Summary
يصف هذا البروتوكول منصة زراعة الخلايا القائمة على الغشاء القابلة لإعادة التكوين والتي تدمج تنسيق البئر المفتوح مع قدرات تدفق السوائل. تتوافق هذه المنصة مع البروتوكولات القياسية وتسمح بالانتقال القابل للانعكاس بين أوضاع زراعة البئر المفتوحة والمستنبتات الدقيقة ، مما يلبي احتياجات كل من مختبرات الهندسة والعلوم البيولوجية.
Abstract
الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة هي منصات مصغرة لزراعة الخلايا تستخدم لتقليد بنية ووظيفة الأنسجة البشرية في بيئة المختبر. ومع ذلك ، لم تكتسب هذه المنصات اعتمادا واسع النطاق في مختبرات العلوم البيولوجية حيث تعمل الأساليب القائمة على الأغشية المفتوحة كمعيار ذهبي لمحاكاة حواجز الأنسجة ، على الرغم من افتقارها إلى قدرات تدفق السوائل. يمكن أن تعزى هذه المشكلة في المقام الأول إلى عدم توافق الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة الحالية مع البروتوكولات والأدوات القياسية المطورة لأنظمة الآبار المفتوحة.
هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء منصة قائمة على الغشاء قابلة لإعادة التشكيل مع هيكل بئر مفتوح ، وقدرة على تحسين التدفق ، والتوافق مع البروتوكولات التقليدية. يستخدم هذا النظام نهج التجميع المغناطيسي الذي يتيح التبديل العكسي بين أوضاع البئر المفتوحة وأوضاع الموائع الدقيقة. باستخدام هذا النهج ، يتمتع المستخدمون بالمرونة لبدء تجربة بتنسيق البئر المفتوح باستخدام البروتوكولات القياسية وإضافة أو إزالة إمكانات التدفق حسب الحاجة. لإثبات الاستخدام العملي لهذا النظام وتوافقه مع التقنيات القياسية ، تم إنشاء طبقة أحادية الخلية البطانية في شكل بئر مفتوح. تمت إعادة تشكيل النظام لإدخال تدفق السوائل ثم تم تحويله إلى تنسيق البئر المفتوح لإجراء تلطيخ المناعة واستخراج الحمض النووي الريبي. نظرا لتوافقه مع بروتوكولات الآبار المفتوحة التقليدية وقدرة تحسين التدفق ، من المتوقع أن يتم اعتماد هذا التصميم القابل لإعادة التكوين من قبل كل من مختبرات الهندسة والعلوم البيولوجية.
Introduction
تعمل الحواجز الوعائية كواجهة مهمة تفصل حجرة الدم عن الأنسجة المحيطة. إنها تلعب دورا مهما في الحفاظ على التوازن من خلال جذب الخلايا المناعية ، والتحكم في النفاذية الجزيئية ، والحماية من تسلل مسببات الأمراض إلى الأنسجة 1,2. تم تطوير نماذج الاستزراع في المختبر لمحاكاة البيئة المكروية في الجسم الحي ، مما يتيح إجراء تحقيقات منهجية في العوامل والظروف التي تؤثر على خصائص الحاجز في كل من الحالات الصحية والمريضة 3,4.
النهج الأكثر استخداما لنماذج الاستزراع هذه هو تكوين "البئر المفتوح"الشبيه ب Transwell 5 ، حيث يفصل غشاء استزراع مسامي محفور في المسار المقصورات المملوءة بالوسائط (الشكل 1 أ). في هذا الشكل ، يمكن زرع الخلايا على جانبي الغشاء ، وقد تم تطوير مجموعة واسعة من البروتوكولات التجريبية. ومع ذلك ، فإن هذه الأنظمة محدودة في قدرتها على توفير تدفقات السوائل الضرورية لدعم نضوج الحاجز ومحاكاة الدورة الدموية للخلايا المناعية التي تظهر في الجسم الحي 5,6. وبالتالي ، لا يمكن استخدامها للدراسات التي تتطلب تدفقات ديناميكية تقدم جرعات دوائية أو تحفيزا ميكانيكيا أو إجهادات قص ناتجة عن السوائل6،7،8.
للتغلب على قيود أنظمة الآبار المفتوحة ، تم تطوير منصات الموائع الدقيقة التي تجمع بين أغشية الاستزراع المسامية والقنوات السائلة القابلة للعنونة بشكل فردي9. توفر هذه المنصات تحكما دقيقا في توجيه السوائل ، والتروية ، وإدخال المركبات الكيميائية ، وتحفيز القص المتحكم فيه ، وقدرات إضافة الخلاياالديناميكية 7،10،11،12،13. على الرغم من القدرات المتقدمة التي توفرها منصات الموائع الدقيقة ، إلا أنها لم تشهد اعتمادا واسع النطاق في مختبرات العلوم البيولوجية بسبب بروتوكولات الموائع الدقيقة المعقدة وعدم توافقها مع سير العمل التجريبي المعمول به4،10،14.
