6 कदम दोहराएँ जब तक स्लाइड पर सभी भ्रूण इंजेक्शन रहे हैं.
  8. इंजेक्शन भ्रूण के साथ ग्लास स्लाइड को एक आर्द्रता कक्ष(चित्रा 2ए-8)में स्थानांतरित करें। भ्रूण के विकास के वांछित चरण प्राप्त होने तक 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. ग्लास स्लाइड से 24 मिमी x 50 मिमी कवरस्लिप उठाएं और इसे सीधे माइक्रोस्कोप के स्लाइड धारक में रखें। भ्रूण के बिना पक्ष उद्देश्यों का सामना कर रहा होगा। उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत एक कम बढ़ाई लेंस का उपयोग भ्रूण का पता लगाएँ और उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट लाइव इमेजिंग के लिए एक 40x या 63x लेंस के लिए स्विच.

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Representative Results

फ्लोरोसेंट-टैग-आधारित लाइव इमेजिंग या इम्यूनोफ्लोरेसेंस पर एंटीबॉडी इंजेक्शन विधि के फायदों को प्रदर्शित करने के लिए, दो केस स्टडी प्रदान की जाती हैं जो कम-बहुतायत ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर, नॉच, और एक प्रकार के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन के गतिशील स्थानीयकरण की विशेषता है जिसे जीवित भ्रूण में टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन कहा जाता है।

पायदान संकेतन गतिविधि भ्रूणजनन और वयस्क अंग होमियोस्टेसिस18,19 के दौरान सेल भाग्य निर्धारण में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. दांतेदार20 द्वारा सक्रियण पर, ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर नॉच के इंट्रासेल्युलर डोमेन को क्लीव किया जाता है और नाभिक21 में जारी किया जाता है, सेल भाग्यपरिवर्तन 22 को चलाने के लिए डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्शनल प्रोग्राम शुरू करता है। नॉच रिसेप्टर के स्थैतिक स्थानीयकरण को फॉर्मलाडेहाइड-फिक्स्ड ऊतकों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा अच्छी तरह से विशेषता दी गई है। हालांकि, लिगैंड बाइंडिंग या इंट्रासेल्युलर क्लीवेज प्रक्रिया के दौरान नॉच का गतिशील स्थानीयकरण काफी हद तक अज्ञात23 रहता है, क्योंकि उच्च गति वाले तरीके से इस अपेक्षाकृत कम बहुतायत प्रोटीन को लाइव इमेजिंग के लिए एक विधि की कमी के कारण। यहाँ, हम AlexaFluor-संयुग्मित GFP नैनो अंतर्जात स्थान20 से GFP टैग पायदान व्यक्त भ्रूण में इंजेक्शन. इंजेक्शन के बिना, पायदान GFP मुश्किल से मानक लाइव इमेजिंग शर्तों के तहत detectable है, और फ्लोरोसेंट संकेत जल्दी से समय चूक इमेजिंग के दौरान bleaches. इंजेक्शन के बाद, नॉच रिसेप्टर के सिग्नल-टू-शोर अनुपात में काफी सुधार होता है, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस(चित्रा 3ए)की सिग्नल गुणवत्ता के बराबर होता है। इसके अलावा, एंटीबॉडी इंजेक्शन एक 5 मिनट इमेजिंग विंडो(चित्रा 3बी)पर संकेत तीव्रता का एक स्पष्ट नुकसान के बिना, 45 एस अंतराल पर पायदान स्थानीयकरण के अस्थायी लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है.

Tyrosine phosphorylation के बाद अनुवाद प्रोटीन संशोधन का एक प्रमुख प्रकार है कि कई जैविक रास्ते24 में संकेत पारगमन मध्यस्थता है. फॉस्फोटाइरोसिन (पी-टायर) के खिलाफ अत्यधिक विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (जैसे PY20 और 4G10) को इम्यूनोफ्लोरेसेंस और पश्चिमी धब्बे,25 का उपयोग करके स्थानीयकरण और समग्र टाइरोसिन फॉस्फोराइलेशन के स्तर को चिह्नित करने के लिए विकसित किया गया है। जबकि कोई फ्लोरोसेंट टैग फॉस्फोराइलेशन परिवर्तनों को ट्रैक कर सकते हैं, ऊतकों या कोशिकाओं को समय के साथ फॉस्फोराइलेशन स्थिति के स्नैपशॉट प्रदान करने के लिए अलग-अलग समय बिंदुओं पर तय और दाग या लाइस्ड और ब्लॉट करने की आवश्यकता होती है, सिग्नल सक्रियण26 (जैसे, विकास कारक उपचार) पर टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन के कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए। इस दृष्टिकोण का समय अंतराल कम से कम कुछ मिनट लंबा है और निर्धारण या सेल लाइसिस जैसी प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक चर समय के कारण स्वाभाविक रूप से गलत है।

