Summary
Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.
Abstract
GFP (Yeşil Floresan Protein) ve diğer floresan etiketler kullanılarak canlı hücrelerdeki proteinlerin görselleştirilmesi, protein lokalizasyonu, dinamikleri ve işlevinin anlaşılmasını büyük ölçüde geliştirmiştir. İmmünofloresan ile karşılaştırıldığında, canlı görüntüleme, doku fiksasyonundan kaynaklanan potansiyel artefaktlar olmadan protein lokalizasyonunu daha doğru bir şekilde yansıtır. Daha da önemlisi, canlı görüntüleme, hücre hareketi veya bölünmesi gibi dinamik biyolojik süreçleri anlamak için çok önemli olan protein seviyelerinin ve lokalizasyonunun nicel ve zamansal karakterizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, floresan etiketleme yaklaşımlarının önemli bir sınırlaması, başarılı görselleştirme elde etmek için yeterince yüksek protein ekspresyon seviyelerine duyulan ihtiyaçtır. Sonuç olarak, nispeten düşük ekspresyon seviyelerine sahip birçok endojen etiketli floresan proteini tespit edilemez. Öte yandan, viral promotörler kullanılarak ektopik ekspresyon bazen fizyolojik bağlamlarda protein yanlış lokalizasyonuna veya fonksiyonel değişikliklere yol açabilir. Bu sınırlamaları ele almak için, canlı embriyolarda oldukça hassas antikor aracılı protein tespitini kullanan, esasen doku fiksasyonuna gerek kalmadan immünofloresan gerçekleştiren bir yaklaşım sunulmaktadır. Prensip kanıtı olarak, canlı embriyolarda zar zor tespit edilebilen endojen GFP etiketli Notch reseptörü, antikor enjeksiyonundan sonra başarılı bir şekilde görselleştirilebilir. Ayrıca, bu yaklaşım, canlı embriyolarda translasyon sonrası modifikasyonları (PTM'ler) görselleştirmek için uyarlandı, erken embriyogenez sırasında tirozin fosforilasyon modellerindeki zamansal değişikliklerin saptanmasına izin verdi ve apikal membranların altında yeni bir fosfotirozin (p-Tyr) alt popülasyonunu ortaya çıkardı. Bu yaklaşım, diğer proteine özgü, etikete özgü veya PTM'ye özgü antikorları barındıracak şekilde değiştirilebilir ve diğer enjeksiyona uygun model organizmalar veya hücre dizileri ile uyumlu olmalıdır. Bu protokol, daha önce geleneksel floresan etiketleme yöntemleri kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya PTM'lerin canlı görüntülenmesi için yeni olanaklar sunar.
Introduction
İmmünofloresan, orijinal olarak Albert Coons tarafından geliştirilen, moleküllerin doğal hücresel bölmelerinde saptanmasını ve hücre altı organellerin veya makinelerin moleküler bileşimlerinin karakterizasyonunu sağlayan modern hücre biyolojisinin temel taşı tekniğidir1. Genetik manipülasyonlarla birleştiğinde, immünofloresan, protein lokalizasyonunun işlevi için gerekli olduğu konusunda artık iyi kabul edilen kavramın oluşturulmasına yardımcı olur2. Spesifik primer antikorlar ve parlak floresan boyaların yanı sıra, bu tekniğin başarısı, hücresel morfolojileri koruyan, antijenleri hareketsiz hale getiren ve antikorların hücre içi bölmelere erişilebilirliğini artıran fiksasyon ve geçirgenleştirme adı verilen bir ön işleme dayanır. Kaçınılmaz olarak, fiksasyon ve geçirgenleştirme süreci hücreleri öldürecek ve tüm biyolojik süreçleri sonlandıracaktır3. Bu nedenle, immünofloresan sadece proteinlerin yaşam yolculuğunun anlık görüntülerini sağlar. Bununla birlikte, hücre göçü ve bölünmeleri gibi birçok biyolojik süreç, doğası gereği dinamiktir ve protein davranışlarının mekansal-zamansal olarak çözülmüş bir şekilde araştırılmasını gerektirir 4,5.