لسد الفجوة بين هذه التقنيات ، نقدم بروتوكولا يستخدم نظاما قابلا لإعادة التكوين مغناطيسيا وقائما على الوحدة. يمكن تبديل هذا النظام بسهولة بين أوضاع البئر المفتوح وأوضاع الموائع الدقيقة بناء على الاحتياجات المحددة للتجربة. تتميز المنصة بجهاز بئر مفتوح ، يعرف باسم m-μSiM (نظام فسيولوجي دقيق معياري يتم تمكينه بواسطة غشاء سيليكون) ، مع غشاء استزراع بسمك 100 نانومتر (غشاء نانوي). يمتلك هذا الغشاء النانوي مسامية عالية (15٪) وشفافية تشبه الزجاج ، كما هو موضح في الشكل 1B. إنه يفصل فعليا الجزء العلوي عن القناة السفلية ، مما يسمح بالنقل الجزيئي عبر مقاييس الطول الفسيولوجية15. على عكس الأغشية التقليدية المحفورة بالمسار ، والتي عرفت تحديات في تصوير الخلايا الحية بتصوير المجال الساطع ، تتيح الخصائص البصرية والفيزيائية المواتية للغشاء النانوي تصورا واضحا للخلايا على جانبي سطح الغشاء15،16،17.
يحدد هذا البروتوكول تصنيع وحدات البذر والتدفق المتخصصة ويشرح إعادة التكوين المغناطيسي للمنصة. يوضح كيف يمكن استخدام المنصة لإنشاء حواجز بطانية في ظل ظروف ثابتة وديناميكية. يكشف هذا العرض التوضيحي أن الخلايا البطانية تصطف على طول اتجاه التدفق ، مع تنظيم أهداف الجينات الحساسة للقص تحت تحفيز القص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يمكن استخدام هذا التصميم في أوضاع مختلفة بناء على المتطلبات التجريبية وتفضيلات المستخدم النهائي. قبل كل تجربة ، راجع مخطط تدفق القرار المعروض في الشكل 2 لتحديد الخطوات والوحدات اللازمة للبروتوكول. على سبيل المثال ، إذا كان المستخدم ينوي الحفاظ على تنسيق البئر المفتوح خلال التجربة لمقارنته مباشرة بنظام من نوع Transwell ، فإن استنسل الزخرفة غير مطلوب لبذر الخلية. الوحدة الأساسية متاحة تجاريا (انظر جدول المواد) ، ويمكن اختيار الغشاء النانوي فائق النحافة من مكتبة المواد ذات المسامية وأحجام المسام المختلفة لتناسب الاحتياجات التجريبية.
1. تصنيع استنسل الزخرفة
ملاحظة: يعمل استنسل الزخرفة على وضع الخلايا حصريا على المنطقة المسامية لرقاقة الغشاء ، مما يمنع الخلايا من الاستقرار على طبقة السيليكون المحيطة حيث يمكن أن تتعرض للتلف بعد إضافة وحدة التدفق16 (راجع الشكل 3). يمكن أن يؤثر تلف الطبقة الأحادية سلبا على سلامة الحاجز ويضر بالنتائج التجريبية. الاستنسل غير ضروري في ثقافة مفتوحة وثابتة ، حيث لا يوجد خطر التلف.
- شراء قالب أو آلة أو طباعة ثلاثية الأبعاد باستخدام التصميم المقدم في ملف الترميز التكميلي 1 (الشكل 4 أ).
ملاحظة: جدران الاستنسل مدببة لزيادة سعة الوسائط وتقليل ملائمة الفقاعات مقارنة بالميزات ذات الجدران المستقيمة ذات نسبة العرض إلى الارتفاع العالية. - قم بتوصيل فيلم لاصق حساس للضغط (PSA) 130 ميكرومتر بلوح أكريليك مقاس 3.2 مم باستخدام بكرة باردة (انظر جدول المواد).
- قطع لوح الأكريليك بالليزر وفقا للتصميم المقدم في ملف الترميز التكميلي 2 لإنشاء مجموعة من التجاويف (الشكل 4 ب).
- انزع الطبقة الواقية من فيلم PSA وأرفق لوح الأكريليك بالقالب.
