Summary
Denne protokollen beskriver den tilpassede antistoffbaserte fluorescensmerkingen og injeksjonen i tidlige Drosophila-embryoer for å muliggjøre levende avbildning av proteiner med lav overflod eller posttranslasjonelle modifikasjoner som er utfordrende å oppdage ved bruk av tradisjonelle GFP / mCherry-tag-tilnærminger.
Abstract
Visualisering av proteiner i levende celler ved hjelp av GFP (Green Fluorescent Protein) og andre fluorescerende koder har forbedret forståelsen av proteinlokalisering, dynamikk og funksjon. Sammenlignet med immunfluorescens reflekterer levende avbildning mer nøyaktig proteinlokalisering uten potensielle artefakter som oppstår fra vevfiksering. Det er viktig at levende bildebehandling muliggjør kvantitativ og tidsmessig karakterisering av proteinnivåer og lokalisering, avgjørende for å forstå dynamiske biologiske prosesser som cellebevegelse eller deling. En stor begrensning ved fluorescerende merkingsmetoder er imidlertid behovet for tilstrekkelig høye proteinuttrykksnivåer for å oppnå vellykket visualisering. Følgelig kan mange endogent merkede fluorescerende proteiner med relativt lave uttrykksnivåer ikke påvises. På den annen side kan ektopisk uttrykk ved bruk av virale promotorer noen ganger føre til feillokalisering av protein eller funksjonelle endringer i fysiologiske sammenhenger. For å løse disse begrensningene presenteres en tilnærming som benytter svært sensitiv antistoffmediert proteindeteksjon i levende embryoer, som i hovedsak utfører immunfluorescens uten behov for vevsfiksering. Som prinsippbevis kan endogent GFP-merket Notch-reseptor som knapt kan påvises i levende embryoer, visualiseres vellykket etter antistoffinjeksjon. Videre ble denne tilnærmingen tilpasset for å visualisere posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) i levende embryoer, noe som muliggjorde påvisning av tidsmessige endringer i tyrosinfosforyleringsmønstre under tidlig embryogenese og avsløring av en ny underpopulasjon av fosfotyrosin (p-Tyr) under apikale membraner. Denne tilnærmingen kan modifiseres for å imøtekomme andre proteinspesifikke, tag-spesifikke eller PTM-spesifikke antistoffer og bør være kompatibel med andre injeksjonsvennlige modellorganismer eller cellelinjer. Denne protokollen åpner nye muligheter for levende avbildning av proteiner med lav overflod eller PTM som tidligere var utfordrende å oppdage ved hjelp av tradisjonelle fluorescerende merkingsmetoder.
Introduction
Immunfluorescens er en hjørnesteinsteknikk for moderne cellebiologi opprinnelig utviklet av Albert Coons, som muliggjør påvisning av molekyler ved deres opprinnelige cellulære rom og karakterisering av molekylære sammensetninger av subcellulære organeller eller maskiner. Sammen med genetiske manipulasjoner bidrar immunfluorescens til å etablere det nå aksepterte konseptet om at proteinlokalisering er avgjørende for dens funksjon2. Bortsett fra spesifikke primære antistoffer og lyse fluorescerende fargestoffer, er suksessen til denne teknikken avhengig av en foreløpig prosess kalt fiksering og permeabilisering, som bevarer cellulære morfologier, immobiliserer antigener og øker tilgjengeligheten av antistoffer i intracellulære rom. Uunngåelig vil fikserings- og permeabiliseringsprosessen drepe celler og avslutte alle biologiske prosesser3. Derfor gir immunfluorescens bare øyeblikksbilder av livsreisen til proteiner. Imidlertid er mange biologiske prosesser som cellemigrasjon og divisjoner dynamiske i naturen, og krever undersøkelse av proteinadferd på en romlig-temporalt løst måte 4,5.