Canlı organizmalardaki protein dinamiklerini incelemek için, yeşil floresan proteini (GFP)6 gibi genetik olarak kodlanmış floresan proteinlere ve yüksek hızlı konfokal mikroskoplara dayalı canlı görüntüleme yöntemleri geliştirilmiştir. Kısaca, ilgilenilen protein, GFP7 ile kaynaştırılmak üzere genetik olarak manipüle edilebilir ve daha sonra sitomegalovirüs (CMV)8 veya yukarı akış aktivasyon dizisi (UAS)9 gibi viral veya maya promotörlerinden ektopik olarak eksprese edilebilir. GFP doğası gereği otofloresan olduğundan, hedef proteinlerin lokalizasyonunu ortaya çıkarmak için florofora bağlı antikorlara gerek yoktur, bu da fiksasyon veya geçirgenleştirme ön işlemlerinin gerekliliğini atlar. Son yirmi yılda, dalga boyunun tüm spektrumunu kapsayan floresan etiketlergeliştirildi 10 ve aynı anda birkaç hedef proteinin çok renkli canlı görüntülenmesini sağladı. Bununla birlikte, AlexaFluor veya ATTO gibi kimyasal olarak tasarlanmış floresan boyalarla karşılaştırıldığında, bu genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin otofloresansı, özellikle daha uzun zaman ölçeklerinde canlı görüntüleme sırasında, endojen promotörlerden eksprese edildiğinde nispeten zayıf ve kararsızdır10. Bu eksiklik, floresan etiketli hedef proteinlerin aşırı eksprese edilmesiyle hafifletilebilirken, kinazlar ve fosfatazlar gibi enzimatik aktivitelere sahip birçoğu, fizyolojik seviyelerde eksprese edilmezse normal biyolojik süreçleri ciddi şekilde bozar.
Bu protokol, canlı bir görüntü kurulumunda fotostabil antikor tabanlı hedef aydınlatmayı mümkün kılan, esasen fiksasyon veya geçirgenleştirme işlemi olmadan immünofloresansa izin veren bir yöntem sunar (Şekil 1). Basit bir NHS bazlı birincil amin reaksiyonu11 yoluyla, AlexaFluor 488 veya 594 gibi floresan boyalar, esasen herhangi bir birincil antikor veya GFP / HA / Myc nanokor12 ile konjuge edilebilir. Tüm Drosophila embriyonik hücrelerinin sinsityum evre13 sırasında ortak bir sitoplazmayı paylaştığı gelişimsel bir özellikten yararlanarak, boya konjuge antikorların enjeksiyonundan sonra tüm embriyolar boyunca antijen bağlanması ve aydınlanması sağlanabilir. Drosophila ve diğer model sistemlerde14 bulunan endojen olarak etiketlenmiş proteinlerin genişleyen kütüphaneleri ile bu yöntem, canlı dokulardaki düşük bollukta floresan etiketli proteinlerin ve diğer floresan etiketli olmayan (HA / Myc etiketli) proteinlerin dinamiklerini ortaya çıkararak bu kütüphanelerin uygulamalarını potansiyel olarak genişletebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler, SUSTech Üniversitesi Yaşam Bilimleri Okulu'nun yönergelerine ve onayına uygun olarak gerçekleştirildi. Kullanılan organizma Drosophila melanogaster'dir ve genotipler, sırasıyla Dr. Francois Schweisguth (Pasteur Enstitüsü) ve Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Enstitüsü) laboratuvarları tarafından cömertçe sağlanan Notch-Knockin-GFP (Kromozom X) ve Sqh-sqh-GFP'dir (Kromozom II). Bu protokol esas olarak antikor etiketleme ve canlı görüntüleme yönlerine odaklanırken, Drosophila embriyo toplama ve enjeksiyonu15,16 hakkında daha ayrıntılı açıklamalar için lütfen yayınlanmış raporlara bakın.
1. Antikorların floresan etiketlenmesi
- Tercihen, ilgilenilen protein için monoklonal antikorlar veya nanokorlar kullanın. Antikorların stok konsantrasyonunu 1 mg / mL veya daha yüksek bir sıcaklıkta hazırlayın.