ملاحظة: تأكد من محاذاة الصفيحة المقطوعة بالليزر مع القالب بحيث تتمركز ميزات القالب داخل التجويف (الشكل 4C). تعتمد دقة وضع الخلية على الغشاء على هذه الخطوة. - امزج البوليمر الأولي PDMS جيدا (باستخدام نسبة 10: 1 من القاعدة إلى المحفز) (انظر جدول المواد) وقم بتفريغه في غرفة مفرغة حتى لا تبقى فقاعات مرئية (5-15 دقيقة).
- صب ببطء PDMS في تجاويف القالب ، وتسويتها بحافة مسطحة.
ملاحظة: لمنع انحباس الفقاعة، صب PDMS في كل تجويف ببطء. إذا كانت الفقاعات موجودة بعد الصب ، ضع القالب في غرفة التفريغ وقم بتفريغه مرة أخرى. - عالج PDMS على لوح تسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم اتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- استخرج الإستنسل من تجاويف القالب باستخدام ملاقط مسطحة الرأس.
2. تصنيع وحدة التدفق
ملاحظة: تشترك وحدة التدفق في بصمة مماثلة مع البئر على شكل البرسيم للوحدة الأساسية وتتضمن قناة دقيقة مصبوبة (العرض = 1.5 مم ، الارتفاع = 0.2 مم ، الطول = 5 مم). يساعد شكل البرسيم في محاذاة القناة فوق منطقة الاستزراع المسامية (الشكل 5).
- استخدم تقنيات الطباعة الحجرية اللينة القياسية18 لإنشاء قالب سيليكون بميزات محددة من خلال التصميم المقدم في ملف الترميز التكميلي 3 (الشكل 4D).
- قم بتوصيل فيلم PSA 130 ميكرومتر بلوح أكريليك بسمك 3.2 مم.
- قطع لوح الأكريليك بالليزر بناء على التصميم الوارد في ملف الترميز التكميلي 4 لإنشاء مجموعة من التجاويف على شكل البرسيم (الشكل 4E).
ملاحظة: يحدد ارتفاع التجويف ارتفاع وحدة التدفق ، والتي يجب أن تكون أطول قليلا (بمقدار 0-0.1 مم) من ارتفاع بئر الوحدة الأساسية لضمان الختم المناسب. - قم بإزالة الطبقة الواقية من فيلم PSA ثم قم بتوصيل الصفيحة المقطوعة بالليزر بقالب السيليكون عن طريق محاذاة علامات المحاذاة المثلثة على قالب السيليكون مع تلك الموجودة على الصفيحة المقطوعة بالليزر.
ملاحظة: على غرار الخطوة 1.4 ، تأكد من محاذاة لوح الأكريليك المقطوع بالليزر مع قالب السيليكون بحيث يتم توسيط ميزات القالب داخل كل تجويف (الشكل 4F). تحدد هذه الخطوة موضع القناة الدقيقة بالنسبة إلى البصمة. - صب ببطء PDMS منزوع الغازات على تجاويف القالب وقم بتسويته بحافة مسطحة.
ملاحظة: في حالة وجود فقاعات بعد الصب ، قم بإزالة الغاز من القالب حتى تتم إزالة الفقاعات. - ضع القالب على لوح تسخين واخبز PDMS على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم اترك القالب يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة وحدات التدفق بعناية من تجاويف القالب باستخدام ملاقط مسطحة الرأس.
- قم بتوجيه وحدة التدفق بحيث تكون ميزات microchannel متجهة لأعلى ، وضع منافذ المدخل والمخرج الأساسية في نهاية القناة باستخدام لكمة خزعة (انظر جدول المواد).
3. تصنيع العلب الاكريليك السفلي والعلوي
ملاحظة: تتناسب الوحدة الأساسية مع الغلاف السفلي. يؤدي الجذب بين المغناطيسات المضمنة في العلب إلى ضغط وإغلاق وحدة التدفق إلى الوحدة الأساسية (الشكل 6).
- قم بقص لوح أكريليك 2 مم بالليزر باستخدام التصميم المتوفر في ملف الترميز التكميلي 5 لإنشاء الغلاف العلوي مع فتحات لإدخال المغناطيس.
- قم بتوصيل فيلم PSA 130 ميكرومتر بلوح أكريليك 3.5 مم.
- قم بقص لوح الأكريليك بالليزر بناء على التصميم الوارد في ملف الترميز التكميلي 6 لإنشاء السكن السفلي مع فتحات لإدخال المغناطيس.
ملاحظة: سمك السكن السفلي هو معلمة حرجة ويجب أن يتطابق مع السماكة الكلية للوحدة الأساسية لمنع التسرب أثناء التدفق. - قم بإزالة الطبقة الواقية PSA وقم بتوصيل الغلاف السفلي بغطاء زجاجي.