For å undersøke proteindynamikk i levende organismer har levende bildebehandlingsmetoder basert på genetisk kodede fluorescerende proteiner som grønt fluorescerende protein (GFP) 6 og høyhastighets konfokale mikroskoper blitt utviklet. Kort fortalt kan proteinet av interesse bli genetisk manipulert for å bli smeltet sammen med GFP7, og deretter ektopisk uttrykt fra virale eller gjærpromotorer som cytomegalovirus (CMV) 8 eller oppstrøms aktiveringssekvens (UAS) 9. Fordi GFP er autofluorescerende i naturen, er det ikke nødvendig med fluoroforkoblede antistoffer for å avsløre lokaliseringen av målproteiner, som omgår nødvendigheten av foreløpige prosesser for fiksering eller permeabilisering. I løpet av de siste to tiårene har fluorescerende koder som spenner over hele spekteret av bølgelengde blitt utviklet10, noe som muliggjør flerfarget levende avbildning av flere målproteiner samtidig. Imidlertid, sammenlignet med kjemisk konstruerte fluorescerende fargestoffer som AlexaFluor eller ATTO, er autofluorescensen av disse genetisk kodede fluorescerende proteinene relativt svak og ustabil når den uttrykkes fra endogene promotorer, spesielt under levende avbildning over lengre tidsskalaer10. Selv om denne mangelen kan reduseres ved å overuttrykke fluorescerende merkede målproteiner, forstyrrer mange med enzymatiske aktiviteter som kinaser og fosfataser alvorlige normale biologiske prosesser hvis de ikke uttrykkes på fysiologiske nivåer.
Denne protokollen presenterer en metode som muliggjør fotostabil antistoffbasert målbelysning i et levende bildeoppsett, som i hovedsak tillater immunfluorescens uten fikserings- eller permeabiliseringsprosess (figur 1). Gjennom en enkel NHS-basert primær aminreaksjon11 kan man konjugere fluorescerende fargestoffer som AlexaFluor 488 eller 594 med i hovedsak et primært antistoff eller GFP / HA / Myc nanobody12. Ved å dra nytte av en utviklingsfunksjon at alle Drosophila embryonale celler deler en felles cytoplasma under syncytiumstadiet13, kan man oppnå antigenbinding og belysning over hele embryoer etter injeksjon av fargekonjugerte antistoffer. Med utvidende biblioteker av endogent merkede proteiner tilgjengelig i Drosophila og andre modellsystemer14, kan denne metoden potensielt utvide anvendelser av disse bibliotekene ved å avsløre dynamikken i fluorescerende merkede proteiner med lav overflod og andre ikke-fluorescerende merkede (HA / Myc-merkede) proteiner i levende vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene og godkjenning fra School of Life Sciences, SUSTech University. Organismen som brukes er Drosophila melanogaster, og genotypene er Notch-Knockin-GFP (Chromosome X) og Sqh-sqh-GFP (Chromosome II), sjenerøst levert av laboratoriene til henholdsvis Dr. Francois Schweisguth (Institute Pasteur) og Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute). Selv om denne protokollen hovedsakelig fokuserer på aspekter ved antistoffmerking og levende bildebehandling, se publiserte rapporter for mer detaljerte beskrivelser av Drosophila embryoinnsamling og injeksjon15,16.
1. Fluorescerende merking av antistoffer
- Bruk helst monoklonale antistoffer eller nanolegemer for proteinet av interesse. Klargjør stamkonsentrasjonen av antistoffer ved 1 mg/ml eller høyere.
MERK: I denne studien brukes GFP nanobody (se Table of Materials) som et eksempel. Den kommersielt tilgjengelige GFP nanobody er pakket i en konsentrasjon på 1,0 mg / ml og et volum på 250 μL. I tillegg benyttes et kommersielt tilgjengelig antistoffmerkingssett (se materialtabell) som konjugerer Alexa Fluor 594 til primære aminer av proteiner gjennom en succinimidylesterreaksjon11. Det er viktig at denne merkingsprosessen ikke endrer antistoffkonsentrasjonen betydelig. - Forbered en 1 M natriumbikarbonatoppløsning ved å resuspendere komponent B (følger med i antistoffmerkingssettet) i 1 ml avionisert vann.