यहां, सबूत प्रस्तुत किया जाता है कि एंटीबॉडी इंजेक्शन विधि जीवित भ्रूण में फॉस्फोराइलेशन स्थिति के प्रत्यक्ष दृश्य को सक्षम बनाती है, नियमित, सेकंड-स्तरीय समय अंतराल पर टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन के स्थानीयकरण और तीव्रता परिवर्तनों को ट्रैक करती है। AlexaFluor-संयुग्मित PY20 एंटीबॉडी को GFP-टैग किए गए मायोसिन प्रकाश श्रृंखला को व्यक्त करने वाले भ्रूण में इंजेक्ट किया गया था और 45 s अंतराल पर दोहरे रंग की लाइव इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया था। जैसा कि पहले दिखाया गया था, टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन ट्राइकोशिकीय जंक्शनों27 पर अत्यधिक समृद्ध है, एक पैटर्न जिसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस(चित्रा 4ए)द्वारा पुन: प्रस्तुत किया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि लाइव इमेजिंग ने एपिकल झिल्ली के केंद्र के नीचे पी-टायर सिग्नल की एक उपन्यास, दूसरी आबादी का भी खुलासा किया, जिसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस(चित्रा 4बी)का उपयोग करके नहीं देखा जाता है। दोहरे रंग इमेजिंग के माध्यम से, यह पाया गया कि पी-टायर सिग्नल की यह आबादी औसत दर्जे का मायोसिन (चित्रा 4 बी, क्लोज-अप) के करीब है, मायोसिन28 की एक उप-जनसंख्या है जो इसी तरह केवल लाइव इमेजिंग स्थितियों में स्पष्ट है लेकिन इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके मुश्किल से पता लगाने योग्य है। इसके अलावा, पी-टायर की औसत दर्जे की आबादी समान स्पंदनीय सहवास और अपव्यय पैटर्न(चित्रा 4सी)प्रदर्शित करती है, जैसा कि पहले औसत दर्जे का मायोसिन28के लिए दिखाया गया था। पी-टायर की औसत दर्जे की उप-जनसंख्या की पहचान और कार्य अभी भी अज्ञात हैं। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि एंटीबॉडी इंजेक्शन विधि कम-बहुतायत प्रोटीन के व्यवहार को चिह्नित करने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोणों को बहुत पूरक कर सकती है और उपन्यास स्थानीयकरण पैटर्न को प्रकट कर सकती है जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस की प्रक्रिया के दौरान बाधित हो सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: एंटीबॉडी इंजेक्शन वर्कफ़्लो। योजनाबद्ध वर्कफ़्लो एंटीबॉडी इंजेक्शन विधि में शामिल चरणों को दर्शाता है। भ्रूण संग्रह से लेकर एंटीबॉडी इंजेक्शन तक पूरी प्रक्रिया को पूरा होने में आमतौर पर लगभग 4-5 घंटे लगते हैं। एंटीबॉडी इंजेक्शन के बाद, भ्रूण लाइव इमेजिंग से पहले विकास के वांछित चरण के लिए एक आर्द्रता कक्ष में ऊष्मायन किया जा सकता है. एईएल, अंडे देने के बाद; आरटी, कमरे का तापमान; एबी, एंटीबॉडी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूण संरेखण और इंजेक्शन। (ए) इंजेक्शन से पहले आवश्यक वस्तुओं का अवलोकन, जिसमें एक कवरस्लिप, ग्लास