- مغناطيس نيوديميوم مطلي بالنيكل مقاس 4.75 مم (انظر جدول المواد) في الثقوب المقطوعة بالليزر في العلب.
ملاحظة: تأكد من وضع المغناطيس في العلب السفلية والعلوية بقطبية معاكسة لضمان الجذب المغناطيسي (الشكل 6).
4. تصنيع دائرة التدفق
ملاحظة: تحتوي دائرة التدفق ذات الحلقة المغلقة على قارورة لجمع العينات كخزانات (الشكل 7). يحتوي خزان المدخل على مرشح بولي فينيليدين ثنائي فلوريد (PVDF) للسماح لوسائط الخلية بالتوازن مع تركيز CO2 في الحاضنة.
- استخدم لكمة خزعة 1 مم لإنشاء فتحتين في غطاء قارورة جمع العينات.
- استخدم لكمات الخزعة لإنشاء فتحتين (1 مم و 4 مم) في غطاء قارورة منفصلة لجمع العينات ، وإنشاء ثقب 1 مم في الجزء السفلي من هذه القارورة.
- أدخل أطراف توزيع 20 جيجا في كل من الثقوب مقاس 1 مم وأغلقها بالغراء الساخن.
- ضع مرشح PVDF 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) في فتحة 4 مم وأغلقه بالغراء الساخن.
- قم بقص لوح أكريليك مقاس 1.5 مم بالليزر باستخدام التصميم المتوفر في ملف الترميز التكميلي 7 لإنشاء مرحلة الاحتفاظ بالعينة.
- ضع الخزانات على مرحلة الأكريليك.
- قم بتوصيل أطراف التوزيع باستخدام أنابيب التدفق الدقيقة (انظر جدول المواد).
- قم بتوصيل الأنابيب بمدخل ومخرج وحدة التدفق باستخدام أطراف توزيع 21 G.
- استخدم مضخة تمعجية (انظر جدول المواد) لتدوير التدفق.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الحقن أو المضخات الهوائية لإدخال التدفق إذا رغبت في ذلك. يجب تحديد معدل التدفق بناء على الاحتياجات التجريبية. ويرد في الجدول التكميلي 1 جدول شامل، مستمد من نموذج COMSOL الذي تم التحقق من صحته تجريبيا، لمساعدة المستخدمين في اختيار معدل التدفق اللازم لتحقيق إجهاد القص المطلوب عند الخليةأحادية الطبقة 16.
5. بذر الخلايا
ملاحظة: على غرار إدراج الغشاء التقليدي ، يمكن زراعة أنواع مختلفة من الخلايا على الغشاء النانوي. يمكن أيضا زراعة نوع خلية ثانوي على الجانب الآخر من الغشاء في القناة السفلية15.
- قم بتغطية الغشاء ب 5 ميكروغرام / سم2 من الفبرونيكتين (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة لتحسين ارتباط الخلية.
ملاحظة: قد يؤثر نوع الخلية المختار على الطلاء المطلوب وكثافة الخلية. الإجراء الموصوف هنا هو للخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs ، انظر جدول المواد). - قم بنضح محلول الطلاء باستخدام ماصة P200 وضع استنسل النقش في الوحدة الأساسية جيدا.
- أضف وسائط خلوية إلى القناة السفلية والسفلية للجهاز.
- بذرة HUVECs بكثافة 40000 خلية / سم2 في البئر.
ملاحظة: تشكل HUVECs عند هذه الكثافة عادة طبقة أحادية متقاربة بعد 24 ساعة من الحضانة16,19. - ضع الجهاز في طبق بتري. أضف غطاء أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع ماء DI إلى طبق بتري للحفاظ على الرطوبة المحلية.
- نقل طبق بتري إلى الحاضنة.
ملاحظة: يجب تغيير الوسائط الخلوية في البئر العلوي والقناة السفلية للجهاز كل 24 ساعة. لتغيير الوسائط في القناة السفلية ، قم بحقن وسائط جديدة برفق في أحد المنافذ لإزاحة الوسائط القديمة من المنفذ الآخر.
6. إعادة التكوين إلى وضع الموائع الدقيقة
- تعقيم السكن العلوي ، والسكن السفلي ، ووحدة التدفق ، والخزانات ، والأنابيب ، ونصائح الاستغناء عن طريق وضعها في غرفة التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة قبل التجميع. تعميم 70 ٪ من الإيثانول ثم PBS معقم في دائرة التدفق.
- املأ الخزانات والأنابيب بوسائط نمو الخلايا البطانية (انظر جدول المواد).