- Juster antistoffkonsentrasjonen til 1,0 mg / ml, og tilsett deretter 1/10th volum (10 μL for 100 μL GFP nanolegeme) av 1 M natriumbikarbonatoppløsning.
- Tilsett 110 μL av antistoffblandingen (fra trinn 1.3) direkte til røret som inneholder Alexa Fluor 594-fargestoff. Inverter for å blande (ikke virvel) og inkuber på en rotator i 1 time ved romtemperatur.
- Sett sammen rensekolonnen fra konjugasjonssettet (se Materialfortegnelse). Klargjør en 1,5 ml harpiksseng (følger med i antistoffmerkingssettet) og sentrifuger kolonnen ved 1100 x g i 3 minutter ved romtemperatur (RT) for å fjerne overflødig væske fra harpiksen.
- Tilsett reaksjonsblandingen (fra trinn 1.4) dråpevis til toppen av harpikskolonnen og sentrifuge ved 1100 x g i 5 minutter ved 4 °C for å samle opp det merkede antistoffet. Det oppsamlede antistoffet skal være rosa i fargen, og volumet skal være litt mindre enn 100 μL. Oppbevares i folieinnpakkede eller mørkfargede rør ved 4 °C.
2. Fremstilling av Drosophila embryoer
- Plasser 200 nyklekket voksen Drosophila i et plastsylinderformet bur (diameter = 5 cm, høyde = 8 cm) med et forhold mellom mann og kvinne på 1: 10. Forsegl den ene siden med porøst metallnett for ventilasjon og den andre siden med en fruktjuice/gjærpasta-agarplate.
- Bytt tallerken hver 12. time i tre dager før embryosamling. Dette tillater synkronisering av Drosophila egglegging og forbedrer innsamlingseffektiviteten.
- På injeksjonsdagen, bytt buret til en fruktjuiceplate med minimal gjærpasta og samle embryoer ved 25 ° C i 1 time. Hvis den første samlingsrunden ikke gir tilstrekkelige embryoer (<50 embryoer), kast den første platen og gjenta dette trinnet for en andre innsamlingsrunde til mer enn 100 embryoer legges innen 1 time.
- Fjern platen fra buret for å stoppe eggleggingen og rug ved 25 °C i ytterligere 2 timer for å oppnå embryoer som er 2-3 timer gamle. Det riktige stadiet av embryoer er avgjørende for suksessen til antistoffinjeksjon.
- For å fjerne eggeskallet av embryoer, tilsett 2 ml 50% blekemiddel til fruktjuiceplaten og løsne embryoer forsiktig fra platen ved hjelp av en pensel (figur 2A-4). Ofte vil embryoer legges direkte på toppen av gjærpastaen. I dette tilfellet er det akseptabelt å børste gjærpastaen i blekemiddelløsningen for å samle alle embryoer.
- Inkuber de flytende embryoene i 50% blekemiddel i 2 minutter og virvle fruktjuiceplaten hver 30. s for å forbedre effektiviteten av eggeskallfjerning.
- Overfør embryo / blekemiddelblandingen ved å helle den i en 70 μm nyloncellesil (figur 2A-7). Vask embryoene grundig med en vannflaske for å fjerne gjenværende blekemiddel og gjærpasta. Tørk cellesilen helt med papirhåndklær, og sørg for at overflødig vann rundt embryoene fjernes.
3. Embryojustering og uttørking
- Forbered en 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (bredde, lengde, høyde) 4% agarosegel (figur 2A-9) og la gelen avkjøles til romtemperatur. Klipp en agaroseblokk på 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (bredde, lengde, høyde) med et rent barberblad og plasser blokken på et glassglass (figur 2A-2). Undersøk gelblokken under dissekeringsomfanget for å sikre at kantene er kuttet rett, og overflaten er flat og tørr.
- Overfør embryoer fra silen til gelblokken ved hjelp av en pensel. Spre embryoene jevnt langs midtlinjen av blokken ved å børste forsiktig. Ideelt sett er klynger av embryoer separert i enkle eller dubletter uten å berøre hverandre.