स्लाइड, डेसिकेशन बॉक्स, पेंटब्रश, चिमटी, सेल स्ट्रेनर, आर्द्रता कक्ष और अगारोज जेल शामिल हैं। (बी)Recoverslip के केंद्र में heptane गोंद से जुड़ी गठबंधन भ्रूण और desiccation मोती के शीर्ष पर रखा. (सी)agarose जेल के किनारे के साथ समानांतर में भ्रूण 'पूर्वकाल-पीछे अक्ष के संरेखण. (डी) इंजेक्शन सेटअप का अवलोकन। (ई) निर्जलीकरण प्रक्रिया से पहले और बाद में भ्रूण आकृति विज्ञान की तुलना, निर्जलीकरण के बाद विटेलिन झिल्ली की शिकन पर ध्यान देने के साथ। (एफ) पिकोपंप के एक प्रेस के बाद इंजेक्शन बुलबुले का आकार। (जी)एंटीबॉडी इंजेक्शन से पहले और बाद में भ्रूण आकृति विज्ञान की तुलना, इंजेक्शन के बाद झिल्ली झुर्रियों के गायब होने पर प्रकाश डाला। (ईजी) को ब्राइट-फील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 10x आवर्धन उद्देश्य लेंस के तहत कैप्चर किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रारंभिक भ्रूण में पायदान रिसेप्टर की लाइव इमेजिंग। (ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस (बाएं) के माध्यम से अंतर्जात जीएफपी-टैग किए गए नॉच रिसेप्टर का स्थानीयकरण, जीएफपी ऑटोफ्लोरेसेंस (मध्य), और एलेक्साफ्लोर 594-संयुग्मित जीएफपी नैनो इंजेक्शन (दाएं) पर आधारित प्रत्यक्ष लाइव इमेजिंग। (बी)एंटीबॉडी इंजेक्शन के बाद 45 एस अंतराल पर छवि पायदान जीएफपी के गतिशील स्थानीयकरण. सभी छवियों बाईं ओर भ्रूण के पूर्वकाल और नीचे का सामना करना पड़ उदर पक्ष के साथ अधिग्रहित किया गया. स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: भ्रूण फॉस्फोटाइरोसिन पैटर्न की लाइव इमेजिंग। (ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से निश्चित भ्रूण में फॉस्फोराइलेटेड टाइरोसिन (पी-टायर) का स्थानीयकरण। (बी)जीएफपी-टैग मायोसिन प्रकाश श्रृंखला (हरा) व्यक्त जीवित भ्रूण में पी-टायर (मैजेंटा) का स्थानीयकरण। सफेद धराशायी बॉक्स एपिकल झिल्ली के नीचे फॉस्फोटाइरोसिन और मायोसिन की औसत दर्जे की आबादी के क्लोज-अप दृश्यों को इंगित करता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (सी) पी-टायर और जीएफपी-मायोसिन का स्थानीयकरण जीवित भ्रूण में हर 45 एस को चित्रित करता है। सफेद तीर पी-टायर और मायोसिन की औसत दर्जे की आबादी का संकेत देते हैं। सभी छवियों बाईं ओर भ्रूण के पूर्वकाल और नीचे का सामना करना पड़ उदर पक्ष के साथ कब्जा कर लिया गया. स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रस्तुत प्रक्रिया कस्टम एंटीबॉडी के साथ प्रतिदीप्ति लेबलिंग की विशेष विधि और प्रारंभिक चरण ड्रोसोफिला भ्रूण में बाद में इंजेक्शन की रूपरेखा तैयार करती है। यह तकनीक प्रोटीन या पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के वास्तविक समय के दृश्य की सुविधा प्रदान करती है जो कम मात्रा में मौजूद हैं और आमतौर पर पारंपरिक जीएफपी / एमचेरी टैगिंग विधियों के माध्यम से निरीक्षण करना मुश्किल है।

जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती भ्रूण के बीच मात्रात्मक तुलना करने के लिए इस विधि का विस्तार करते समय सावधानी बरतनी चाहिए। जबकि प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता को इम्यूनोफ्लोरेसेंस में नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच समान रखा जा सकता है, एंटीबॉडी इंजेक्शन की मात्रा और लेबलिंग दक्षता भ्रूण के बीच भिन्न हो सकती है। इसलिए, मात्रात्मक विश्लेषण समय के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता परिवर्तन पर नज़र रखने या बहु-रंग लाइव इमेजिंग करते समय एक ही भ्रूण में अन्य चैनलों के संकेतों के साथ सहसंबंध विश्लेषण करने तक सीमित होना चाहिए। उदाहरण के लिए, colocalization और सहसंबंध विश्लेषण p-Tyr और myosin तीव्रता27 का उपयोग कर किया जा सकता है, जबकि पी टायर तीव्रता सीधे जंगली प्रकार और जीन एक्स एंटीबॉडी इंजेक्शन विधि का उपयोग भ्रूण के बीच तुलना नहीं की जा सकती.

प्रोटीन गतिशीलता की जांच करने के लिए अन्य फ्लोरोसेंट-टैग-आधारित दृष्टिकोणों के समान, एंटीबॉडी बाध्यकारी संभावित रूप से लक्ष्य प्रोटीन की गतिविधि, तस्करी या स्थानीयकरण को बदल सकता है। इसलिए, इंजेक्शन के लिए पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी पर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या नैनोबॉडी को प्राथमिकता दी जाती है। क्योंकि मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या नैनोबॉडी के एपिटोप्स को अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है, चाहे एंटीबॉडी के साथ इन एपिटोप्स को अवरुद्ध करने से प्रोटीन गतिविधि अल्फा-गुना संरचनाओं12,25 के आधार पर मॉडलिंग की जा सकती है। दूसरी ओर, पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के एपिटोप्स को ठीक से चित्रित नहीं किया जाता है, और उनके बंधन संभावित रूप से प्रोटीन स्थानीयकरण या गतिविधि को बदल सकते हैं यदि उत्प्रेरक जेब या लक्ष्य प्रोटीन के सिग्नल पेप्टाइड्स अवरुद्ध हैं। दूसरा, एंटीबॉडी लक्ष्य प्रोटीन के अलावा गैर-विशिष्ट एपिटोप्स को पहचान सकते हैं, विशेष रूप से यह देखते हुए कि यहां कोई "वॉशआउट" कदम नहीं हैं, जैसा कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस में, कम-आत्मीयता गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को हटाने के लिए। इसलिए, नियंत्रण समूहों का होना महत्वपूर्ण है, जैसे कि एपिटोप की कमी वाली कोशिकाओं में एंटीबॉडी को इंजेक्ट करना, यह सत्यापित करने के लिए कि क्या देखा गया संकेत वास्तव में लक्ष्य प्रोटीन या अन्य गैर-विशिष्ट एपिटोप्स को दर्शाता है।

एंटीबॉडी का इंजेक्शन प्रयोगात्मक सेटअप के संदर्भ में siRNA या CRISPR gRNAs इंजेक्शन से अलग नहीं है। इसलिए, अधिकांश सेलुलर सिस्टम जो इंजेक्शन के लिए उत्तरदायी हैं, एंटीबॉडी इंजेक्शन विधि के साथ संगत होना चाहिए। ड्रोसोफिला भ्रूण में, एलेक्सा फ्लोर-संयुग्मित एंटीबॉडी विकास के दौरान स्थिर होते हैं, और फ्लोरोसेंट सिग्नल भ्रूणजनन के घंटों के बाद पता लगाने योग्य रहते हैं। ज़ेनोपस या ज़ेब्राफिश भ्रूण जैसे अन्य प्रणालियों के लिए, एंटीबॉडी की एकाग्रता और इंजेक्शन मात्रा को आदर्श लेबलिंग दक्षता प्राप्त करने के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने के माध्यम से अनुभवजन्य रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एटीटीओ10 जैसे वैकल्पिक फ्लोरोसेंट रंजक संभावित रूप से बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात और पानी घुलनशीलता प्रदान कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम एसक्यूएच-जीएफपी ड्रोसोफिला लाइन प्रदान करने और इस तकनीक के प्रारंभिक विकास के लिए समर्थन प्रदान करने के लिए डॉ जेनिफर ए ज़ालेन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और नॉच-जीएफपी ड्रोसोफिला लाइन प्रदान करने के लिए डॉ फ्रेंकोइस श्वेइसगुथ। इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (32270809) से एचएचयू, स्कूल ऑफ लाइफ साइंसेज, एसयूएसटेक से उदार वित्तीय और कर्मचारियों के समर्थन और शेन्ज़ेन साइंस एंड टेक्नोलॉजी इनोवेशन कमीशन / JCYJ20200109140201722 से वाई यान को वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sangon Biotech  A620014 
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit Invitrogen  A20185 Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope SOPTOP EX20 Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments TW100F-4
Centrifuge Eppendorf 5245
Cell Strainer FALCON 352350
Desiccation chamber  LOCK&LOCK HSM8200 320ml
Dissecting Microscope Mshot MZ62 Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape Scotch 665
Fine Super Tweezer VETUS ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles Fisherbrand 12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Forcep VETUS 33A-SA
Halocarbon oil 27 Sigma-Aldrich H8773-100ML
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898-100ML
Heptane Sigma-Aldrich H2198-1L Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent  TOKAI 1-7315-01 Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micropipette puller World Precision Instruments PUL-1000 Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50.
Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 
Pneumatic picopump World Precision Instruments PV 830 Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20 Santa Cruz SC-508
Square petri dishes Biosharp BS-100-SD
GFP nanobody Chromotek gt

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 203
फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी इंजेक्शन के <em>माध्यम से</em> रहने वाले <em>ड्रोसोफिला</em> भ्रूण में कम बहुतायत प्रोटीन और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की कल्पना
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Zheng, Q., Xiang, X., Yan, Y., Yu,… More

Zheng, Q., Xiang, X., Yan, Y., Yu, H. H. Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection. J. Vis. Exp. (203), e66080, doi:10.3791/66080 (2024).

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