- ضع السكن السفلي على مرحلة العينة. أدخل الوحدة الأساسية المفتوحة في السكن السفلي.
- نضح وسائط الخلية من بئر الوحدة. ضع وحدة التدفق في البئر.
- ضع الغلاف العلوي لإغلاق وحدة التدفق في الوحدة الأساسية جيدا. قم بتوصيل أطراف توزيع المدخل والمخرج بمنافذ وحدة التدفق.
- ابدأ تشغيل المضخة التمعجية لإدخال تدفق السوائل في النظام.
7. إجراء تحليل المصب في شكل بئر مفتوح بعد إدخال التدفق
ملاحظة: يعتمد وقت الاستزراع هنا على الأهداف التجريبية. يمكن للمستخدمين إجراء تحليل المصب (على سبيل المثال ، الكيمياء المناعية ، واستخراج الحمض النووي الريبي) إما في تنسيقات البئر المفتوحة أو الموائع الدقيقة بناء على تفضيلاتهم. على سبيل المثال ، إذا كان تنسيق البئر المفتوح مفضلا ، فيجب إعادة تكوين النظام لإجراء المقايسات بناء على البروتوكولات القياسية 16,19.
- أوقف المضخة عند الوصول إلى الوقت المطلوب للتعرض لتدفق القص. قم بإزالة أطراف توزيع المدخل والمخرج.
- إزالة السكن العلوي. قم بإزالة وحدة التدفق برفق من البئر باستخدام الملقط.
- أضف 100 ميكرولتر من وسائط الخلية إلى البئر. إجراء المقايسات المطلوبة على أساس البروتوكولات القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم وضع الوحدة الأساسية المفتوحة في البداية داخل تجويف معين تم إنشاؤه بواسطة مبيت سفلي وغطاء ، كما هو موضح في الشكل 6 أ. بعد ذلك ، يتم إدخال وحدة التدفق ، التي تتضمن قناة صغيرة ومنافذ وصول ، في بئر الوحدة الأساسية. يتم إغلاق وحدة التدفق بإحكام ضد طبقة دعم السيليكون للغشاء بسبب قوة الجذب المغناطيسية بين المغناطيس المضمن في العلب السفلية والعلوية ، كما هو موضح في الشكل 6B. لتقييم فعالية آلية الإغلاق المغناطيسي هذه ، تم إجراء اختبار ضغط الانفجار ، مما يدل على أن النظام يمكنه تحمل الضغوط المسدودة التي تصل إلى 38.8 ± 2.4 كيلو باسكال. يتجاوز تحمل الضغط هذا بشكل كبير ضغوط التشغيل النموذجية التي تتم مواجهتها في تطبيقات زراعة الخلايا. علاوة على ذلك، يظل النظام خاليا من التسربات عند تعرضه لمعدلات تدفق تصل إلى 4000 ميكرولتر/دقيقة، وهو ما يعادل إجهاد قص يبلغ 74 داين/سم2 في منطقة الاستزراع16.
عند تطوير منصة يمكنها التبديل بين أوضاع البئر المفتوحة وأوضاع الموائع الدقيقة ، يجب النظر بعناية في نهج تلقيح الخلايا ، والذي لا يمثل عادة مصدر قلق لمنصات الآبار المفتوحة الثابتة التقليدية16. يمكن أن يؤدي تلف الطبقة الأحادية حول حدود القناة إلى حدوث مضاعفات في النتائج التجريبية20. لمعالجة هذه المشكلة ، تم تصميم استنسل قابل للإزالة يتناسب مع البئر المفتوح للوحدة الأساسية ويوفر نافذة محددة للخلايا لتستقر بشكل تفضيلي على سطح الغشاء (الشكل 3). بمجرد أن يتم نقش الطبقة الأحادية للخلية والوصول إلى نقطة التقاء ، يتمتع المستخدم بالمرونة لمواصلة التجربة بتنسيق البئر المفتوح أو إعادة تكوين النظام الأساسي في وضع الموائع الدقيقة لتعريض الطبقة الأحادية للخلية لإجهاد القص الفسيولوجي (الشكل 3). توفر آلية الإغلاق المغناطيسي القدرة على التبديل بسهولة بين تنسيقات البئر المفتوحة والموائع الدقيقة حسب الحاجة. على سبيل المثال ، يمكن إعادة الجهاز إلى تنسيق البئر المفتوح بعد تحفيز التدفق ، مما يوفر للمستخدمين المرونة لإجراء مجموعة متنوعة من المقايسات (مثل التلوين المناعي واستخراج الحمض النووي الريبي وقياسات النفاذية الجزيئية) باستخدام البروتوكولات التجريبية القياسية15,16.