- Forbered en pinsett med to ben teipet tett sammen for å lage en enkelt fin spiss (figur 2A-5). Under et dissekeringsomfang, plukk opp individuelle embryoer ved hjelp av pinsetten og plasser dem langs den lange kanten av gelblokken. Juster 20-30 embryoer, slik at deres fremre-bakre akse er parallell med kanten (figur 2C).
- Pipette 10 μL heptanlim (se materialfortegnelse) i midten av en 24 mm x 50 mm dekkslipp (figur 2A-1) og spre limet i et rektangulært område på 0,5 cm x 3 cm ved hjelp av en pipettespiss. Vent til limet tørker helt før bruk.
- Plasser glassglasset med gelblokken på kanten av skrivebordet, med embryoer vendt utover. Løft dekselet med lim ved hjelp av en pinsett med flat spiss (figur 2A-6) og hold den stille på toppen av embryoene, med limsiden vendt mot embryoene i en skrå vinkel på rundt 45 grader.
MERK: Trykk dekselet forsiktig mot gelblokken slik at embryoene kommer i kontakt med limet, og slipp deretter trykket raskt og løft dekselet. Mengden spenning som påføres er kritisk, slik at embryoer kan festes stabilt til limet uten å bli presset for hardt og sprengt. - Pipett 10 μL vann i midten av et nytt glassglass og plasser dekselet med embryoene på toppen av det, med siden av embryoet vendt oppover (figur 2B). Sørg for å bruke vann i stedet for neglelakk eller annet lim for å feste dekselet til glassglasset, da denne siden av dekselet vil bli plassert direkte på toppen av konfokallinsen for levende bildebehandling.
- Tørk embryoene i et uttørkingskammer (figur 2A-3) (se materialfortegnelse) i 10-15 minutter til vitellinmembranen rynker (figur 2E). Den nødvendige tiden kan variere med fuktigheten i rommet og bør testes eksperimentelt for hver laboratorietilstand.
- Pipette 40 μL halokarbonolje (en blanding av type 27 og type 700 i et volumforhold på 1: 1, se materialtabell) i den ene enden av embryostripen. Vipp lysbildet til halokarbonoljen dekker hele overflaten av embryoene.
4. Antistoffinjeksjon og avbildning
- Klargjør noen få kanyler ved hjelp av en mikropipettetrekker (se materialfortegnelsen for parameterinnstillinger) og fyll hver nål med 5 mikroliter AlexaFluor-merket antistoffoppløsning (fra trinn 1.6).
- Plasser et deksel på 25 mm x 25 mm på toppen av et glassglass. Pipett 40 μL halokarbonolje og spred den langs kanten av dekselet.
- Under injeksjonsskopet justerer du spissen av nålen mot kanten av dekslet under olje. Juster innsprøytningslufttrykket til picopumpen (se Materialfortegnelse) slik at en pumpe genererer en boble fylt med antistoffer. Boblediameteren bør begrenses til 20-50 μm (figur 2F).
- Bytt ut det tomme glassglasset med et som inneholder embryoer under olje. Juster kanylespissen vinkelrett mot embryoets fremre-bakre akse (figur 2D,G).
- Kontroller embryostadiet for å sikre at de fleste har startet cellularisering, men ennå ikke har startet gastrulering (stadium 4 og stadium 5), og forblir som et syncytium (figur 2F,G).
MERK: Kjennetegnet på dette stadiet er fraværet av spor eller folder og tilstedeværelsen av en ovalformet, mørkfarget eggeplommesekk synlig i midten av embryoet. Morfologisk karakterisering av embryostadiet under olje er basert på bokkapittelet "Stages of Drosophila Embryogenesis" av Volker Hartenstein17. - Bruk X-Y scenemanipulatoren til å flytte embryoer mot nålen til spissen kommer til midten av eggeplommen. Pump to til tre ganger for å injisere antistoffer i eggeplommen. Vellykket injeksjon indikeres ved rask forsvinning av vitellinemembranrynken når embryoer får volum fra antistoffløsningen (figur 2G).