NOT: Bu çalışmada örnek olarak GFP nanobody (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. Ticari olarak temin edilebilen GFP nano gövdesi, 1.0 mg / mL'lik bir konsantrasyonda ve 250 μL'lik bir hacimde paketlenir. Ek olarak, Alexa Fluor 594'ü bir süksinimidil ester reaksiyonu11 yoluyla proteinlerin birincil aminlerine konjuge eden, ticari olarak temin edilebilen bir antikor etiketleme kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılır. Daha da önemlisi, bu etiketleme işlemi antikor konsantrasyonunu önemli ölçüde değiştirmez. - Bileşen B'yi (antikor etiketleme kitinde sağlanır) 1 mL deiyonize su içinde yeniden süspanse ederek 1 M sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın.
- Antikor konsantrasyonunu 1.0 mg / mL'ye ayarlayın, ardından 1 M sodyum bikarbonat çözeltisinin 1/10'uncu hacmini (100 μL GFP nanobody için 10 μL) ekleyin.
- 110 μL antikor karışımını (adım 1.3'ten itibaren) doğrudan Alexa Fluor 594 boyası içeren tüpe ekleyin. Karıştırmak için ters çevirin (girdap yapmayın) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
- Saflaştırma kolonunu konjugasyon kitinden monte edin (Malzeme Tablosuna bakın). 1.5 mL'lik bir reçine yatağı hazırlayın (antikor etiketleme kitinde sağlanır) ve reçineden fazla sıvıyı çıkarmak için kolonu oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 1100 x g'de santrifüjleyin.
- Reaksiyon karışımını (adım 1.4'ten itibaren) reçine kolonunun üstüne damla damla ekleyin ve etiketli antikoru toplamak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1100 x g'de santrifüjleyin. Toplanan antikor pembe renkte görünmeli ve hacim 100 μL'den biraz daha az olmalıdır. Folyoya sarılı veya koyu renkli tüplerde 4 °C'de saklayın.
2. Drosophila embriyolarının hazırlanması
- 200 yeni yumurtadan çıkmış yetişkin Drosophila'yı erkek-dişi oranı 1: 10 olan plastik silindir şeklindeki bir kafese (çap = 5 cm, yükseklik = 8 cm) yerleştirin. Bir tarafı havalandırma için gözenekli metal ağ ile ve diğer tarafı meyve suyu/maya ezmesi agar plakası ile kapatın.
- Embriyo toplamadan önce üç gün boyunca her 12 saatte bir plakayı değiştirin. Bu, Drosophila yumurtlamasının senkronizasyonunu sağlar ve toplama verimliliğini artırır.
- Enjeksiyon gününde, kafesi minimum maya macunu içeren bir meyve suyu tabağına değiştirin ve embriyoları 1 saat boyunca 25 ° C'de toplayın. İlk toplama turu yeterli embriyo (<50 embriyo) vermezse, ilk plakayı atın ve 1 saat içinde 100'den fazla embriyo bırakılana kadar ikinci bir toplama turu için bu adımı tekrarlayın.
- Yumurtlamayı durdurmak için plakayı kafesten çıkarın ve 2-3 saatlik embriyolar elde etmek için 25 ° C'de 2 saat daha inkübe edin. Embriyoların doğru evresi, antikor enjeksiyonunun başarısı için kritik öneme sahiptir.
- Embriyoların yumurta kabuğunu çıkarmak için, meyve suyu tabağına 2 mL% 50 çamaşır suyu ekleyin ve bir boya fırçası kullanarak embriyoları plakadan nazikçe çıkarın (Şekil 2A-4). Genellikle, embriyolar doğrudan maya macununun üzerine serilir. Bu durumda, tüm embriyoları toplamak için maya macununu ağartma çözeltisine fırçalamak kabul edilebilir.
- Yüzen embriyoları %50 ağartıcıda 2 dakika inkübe edin ve yumurta kabuğu çıkarma verimliliğini artırmak için meyve suyu tabağını her 30 saniyede bir döndürün.