في الإعداد الفسيولوجي لجسم الإنسان ، يتعرض الحاجز الوعائي لإجهاد القص الناجم عن التدفق ، والذي يعمل كإشارة فيزيائية حيوية رئيسية تؤثر على بنية ووظيفة الحاجز5،21،22. وبالتالي ، فإن إضافة تدفق السوائل في النظم الفسيولوجية الدقيقة هو مطلب رئيسي. لإثبات تعدد استخدامات المنصة ، تم إنشاء طبقة أحادية HUVEC بتنسيق بئر مفتوح باستخدام بروتوكولات قياسية. بعد 24 ساعة من الاستزراع الساكن ، تم إعادة تكوين المنصة في وضع الموائع الدقيقة لتعريض الخلية أحادية الطبقة إلى 10.7 داين / سم2 إجهاد قص لمدة 24 ساعة. أشارت النتائج إلى أن الخلايا المزروعة تحت التدفق محاذاة على طول اتجاه التدفق بينما ظلت الخلايا المزروعة بدون تدفق موجهة بشكل عشوائي (الشكل 8 أ ، ب). بعد تحفيز القص ، تمت إعادة تكوين المنصة إلى تنسيق البئر المفتوح لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام البروتوكولات القياسية. أشارت النتائج إلى أن تعرض الخلايا لإجهاد القص أدى إلى زيادة تنظيم العامل الشبيه بكروبل 2 (KLF2) وسينسيز أكسيد النيتريك البطاني (eNOS) ، والتي تؤدي أدوارا حاسمة مثل الوظائف المضادة للتخثر والشرايين في الأوعية الدموية السليمة23،24 (الشكل 8C).
الشكل 1: مقارنة بين نماذج الحاجز الوعائي في المختبر . رسم تخطيطي ل (A) إدخالات تقليدية تشبه Transwell و (B) البئر المفتوح m-μSiM. تسلط صور المجال الساطع لطبقة أحادية HUVEC المتقاربة الضوء على الاختلاف في جودة التصوير في المجال الساطع بين الغشاء المحفور بالمسار والأغشية النانوية فائقة النحافة. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. مقتبس من منصوري وآخرون 16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط تدفق اتخاذ القرار. مخطط انسيابي يعتمد على الاحتياجات التجريبية وتفضيلات تحليل المصب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: سير العمل التجريبي للمنصة. (أ) لوضع الخلايا مباشرة على الغشاء المسامي ، يتم إدخال استنسل نقش قابل للإزالة في بئر الوحدة الأساسية (يظهر الجزء الداخلي خلايا منقوشة ، وتظهر الخطوط الصفراء حدود القنوات الدقيقة). (ب) يمكن الاحتفاظ بالاستنسل أو إزالته في الجهاز لزراعة الخلايا الساكنة. (ج) لإعادة تكوين المنصة إلى وضع الموائع الدقيقة ، يتم استبدال الاستنسل بوحدة التدفق. بسبب آلية الختم المغناطيسي ، فإن التكوين قابل للانعكاس ؛ يمكن إزالة العلب ووحدة التدفق للتبديل إلى وضع البئر المفتوح. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. مقتبس من منصوري وآخرون 16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: رسم تخطيطي للقوالب. أ: قالب الاستنسل. (ب) لوح أكريليك مقطوع بالليزر. (ج) منظر مجمع لقالب الاستنسل. (د) قالب وحدة التدفق. (ه) لوح أكريليك مقطوع بالليزر. (F) عرض مجمع لقالب وحدة التدفق. الميزات على شكل مثلث هي علامات محاذاة لتسهيل ربط ألواح الأكريليك بالقوالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: رسم تخطيطي لوحدة التدفق على شكل البرسيم. (أ) واجهة التلامس بين وحدة التدفق ورقاقة الغشاء. تظهر منافذ مدخل ومخرج تدفق السوائل باللون الوردي. (ب) صورة 3D لوحدة تدفق PDMS. مقتبس من منصوري وآخرون 16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التجميع المغناطيسي لإعادة تكوين الجهاز. (أ) عرض تخطيطي لمكونات إعادة تشكيل الجهاز في وضع الموائع الدقيقة. تحفز المغناطيسات المدمجة ذات الأقطاب المتقابلة على جذب الختم. (ب) منظر مقطعي للجهاز المعاد تكوينه يوضح القناة الوعائية باللون الوردي وحجرة الأنسجة باللون الأخضر. مقتبس من منصوري وآخرون 16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: عرض مجمع لدائرة التدفق. تتكون الدائرة من مضخة تمعجية ، وخزانين لتزويد وسائط الخلية وتقلبات التخميد ، والأنابيب ، ومرحلة الأكريليك لتثبيت المكونات في مكانها. مقتبس من منصوري وآخرون 16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: مقارنة بين مركبات HUVEC المستزرعة في أوضاع الآبار المفتوحة والموائع الدقيقة. تم زرع الخلايا وزراعتها في بئر مفتوح لمدة 24 ساعة لإنشاء طبقة أحادية متقاربة. خلال