- Bruk X-Y stadium manipulatoren til å flytte embryoer bort fra nålen etter injeksjon og flytte nedover til neste embryo. Gjenta trinn 6 til alle embryoene på lysbildet er injisert.
- Overfør glassglasset med injiserte embryoer til et fuktighetskammer (figur 2A-8). Inkuber ved 25 °C til ønsket stadium av embryoutvikling er oppnådd.
- Løft dekselet på 24 mm x 50 mm av glassglasset og plasser det direkte i glideholderen på mikroskopet. Siden uten embryoer vil møte målene. Finn embryoene ved hjelp av en lavforstørrelseslinse under lys feltbelysning og bytt til en 40x eller 63x linse for høyoppløselig fluorescerende levende bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere fordelene ved antistoffinjeksjonsmetoden over fluorescent-tag-basert levende bildebehandling eller immunfluorescens, er det gitt to casestudier som karakteriserer den dynamiske lokaliseringen av en transmembranreseptor med lav overflod, Notch, og en type posttranslasjonell modifikasjon kalt tyrosinfosforylering i levende embryoer.
Hakksignaleringsaktivitet spiller en viktig rolle i bestemmelse av celleskjebne under embryogenese og voksen organhomeostase18,19. Ved aktivering av ligandene Delta / Jagged20, spaltes det intracellulære domenet til transmembranreseptoren Notch og frigjøres i kjernen21, og starter nedstrøms transkripsjonsprogrammer for å drive celleskjebneendringer22. Den statiske lokaliseringen av Notch-reseptoren har blitt godt karakterisert ved immunfluorescens i formaldehydfikserte vev. Imidlertid forblir den dynamiske lokaliseringen av Notch under ligandbinding eller den intracellulære spaltningsprosessen stort sett ukjent23, på grunn av mangelen på en metode for levende avbildning av dette relativt lave overflodsproteinet på en høyhastighets måte. Her injiserte vi AlexaFluor-konjugert GFP-nanokropp i embryoer som uttrykker GFP-merket Notch fra det endogene locus20. Uten injeksjon er Notch-GFP knapt detekterbart under standard levende bildeforhold, og det fluorescerende signalet bleker raskt under time-lapse-avbildning. Etter injeksjon forbedres signal-støy-forholdet til Notch-reseptoren betydelig, sammenlignbart med signalkvaliteten til immunfluorescens (figur 3A). Videre tillater antistoffinjeksjon tidsmessig karakterisering av Notch-lokalisering med 45 s intervaller, uten et tilsynelatende tap av signalintensitet over et 5 minutters bildevindu (figur 3B).
Tyrosinfosforylering er en viktig type posttranslasjonell proteinmodifisering som medierer signaltransduksjon i mange biologiske veier24. Svært spesifikke monoklonale antistoffer (som PY20 og 4G10) mot fosfotyrosin (p-Tyr) er utviklet for å karakterisere lokaliseringen og nivåene av total tyrosinfosforylering ved bruk av immunfluorescens og vestlige blotter25. Selv om ingen fluorescerende koder kan spore fosforyleringsendringer, må vev eller celler fikseres og farges eller lyseres og blottes på forskjellige tidspunkter for å gi øyeblikksbilder av fosforyleringsstatusen over tid, for å studere kinetikken til tyrosinfosforylering ved signalaktivering26 (f.eks. vekstfaktorbehandling). Tidsintervallet for denne tilnærmingen er minst noen få minutter lang og iboende unøyaktig på grunn av den variable tiden som kreves for prosedyrer som fiksering eller cellelyse.
