Summary
Dit protocol beschrijft een herconfigureerbaar, op membraan gebaseerd celkweekplatform dat het open-well-formaat integreert met vloeistofstroommogelijkheden. Dit platform is compatibel met standaardprotocollen en maakt omkeerbare overgangen mogelijk tussen open-well en microfluïdische kweekmodi, om tegemoet te komen aan de behoeften van zowel technische als biowetenschappelijke laboratoria.
Abstract
Microfysiologische systemen zijn geminiaturiseerde celkweekplatforms die worden gebruikt om de structuur en functie van menselijke weefsels in een laboratoriumomgeving na te bootsen. Deze platforms zijn echter niet wijdverbreid toegepast in biowetenschappelijke laboratoria waar open-well, membraangebaseerde benaderingen dienen als de gouden standaard voor het nabootsen van weefselbarrières, ondanks het ontbreken van vloeistofstroommogelijkheden. Dit probleem kan voornamelijk worden toegeschreven aan de onverenigbaarheid van bestaande microfysiologische systemen met standaardprotocollen en hulpmiddelen die zijn ontwikkeld voor open-well-systemen.
Hier presenteren we een protocol voor het creëren van een herconfigureerbaar membraangebaseerd platform met een open-well-structuur, stroomverbeteringsmogelijkheden en compatibiliteit met conventionele protocollen. Dit systeem maakt gebruik van een magnetische assemblagebenadering die omkeerbaar schakelen tussen open-well en microfluïdische modi mogelijk maakt. Met deze aanpak hebben gebruikers de flexibiliteit om een experiment te starten in het open-well-formaat met behulp van standaardprotocollen en indien nodig stroommogelijkheden toe te voegen of te verwijderen. Om het praktische gebruik van dit systeem en de compatibiliteit met standaardtechnieken aan te tonen, werd een endotheelcelmonolaag in een open-well-formaat vastgesteld. Het systeem werd opnieuw geconfigureerd om vloeistofstroom te introduceren en schakelde vervolgens over op het open-well-formaat om immunokleuring en RNA-extractie uit te voeren. Vanwege de compatibiliteit met conventionele open-well-protocollen en de mogelijkheid om de stroming te verbeteren, zal dit herconfigureerbare ontwerp naar verwachting worden overgenomen door zowel technische als biowetenschappelijke laboratoria.
Introduction
Vasculaire barrières dienen als een kritische interface die het bloedcompartiment scheidt van het omringende weefsel. Ze spelen een cruciale rol bij het behoud van de homeostase door immuuncellen aan te trekken, de moleculaire permeabiliteit te beheersen en af te schermen tegen het binnendringen van ziekteverwekkers in hetweefsel1,2. Er zijn in-vitrokweekmodellen ontwikkeld om de in vivo micro-omgeving na te bootsen, waardoor systematisch onderzoek mogelijk is naar de factoren en omstandigheden die van invloed zijn op de barrière-eigenschappen in zowel gezonde als zieke toestanden 3,4.
De meest gebruikte benadering voor dergelijke kweekmodellen is de Transwell-achtige "open-well"-configuratie5, waarbij een poreus, spoorgeëtst kweekmembraan met media gevulde compartimenten scheidt (Figuur 1A). In dit formaat kunnen cellen aan weerszijden van het membraan worden gezaaid en is een breed scala aan experimentele protocollen ontwikkeld. Deze systemen zijn echter beperkt in hun vermogen om de vloeistofstromen te leveren die essentieel zijn voor het ondersteunen van barrièrerijping en het nabootsen van de circulatie van immuuncellen die in vivo 5,6 worden gezien. Bijgevolg kunnen ze niet worden gebruikt voor onderzoeken die dynamische stromen vereisen die geneesmiddeldoses, mechanische stimulatie of door vloeistof geïnduceerde schuifspanningen introduceren 6,7,8.