- Embriyo/ağartıcı karışımını 70 μm'lik bir naylon hücre süzgecine dökerek aktarın (Şekil 2A-7). Kalan ağartıcı ve maya macununu çıkarmak için embriyoları bir su şişesi kullanarak iyice yıkayın. Hücre süzgecini kağıt havluyla tamamen kurulayın ve embriyoların etrafındaki fazla suyun atıldığından emin olun.
3. Embriyo hizalaması ve kuruma
- 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (genişlik, uzunluk, yükseklik) %4 agaroz jel hazırlayın (Şekil 2A-9) ve jelin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Temiz bir tıraş bıçağı kullanarak 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (genişlik, uzunluk, yükseklik) agaroz bloğu kesin ve bloğu bir cam slayt üzerine yerleştirin (Şekil 2A-2). Kenarların düz kesildiğinden ve yüzeyin düz ve kuru olduğundan emin olmak için diseksiyon kapsamının altındaki jel bloğunu inceleyin.
- Embriyoları süzgeçten bir boya fırçası kullanarak jel bloğuna aktarın. Embriyoları hafifçe fırçalayarak bloğun orta hattı boyunca eşit şekilde yayın. İdeal olarak, embriyo kümeleri birbirine dokunmadan tekli veya çiftli olarak ayrılır.
- Tek bir ince uç oluşturmak için iki bacağı birbirine sıkıca bantlanmış bir cımbız hazırlayın (Şekil 2A-5). Bir diseksiyon kapsamı altında, cımbız kullanarak tek tek embriyoları alın ve jel bloğunun uzun kenarı boyunca yerleştirin. 20-30 embriyoyu hizalayın, ön-arka eksenlerinin kenara paralel olduğundan emin olun (Şekil 2C).
- 24 mm x 50 mm'lik bir lamellerin ortasına 10 μL heptan yapıştırıcı (Malzeme Tablosuna bakın) pipetleyin (Şekil 2A-1) ve yapıştırıcıyı bir pipet ucu kullanarak 0,5 cm x 3 cm dikdörtgen bir alana yayın. Kullanmadan önce tutkalın tamamen kurumasını bekleyin.
- Jel bloklu cam slaytı, embriyolar dışa bakacak şekilde masanın kenarına yerleştirin. Düz uçlu bir cımbız kullanarak lamel yapıştırıcı ile kaldırın (Şekil 2A-6) ve tutkal tarafı yaklaşık 45 derecelik eğimli bir açıyla embriyolara bakacak şekilde embriyoların üzerinde sabit tutun.
NOT: Embriyoların yapıştırıcı ile temas etmesi için lamel jel bloğa hafifçe bastırın ve ardından basıncı hızla serbest bırakın ve lamel kaldırın. Uygulanan gerilim miktarı, embriyoların çok sert bastırılmadan ve patlamadan yapıştırıcıya stabil bir şekilde bağlanabilmesi için kritiktir. - Yeni bir cam lamın ortasına 10 μL su pipetleyin ve lamel embriyonun tarafı yukarı bakacak şekilde embriyoların üzerine yerleştirilmelidir (Şekil 2B). Lameli cam kızağa yapıştırmak için oje veya başka bir yapışkan yapıştırıcı yerine su kullandığınızdan emin olun, çünkü lamellerin bu tarafı canlı görüntüleme için doğrudan konfokal lensin üzerine yerleştirilecektir.
- Embriyoları bir kurutma odasında (Şekil 2A-3) (Malzeme Tablosuna bakınız) vitellin zarı kırışana kadar 10-15 dakika kurutun (Şekil 2E). Gerekli süre odanın nemine göre değişebilir ve her laboratuvar koşulu için deneysel olarak test edilmelidir.
- Embriyo şeridinin bir ucuna 40 μL halokarbon yağı (hacim olarak 1: 1 oranında tip 27 ve tip 700 karışımı, Malzeme Tablosuna bakınız) pipetleyin. Halokarbon yağı embriyoların tüm yüzeyini kaplayana kadar slaydı eğin.