Her presenteres bevis for at antistoffinjeksjonsmetoden muliggjør direkte visualisering av fosforyleringsstatusen i levende embryoer, sporing av lokalisering og intensitetsendringer av tyrosinfosforylering ved regelmessige tidsintervaller på sekundernivå. AlexaFluor-konjugert PY20-antistoff ble injisert i embryoer som uttrykker GFP-merket myosin-lyskjede og utførte tofarget levende avbildning med 45 s intervaller. Som tidligere vist er tyrosinfosforylering sterkt anriket ved tricellulære veikryss27, et mønster som også rekapituleres ved immunfluorescens (figur 4A). Interessant nok avslørte live bildebehandling også en ny, andre populasjon av p-Tyr-signal under midten av den apikale membranen, som ikke observeres ved bruk av immunfluorescens (figur 4B). Gjennom tofarget avbildning ble det funnet at denne populasjonen av p-Tyr-signal er i nærheten av mediale myosin (figur 4B, nærbilder), en underpopulasjon av myosin28 som på samme måte bare uttales under levende bildeforhold, men knapt detekterbar ved bruk av immunfluorescens. I tillegg viser den mediale populasjonen av p-Tyr lignende pulsatil koalescens og dissipasjonsmønstre (figur 4C), som tidligere vist for mediale myosin28. Identiteten og funksjonen til en medial underpopulasjon av p-Tyr er fortsatt ukjent. Sammen viser disse resultatene at antistoffinjeksjonsmetoden i stor grad kan utfylle tradisjonelle tilnærminger for å karakterisere atferd av proteiner med lav overflod og avsløre nye lokaliseringsmønstre som kan ha blitt forstyrret under immunfluorescensprosessen.
Figur 1: Arbeidsflyt for antistoffinjeksjon. Skjematisk arbeidsflyt som illustrerer trinnene som er involvert i antistoffinjeksjonsmetoden. Hele prosessen, fra embryoinnsamling til antistoffinjeksjon, tar vanligvis rundt 4-5 timer å fullføre. Etter antistoffinjeksjon kan embryoer inkuberes i et fuktighetskammer til ønsket utviklingsstadium før levende avbildning. AEL, etter egglegging; RT, romtemperatur; Ab, antistoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Embryojustering og injeksjon. (A) Oversikt over hva som kreves før injeksjon, inkludert en dekklapp, glassslide, uttørkingsboks, pensel, pinsett, cellesil, fuktighetskammer og agarosegel. (B) Justerte embryoer festet til heptanlim i midten av dekselet og plassert på toppen av uttørkingsperler. (C) Justering av embryoets fremre-bakre akse parallelt med kanten av agarosegelen. (D) Oversikt over injeksjonsoppsettet. (E) Sammenligning av embryomorfologi før og etter uttørkingsprosessen, med fokus på rynke av vitellinmembranen etter uttørking. (F) Størrelsen på injeksjonsboblen etter et enkelt trykk på picopumpen. (G) Sammenligning av embryomorfologi før og etter antistoffinjeksjon, som fremhever at membranrynker forsvinner etter injeksjon. (E-G) ble fanget under en 10x forstørrelse objektivlinse ved hjelp av lysfeltmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Levende avbildning av Notch-reseptor i tidlige embryoer. (A) Lokalisering av endogent GFP-merket Notch-reseptor gjennom immunfluorescens (venstre), direkte levende avbildning basert på GFP-autofluorescens (midten) og AlexaFluor 594-konjugert GFP nanokroppsinjeksjon (høyre). (B) Dynamisk lokalisering av Notch-GFP avbildet med 45 s intervaller etter antistoffinjeksjon. Alle bildene ble tatt med fremre embryo til venstre og ventralsiden vendt ned. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Levende avbildning av embryonale fosfotyrosinmønstre. (A) Lokalisering av fosforylert tyrosin (p-Tyr) i faste embryoer gjennom immunfluorescens. (B) Lokalisering av p-Tyr (magenta) i levende embryoer som uttrykker GFP-merket myosin lettkjede (grønn). Den hvite stiplede boksen indikerer nærbilder av den mediale populasjonen av fosfotyrosin og myosin under den apikale membranen. Skalastenger = 10 μm. (C) Lokalisering av p-tyr og GFP-myosin avbildet hver 45. s i levende embryoer. Hvite piler indikerer den mediale populasjonen av p-Tyr og myosin. Alle bildene ble tatt med fremre av embryoene til venstre og ventralsiden vendt ned. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne presenterte prosedyren skisserer den spesialiserte metoden for fluorescensmerking med tilpassede antistoffer og påfølgende injeksjon i Drosophila-embryoer i tidlig stadium. Denne teknikken muliggjør sanntidsvisualisering av proteiner eller posttranslasjonelle modifikasjoner som eksisterer i lave mengder og er vanligvis vanskelige å observere gjennom konvensjonelle GFP / mCherry-merkingsmetoder.