فترة ال 24 ساعة اللاحقة ، تم إعادة تكوين مجموعة واحدة من الأجهزة في وضع الموائع الدقيقة. (أ) الخلايا المزروعة تحت السريان (إجهاد القص 10.7 dynes.cm-2 ) محاذاة على طول اتجاه التدفق (يظهر الجزء الداخلي الأكتين ونوى الخلايا باللون الأخضر والأزرق على التوالي). (ب) لم تظهر الخلايا المزروعة بدون تدفق في صورة بئر مفتوح أي محاذاة. يوضح طول الأشرطة في مخططات الرادار عدد الخلايا في الاتجاه المقابل. (ج) أظهرت الخلايا المزروعة تحت التدفق تنظيما أعلى لجينات KLF2 و eNOS مقارنة بشرط عدم التدفق (** p < 0.01 ، n = 3 ، متوسط ± SD). قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. مقتبس من منصوري وآخرون 16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول التكميلي 1: إجهاد القص على سطح الغشاء النانوي بمعدلات تدفق مختلفة. يوفر هذا الجدول معلومات حول قيم إجهاد القص على سطح الغشاء النانوي بمعدلات تدفق مختلفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 1: نموذج CAD لقالب الاستنسل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 2: نموذج CAD لتجاويف القطع بالليزر لقالب الاستنسل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 3: نموذج CAD لوحدة التدفق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 4: نموذج CAD لتجاويف القطع بالليزر لقالب وحدة التدفق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 5: نموذج CAD للإسكان العلوي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 6: نموذج CAD للإسكان السفلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 7: نموذج CAD لمرحلة الأكريليك. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة عملية لدمج قدرات التدفق في منصة بئر مفتوحة تتميز بغشاء نانوي فائق النحافة. في هذا التصميم ، يتم استخدام نهج الإغلاق المغناطيسي ، مما يسمح بالتبديل بين أوضاع البئر المفتوحة والسائلة أثناء التجارب والجمع بين مزايا كلا النهجين. على عكس المنصات التقليدية المرتبطة بشكل دائم ، يسمح الإغلاق المغناطيسي بتفكيك المنصة في نقاط مناسبة أثناء سير العمل التجريبي16،25،26،27. في هذه المنصة ، يتم زرع الخلايا ، ويتم إنشاء الحاجز بتنسيق البئر المفتوح المألوف ، ثم يتم إعادة تكوين النظام إلى وضع السوائل ببساطة عن طريق إضافة وحدة تدفق وإغلاقها مغناطيسيا. توفر إعادة التشكيل هذه فائدتين رئيسيتين: أولا ، تمكن من محاكاة الظروف الفسيولوجية عن طريق تعريض الطبقة الأحادية للخلية لإجهاد القص الناجم عن السوائل. ثانيا ، يسهل إدخال المكونات الثانوية مثل الخلايا المناعية في ظل ظروف التدفق16. توفر ميزة الإغلاق المغناطيسي طريقة تجميع خالية من الأدوات ، مما يتيح التبديل عند الطلب بين تنسيقات البئر المفتوحة وتنسيقات الموائع الدقيقة. وبالتالي ، يمكن إجراء التحليلات النهائية ، مثل الكيمياء الخلوية المناعية واستخراج الحمض النووي الريبي ، في شكل البئر المفتوح المألوف باستخدام التقنيات القياسية أو باستخدام تقنيات الموائع الدقيقة حسب الرغبة16.
يعد الختم المغناطيسي معلمة مهمة للتصميم تتيح إعادة تكوين المنصة ، وبالتالي ، هناك حاجة إلى العديد من الاعتبارات لوظيفتها الدقيقة: (1) يجب أن يتطابق ارتفاع السكن السفلي مع ارتفاع الوحدة الأساسية (التفاوت: ±0.1 مم) لإحاطة الوحدة بشكل صحيح. (2) يجب أن يكون ارتفاع وحدة التدفق أطول قليلا من بئر الوحدة الأساسية (0-0.1 مم). (3) هذا التصميم قابل للتكيف مع مجموعة واسعة من المواد ولا يفرض أن يتم بناء وحدة التدفق من مواد مرنة. العنصر الحاسم هو دمج مادة ناعمة تشبه الحشية في الواجهة بين وحدة التدفق ورقاقة الغشاء لإنشاء ختم موثوق. (4) يجب تحسين قطر التجاويف المقطوعة بالليزر في العلب للمغناطيسات المناسبة للضغط بناء على الأداة المستخدمة28. قد ينفصل المغناطيس ويؤدي إلى تسرب التدفق إذا كان قطر التجويف كبيرا جدا ، أو قد تتشقق العلب أثناء إدخال المغناطيس إذا كانت التجاويف صغيرة جدا. باتباع الاعتبارات المذكورة أعلاه ، يمكن تطبيق نهج التجميع المغناطيسي المقدم هنا لإعادة تكوين أنظمة الآبار المفتوحة الأخرى في وضع الموائع الدقيقة.