4. Antikor Enjeksiyonu ve görüntüleme
- Bir mikropipet çektirmesi kullanarak birkaç enjeksiyon cam iğnesi hazırlayın (parametre ayarları için Malzeme Tablosuna bakın) ve her iğneyi 5 μL AlexaFluor etiketli antikor çözeltisi ile yükleyin (adım 1.6'dan itibaren).
- Bir cam kızağın üzerine 25 mm x 25 mm'lik bir lamel yerleştirin. 40 μL halokarbon yağı pipetleyin ve lamel kenarı boyunca yayın.
- Enjeksiyon dürbünü altında, iğnenin ucunu yağ altındaki lamel kenarına hizalayın. Pikopompanın enjeksiyon hava basıncını ayarlayın (Malzeme Tablosuna bakın), böylece bir pompa antikorlarla dolu bir kabarcık oluşturur. Kabarcık çapı 20-50 μm ile sınırlandırılmalıdır (Şekil 2F).
- Boş cam slaytı, yağ altında embriyo içeren bir slaytla değiştirin. Enjeksiyon iğnesinin ucunu embriyoların ön-arka eksenine dik olarak hizalayın (Şekil 2D,G).
- Embriyoların çoğunun hücreselleşmeyi başlattığından ancak henüz gastrulasyona başlamadığından (evre 4 ve evre 5) ve sinsityum olarak kaldığından emin olmak için embriyoların evresini kontrol edin (Şekil 2F,G).
NOT: Bu aşamanın ayırt edici özelliği, herhangi bir oluk veya kıvrımın olmaması ve embriyonun merkezinde görülebilen oval şekilli, koyu renkli bir yolk kesesinin varlığıdır. Yağ altındaki embriyo aşamasının morfolojik karakterizasyonu, Volker Hartenstein17'nin "Drosophila Embriyogenezinin Aşamaları" kitap bölümüne dayanmaktadır. - Uç yumurta sarısının ortasına gelene kadar embriyoları iğneye doğru hareket ettirmek için XY aşaması manipülatörünü kullanın. Antikorları yumurta sarısına enjekte etmek için iki ila üç kez pompalayın. Başarılı enjeksiyon, embriyolar antikor çözeltisinden hacim kazandıkça vitellin membran kırışıklığının hızla kaybolmasıyla gösterilir (Şekil 2G).
- Enjeksiyondan sonra embriyoları iğneden uzaklaştırmak ve bir sonraki embriyoya doğru hareket etmek için XY aşaması manipülatörünü kullanın. Slayttaki tüm embriyolar enjekte edilene kadar 6. adımı tekrarlayın.
- Enjekte edilen embriyoların bulunduğu cam lamı bir nem odasına aktarın (Şekil 2A-8). İstenilen embriyo gelişim aşamasına ulaşılana kadar 25 °C'de inkübe edin.
- 24 mm x 50 mm'lik lamel cam slayttan kaldırın ve doğrudan mikroskobun lamel tutucusuna yerleştirin. Embriyosu olmayan taraf hedeflere dönük olacaktır. Parlak alan aydınlatması altında düşük büyütmeli bir lens kullanarak embriyoları bulun ve yüksek çözünürlüklü floresan canlı görüntüleme için 40x veya 63x lense geçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antikor enjeksiyon yönteminin floresan etiket tabanlı canlı görüntüleme veya immünofloresan üzerindeki avantajlarını göstermek için, düşük bollukta bir transmembran reseptörünün, Notch'un dinamik lokalizasyonunu ve canlı embriyolarda tirozin fosforilasyonu adı verilen bir tür translasyonel modifikasyonu karakterize eden iki vaka çalışması sağlanmıştır.