Forsiktighet bør utvises ved utvidelse av denne metoden for å gjøre kvantitative sammenligninger mellom villtype og muterte embryoer. Mens konsentrasjonen av primære og sekundære antistoffer kan holdes den samme mellom kontroll- og eksperimentelle grupper i immunfluorescens, kan mengden antistoff injisert og merkingseffektiviteten variere mellom embryoer. Derfor bør kvantitativ analyse begrenses til å spore fluorescerende intensitetsendringer over tid eller utføre korrelasjonsanalyse med signaler fra andre kanaler i samme embryo når du utfører flerfarget levende bildebehandling. For eksempel kan kolokalisering og korrelasjonsanalyse utføres ved bruk av p-Tyr og myosinintensiteter27, mens p-Tyr-intensiteter ikke kan sammenlignes direkte mellom villtype og gen-X knockdownembryoer ved hjelp av antistoffinjeksjonsmetoden.
I likhet med andre fluorescerende tag-baserte tilnærminger for å undersøke proteindynamikk, kan antistoffbinding potensielt endre aktiviteten, trafikken eller lokaliseringen av målproteiner. Derfor foretrekkes monoklonale antistoffer eller nanolegemer fremfor polyklonale antistoffer til injeksjon. Fordi epitoper av monoklonale antistoffer eller nanolegemer er veldefinerte, om blokkering av disse epitoper med antistoffer endrer proteinaktiviteten, kan modelleres basert på alfa-foldstrukturer12,25. På den annen side er epitoper av polyklonale antistoffer ikke nøyaktig avgrenset, og deres binding kan potensielt endre proteinlokalisering eller aktivitet hvis katalytiske lommer eller signalpeptider av målproteiner er blokkert. For det andre kan antistoffer gjenkjenne andre uspesifikke epitoper enn målproteiner, spesielt med tanke på at det ikke er noen "utvaskingstrinn" her, som ved immunfluorescens, for å fjerne ikke-spesifikke bindinger med lavere affinitet. Derfor er det viktig å ha kontrollgrupper, for eksempel å injisere antistoffer i celler som mangler epitopen, for å verifisere om det observerte signalet virkelig gjenspeiler målproteinene eller andre uspesifikke epitoper.
Injeksjon av antistoffer er ikke forskjellig fra å injisere siRNA eller CRISPR gRNA når det gjelder eksperimentelt oppsett. De fleste cellulære systemer som kan injiseres, bør derfor være kompatible med antistoffinjeksjonsmetoden. I Drosophila-embryoer er Alexa Fluor-konjugerte antistoffer stabile under utvikling, og fluorescerende signaler forblir detekterbare etter timer med embryogenese. For andre systemer som Xenopus- eller sebrafiskembryoer, bør konsentrasjonen og injeksjonsvolumet av antistoffer testes empirisk gjennom serielle fortynninger for å oppnå ideell merkingseffektivitet. I tillegg kan alternative fluorescerende fargestoffer som ATTO10 potensielt tilby et bedre signal-støy-forhold og vannløselighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Jennifer A. Zallen for å gi Sqh-GFP Drosophila-linjen og støtte til den første utviklingen av denne teknikken, og Dr. Francois Schweisguth for å gi Notch-GFP Drosophila-linjen . Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Natural Science Foundation of China (32270809) til HH Yu, sjenerøs økonomisk og personalstøtte fra School of Life Sciences, SUSTech, og finansiering til Y. Yan fra Shenzhen Science and Technology Innovation Commission / JCYJ20200109140201722.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
- Coons, A. H.
- Arthur, G., et al.
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H.
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S.
- Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P.
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