للحصول على إمكانية إعادة التكوين ، من الضروري استخدام استنسل الزخرفة الذي يسمح بتحديد المواقع الدقيقة للخلايا على سطح الغشاء. يضمن الاستنسل عدم وجود خلايا خارج منطقة الاستزراع المسامي (أي في منطقة دعم السيليكون) ، والتي يمكن أن تتلف عند إدخال وحدة التدفق. يصبح هذا الجانب حاسما بشكل خاص في نماذج الزراعة المشتركة لأن الخلايا التي تم زرعها عن غير قصد في مواقع غير مقصودة لا يمكنها المشاركة بنشاط في تطوير الأنسجة الحاجزة. ومع ذلك ، عادة ما يتم استرداد هذه الخلايا في غير محلها أثناء عملية التحلل ويمكن أن تؤدي إلى تحيز في دراسات التعبير الجيني التي تبحث في التفاعلات بين الخلايا عبر الغشاء20. يعزز تلقيح الخلايا المفتوحة باستخدام الاستنسل كفاءة البذر عن طريق التخفيف من خسائر الخلايا على طول مسار التدفق ، والتي هي متأصلة في منصات الموائع الدقيقة التقليدية 4,16. هذه المنصة قادرة أيضا على دمج أنواع متعددة من الخلايا ومواد ECM15،16،17. على سبيل المثال ، يمكن حقن هيدروجيل محمل بالخلايا في القناة السفلية للجهاز لتقليد حجرة الأنسجة أثناء إنشاء بطانة أعلى الغشاء.
على الرغم من أنه يمكن إعادة استخدام الوحدات والمكونات المغناطيسية ، إلا أن الحفاظ على الختم الفعال على العديد من الاستخدامات يمكن أن يكون مشكلة بسبب ارتخاء المغناطيس في السكن وتقليل قوة الختم. يمكن التخفيف من هذه المشكلة عن طريق إنشاء وحدات مغلفة جديدة لكل تجربة أو مكونات منتجة بكميات كبيرة باستخدام تقنيات القولبة بالحقن أو الطباعة 3D بمجرد إنشاء التصاميم. في الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول ، يتم وضع وحدة التدفق يدويا في الوحدة الأساسية ، وتكون قدرة تعدد الإرسال والأتمتة للنظام محدودة. لتحسين الإنتاجية التجريبية ، يمكن دمج وحدة التدفق والسكن العلوي في وحدة وظيفية واحدة تحتوي على قنوات توجيه داخلية ووصلات أنابيب موحدة تتخلل في وقت واحد عدة وحدات بالتوازي.
يتم إنتاج مكونات الوحدة الأساسية المفتوحة بكميات كبيرة ومتاحة تجاريا. يمكن أيضا تصنيع المكونات الأخرى للنظام ، مثل وحدة التدفق ، والعلب ، واستنسل الزخرفة ، على نطاق واسع. علاوة على ذلك ، تسمح قابلية إعادة تشكيل المنصة بإضافة أجهزة استشعار ومشغلات (على سبيل المثال ، وحدة المقاومة الكهربائية عبر البطانية ، وحدة التثقيب الكهربائي) للتحفيز والقياسات في الوقت الفعلي. بشكل عام ، تجمع هذه المنصة بين الأساليب التقليدية و microfluidic للمساعدة في دعم الاستخدام الواسع النطاق خارج المختبرات الهندسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.L.M. هو أحد مؤسسي شركة SiMPore، Inc. ويمتلك حصة في الشركة. تقوم SiMPore بتسويق التقنيات القائمة على السيليكون فائقة النحافة ، بما في ذلك الأغشية المستخدمة في هذه الدراسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل المعهد الوطني للصحة تحت أرقام الجوائز R43GM137651 و R61HL154249 و R16GM146687 و NSF منحة CBET 2150798. يشكر المؤلفون RIT Machine Shop لتصنيع قوالب الألومنيوم. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
References
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E.
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