Çentik sinyal aktivitesi, embriyogenez ve yetişkin organ homeostazı sırasında hücre kaderinin belirlenmesinde önemli bir rol oynar 18,19. Ligandları Delta/Jagged20 tarafından aktive edildikten sonra, transmembran reseptörü Notch'un hücre içi alanı bölünür ve çekirdeğe21 salınır ve hücre kaderi değişikliklerini yönlendirmek için aşağı akış transkripsiyonel programları başlatılır22. Notch reseptörünün statik lokalizasyonu, formaldehitle sabitlenmiş dokularda immünofloresan ile iyi karakterize edilmiştir. Bununla birlikte, ligand bağlanması veya hücre içi bölünme işlemi sırasında Notch'un dinamik lokalizasyonu, bu nispeten düşük bolluktaki proteini yüksek hızlı bir şekilde canlı görüntüleme için bir yöntemin olmaması nedeniyle büyük ölçüde bilinmemektedir23. Burada, endojen lokus20'den GFP etiketli Notch'u eksprese eden embriyolara AlexaFluor konjuge GFP nanobody enjekte ettik. Enjeksiyon olmadan, Notch-GFP standart canlı görüntüleme koşulları altında zar zor tespit edilebilir ve floresan sinyali, hızlandırılmış görüntüleme sırasında hızla ağarır. Enjeksiyondan sonra, Notch reseptörünün sinyal-gürültü oranı, immünofloresanın sinyal kalitesiyle karşılaştırılabilir şekilde önemli ölçüde iyileşir (Şekil 3A). Ayrıca, antikor enjeksiyonu, 5 dakikalık bir görüntüleme penceresi boyunca belirgin bir sinyal yoğunluğu kaybı olmadan, 45 s aralıklarla Notch lokalizasyonunun zamansal karakterizasyonuna izin verir (Şekil 3B).
Tirozin fosforilasyonu, birçok biyolojik yolda sinyal iletimine aracılık eden önemli bir translasyon sonrası protein modifikasyonu türüdür24. Fosfotirozine (p-Tyr) karşı oldukça spesifik monoklonal antikorlar (PY20 ve 4G10 gibi), immünofloresan ve western blots25 kullanılarak genel tirozin fosforilasyonunun lokalizasyonunu ve seviyelerini karakterize etmek için geliştirilmiştir. Hiçbir floresan etiketi fosforilasyon değişikliklerini izleyemese de, sinyal aktivasyonu26 üzerine tirozin fosforilasyonunun kinetiğini incelemek için zaman içindeki fosforilasyon durumunun anlık görüntülerini sağlamak için dokuların veya hücrelerin farklı zaman noktalarında sabitlenmesi ve boyanması veya parçalanması ve lekelenmesi gerekir (örneğin, büyüme faktörü tedavisi). Bu yaklaşımın zaman aralığı en az birkaç dakika uzunluğundadır ve fiksasyon veya hücre lizisi gibi prosedürler için gereken değişken süre nedeniyle doğal olarak yanlıştır.
Burada, antikor enjeksiyon yönteminin, canlı embriyolarda fosforilasyon durumunun doğrudan görselleştirilmesini sağladığına, tirozin fosforilasyonunun lokalizasyonunu ve yoğunluk değişikliklerini düzenli, saniye düzeyinde zaman aralıklarında izlediğine dair kanıtlar sunulmaktadır. AlexaFluor ile konjuge PY20 antikoru, GFP etiketli miyozin hafif zincirini eksprese eden embriyolara enjekte edildi ve 45 saniye aralıklarla çift renkli canlı görüntüleme yapıldı. Daha önce gösterildiği gibi, tirozin fosforilasyonu, immünofloresan ile de özetlenen bir model olan üç hücreli kavşaklarda27 oldukça zenginleştirilmiştir (Şekil 4A). İlginç bir şekilde, canlı görüntüleme, apikal membranın merkezinin altında, immünofloresan kullanılarak gözlenmeyen yeni, ikinci bir p-Tyr sinyali popülasyonunu da ortaya çıkardı (Şekil 4B). Çift renkli görüntüleme yoluyla, bu p-Tyr sinyali popülasyonunun, benzer şekilde sadece canlı görüntüleme koşullarında telaffuz edilen ancak immünofloresan kullanılarak zar zor tespit edilebilen bir miyozin28 alt popülasyonu olan medial miyozine (Şekil 4B, yakın çekimler) yakın olduğu bulundu. Ek olarak, p-Tyr'nin medial popülasyonu, daha önce medial miyozin28 için gösterildiği gibi benzer pulsatil birleşme ve dağılma paternleri sergiler (Şekil 4C). p-Tyr'nin medial bir alt popülasyonunun kimliği ve işlevi hala bilinmemektedir. Birlikte, bu sonuçlar, antikor enjeksiyon yönteminin, düşük bolluktaki proteinlerin davranışlarını karakterize etmek için geleneksel yaklaşımları büyük ölçüde tamamlayabileceğini ve immünofloresan işlemi sırasında bozulmuş olabilecek yeni lokalizasyon modellerini ortaya çıkarabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Antikor enjeksiyonu iş akışı. Antikor enjeksiyon yönteminde yer alan adımları gösteren şematik iş akışı. Embriyo toplamadan antikor enjeksiyonuna kadar tüm sürecin tamamlanması tipik olarak yaklaşık 4-5 saat sürer. Antikor enjeksiyonundan sonra, embriyolar canlı görüntülemeden önce istenen gelişim aşamasına kadar bir nem odasında inkübe edilebilir. AEL, yumurtlamadan sonra; RT, oda sıcaklığı; Ab, antikor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Embriyo hizalaması ve enjeksiyonu. (A) Lamel , cam slayt, kurutma kutusu, boya fırçası, cımbız, hücre süzgeci, nem odası ve agaroz jel dahil olmak üzere enjeksiyondan önce gerekli olan öğelere genel bakış. (B) Lamel ortasındaki heptan yapıştırıcıya tutturulmuş ve kurutma boncuklarının üzerine yerleştirilmiş hizalanmış embriyolar. (C) Embriyoların ön-arka ekseninin agaroz jelin kenarına paralel olarak hizalanması. (D) Enjeksiyon kurulumuna genel bakış. (E) Kurutma işleminden önce ve sonra embriyo morfolojisinin, kurumadan sonra vitellin zarının kırışıklığına odaklanarak karşılaştırılması. (F) Pikopump'a tek bir basıştan sonra enjeksiyon kabarcığının boyutu. (G) Antikor enjeksiyonundan önce ve sonra embriyo morfolojisinin karşılaştırılması, enjeksiyon sonrası membran kırışıklıklarının kaybolmasının vurgulanması. (EG), parlak alan mikroskobu kullanılarak 10x büyütmeli objektif lens altında yakalandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Erken embriyolarda Notch reseptörünün canlı görüntülenmesi. (A) İmmünofloresan (solda), GFP otofloresansına (ortada) dayalı doğrudan canlı görüntüleme ve AlexaFluor 594 konjuge GFP nano gövde enjeksiyonu (sağda) yoluyla endojen GFP etiketli Notch reseptörünün lokalizasyonu. (B) Antikor enjeksiyonundan sonra 45 saniye aralıklarla görüntülenen Notch-GFP'nin dinamik lokalizasyonu. Tüm görüntüler embriyoların ön yüzü solda ve ventral tarafı aşağı bakacak şekilde elde edildi. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Embriyonik fosfotirozin paternlerinin canlı görüntülenmesi. (A) İmmünofloresan yoluyla sabit embriyolarda fosforile tirozinin (p-Tyr) lokalizasyonu. (B) GFP etiketli miyozin hafif zincirini (yeşil) eksprese eden canlı embriyolarda p-Tyr'nin (macenta) lokalizasyonu. Beyaz kesikli kutu, apikal membran altındaki medial fosfotirozin ve miyozin popülasyonunun yakından görünümlerini gösterir. Ölçek çubukları = 10 μm. (C) Canlı embriyolarda her 45 saniyede bir görüntülenen p-Tyr ve GFP-miyozinin lokalizasyonu. Beyaz oklar, p-Tyr ve miyozinin medial popülasyonunu gösterir. Tüm görüntüler, embriyoların ön yüzü sola ve ventral tarafı aşağı bakacak şekilde çekildi. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan bu prosedür, özel antikorlarla özel floresan etiketleme yöntemini ve ardından erken evre Drosophila embriyolarına enjeksiyonu özetlemektedir. Bu teknik, düşük miktarlarda bulunan ve tipik olarak geleneksel GFP/mCherry etiketleme yöntemleriyle gözlemlenmesi zor olan proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların gerçek zamanlı görselleştirilmesini kolaylaştırır.
Yabani tip ve mutant embriyolar arasında kantitatif karşılaştırmalar yapmak için bu yöntemi genişletirken dikkatli olunmalıdır. İmmünofloresanda primer ve sekonder antikorların konsantrasyonu kontrol ve deney grupları arasında aynı tutulabilirken, enjekte edilen antikor miktarı ve etiketleme etkinliği embriyolar arasında değişebilir. Bu nedenle, kantitatif analiz, zaman içindeki floresan yoğunluğu değişikliklerini izlemek veya çok renkli canlı görüntüleme gerçekleştirirken aynı embriyodaki diğer kanalların sinyalleriyle korelasyon analizi yapmakla sınırlı olmalıdır. Örneğin, p-Tyr ve miyozin intensitleri27 kullanılarak kolokalizasyon ve korelasyon analizi yapılabilirken, antikor enjeksiyon yöntemi kullanılarak vahşi tip ve gen-X knockdown embriyoları arasında p-Tyr yoğunlukları doğrudan karşılaştırılamaz.
Protein dinamiklerini incelemek için diğer floresan etiket tabanlı yaklaşımlara benzer şekilde, antikor bağlanması, hedef proteinlerin aktivitesini, kaçakçılığını veya lokalizasyonunu potansiyel olarak değiştirebilir. Bu nedenle, enjeksiyon için poliklonal antikorlar yerine monoklonal antikorlar veya nanokorlar tercih edilir. Monoklonal antikorların veya nanokorların epitopları iyi tanımlandığından, bu epitopların antikorlarla bloke edilmesinin protein aktivitesini değiştirip değiştirmediği alfa-kat yapılarına göre modellenebilir 12,25. Öte yandan, poliklonal antikorların epitopları tam olarak tanımlanmamıştır ve hedef proteinlerin katalitik cepleri veya sinyal peptitleri bloke edilirse, bağlanmaları potansiyel olarak protein lokalizasyonunu veya aktivitesini değiştirebilir. İkincisi, antikorlar, özellikle immünofloresansta olduğu gibi, daha düşük afiniteli spesifik olmayan bağları çıkarmak için burada "yıkama" adımları olmadığı göz önüne alındığında, hedef proteinler dışındaki spesifik olmayan epitopları tanıyabilir. Bu nedenle, gözlemlenen sinyalin hedef proteinleri veya diğer spesifik olmayan epitopları gerçekten yansıtıp yansıtmadığını doğrulamak için epitopu olmayan hücrelere antikor enjekte etmek gibi kontrol gruplarına sahip olmak önemlidir.
Antikor enjeksiyonu, deney düzeneği açısından siRNA veya CRISPR gRNA'ların enjekte edilmesinden farklı değildir. Bu nedenle, enjeksiyonlara uygun çoğu hücresel sistem, antikor enjeksiyon yöntemiyle uyumlu olmalıdır. Drosophila embriyolarında, Alexa Fluor konjuge antikorları gelişim sırasında stabildir ve floresan sinyaller embriyogenezden saatler sonra tespit edilebilir kalır. Xenopus veya Zebra balığı embriyoları gibi diğer sistemler için, ideal etiketleme verimliliğini elde etmek için antikorların konsantrasyonu ve enjeksiyon hacmi, seri seyreltmeler yoluyla ampirik olarak test edilmelidir. Ek olarak, ATTO10 gibi alternatif floresan boyalar potansiyel olarak daha iyi bir sinyal-gürültü oranı ve suda çözünürlük sunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Dr. Jennifer A. Zallen'e Sqh-GFP Drosophila serisini sağladığı ve bu tekniğin ilk gelişimine destek verdiği için ve Dr. Francois Schweisguth'a Notch-GFP Drosophila serisini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (32270809) H.H.Yu'ya, Yaşam Bilimleri Okulu, SUSTech'ten cömert mali ve personel desteği ve Shenzhen Bilim ve Teknoloji İnovasyon Komisyonu/JCYJ20200109140201722'dan Y. Yan'a sağlanan finansmanla desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
- Coons, A. H.
- Arthur, G., et al.
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H.
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S.
- Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P.
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