Om de beperkingen van open-well-systemen te overwinnen, zijn microfluïdische platforms ontwikkeld die poreuze kweekmembranen combineren met individueel adresseerbare fluïdische kanalen9. Deze platforms bieden nauwkeurige controle over vloeistofroutering, perfusie en de introductie van chemische verbindingen, gecontroleerde afschuifstimulatie en dynamische celadditiemogelijkheden 7,10,11,12,13. Ondanks de geavanceerde mogelijkheden die microfluïdische platforms bieden, zijn ze niet wijdverbreid toegepast in biowetenschappelijke laboratoria vanwege complexe microfluïdische protocollen en hun onverenigbaarheid met gevestigde experimentele workflows 4,10,14.
Om de kloof tussen deze technologieën te overbruggen, presenteren we een protocol dat gebruik maakt van een magnetisch herconfigureerbaar, op modules gebaseerd systeem. Dit systeem kan eenvoudig worden omgeschakeld tussen open-well en microfluïdische modi op basis van de specifieke behoeften van het experiment. Het platform beschikt over een open-well-apparaat, bekend als m-μSiM (modulair microfysiologisch systeem mogelijk gemaakt door een siliciummembraan), met een 100 nm dik kweekmembraan (nanomembraan). Dit nanomembraan heeft een hoge porositeit (15%) en glasachtige transparantie, zoals geïllustreerd in figuur 1B. Het scheidt fysiek het bovenste compartiment van een onderste kanaal, waardoor moleculair transport over fysiologische lengteschalenmogelijk is 15. In tegenstelling tot conventionele spoorgeëtste membranen, die bekende uitdagingen hebben bij het afbeelden van levende cellen met helderveldbeeldvorming, maken de gunstige optische en fysische eigenschappen van het nanomembraan een duidelijke visualisatie van cellen aan weerszijden van het membraanoppervlak mogelijk 15,16,17.
Het huidige protocol schetst de fabricage van gespecialiseerde zaai- en stromingsmodules en verklaart de magnetische herconfiguratie van het platform. Het laat zien hoe het platform kan worden gebruikt om endotheliale barrières op te zetten onder zowel statische als dynamische omstandigheden. Deze demonstratie laat zien dat endotheelcellen zich uitlijnen langs de stroomrichting, met een opregulatie van afschuifgevoelige gendoelen onder schuifstimulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit ontwerp kan in verschillende modi worden gebruikt op basis van experimentele vereisten en de voorkeuren van de eindgebruiker. Raadpleeg voorafgaand aan elk experiment het beslissingsstroomschema in figuur 2 om de noodzakelijke stappen en modules voor het protocol te bepalen. Als de gebruiker bijvoorbeeld van plan is om het open-well-formaat tijdens een experiment te handhaven om het direct te vergelijken met het Transwell-type systeem, is het patroonstencil niet vereist voor het zaaien van cellen. De kernmodule is in de handel verkrijgbaar (zie Tabel met materialen) en het ultradunne nanomembraan kan worden geselecteerd uit een bibliotheek van materialen met verschillende porositeit en poriegroottes om aan experimentele behoeften te voldoen.
1. Fabricage van het patroonstencil
OPMERKING: Het patroonsjabloon dient om cellen uitsluitend op het poreuze gebied van de membraanchip te plaatsen, waardoor wordt voorkomen dat cellen zich op de omringende siliciumlaag nestelen, waar ze mogelijk schade kunnen oplopen nadat de stroommodule is toegevoegd16 (zie afbeelding 3). Schade aan de monolaag kan de integriteit van de barrière nadelig beïnvloeden en de experimentele resultaten in gevaar brengen. Het sjabloon is niet nodig in een open, statische cultuur, omdat er geen risico op beschadiging is.
- Koop, machine of 3D-print een mal met behulp van het ontwerp in aanvullend coderingsbestand 1 (Figuur 4A).
OPMERKING: De stencilwanden zijn taps toelopend om de mediacapaciteit te vergroten en het vasthouden van luchtbellen te minimaliseren in vergelijking met rechte wanden met een hoge beeldverhouding. - Plak een drukgevoelige kleeffolie (PSA) van 130 μm met een koude roller op een acrylplaat van 3,2 mm (zie Materiaaltabel).
- Snijd de acrylplaat met een laser volgens het ontwerp in aanvullend coderingsbestand 2 om een reeks holtes te creëren (Figuur 4B).
- Verwijder de beschermlaag van de PSA-film en bevestig de acrylplaat aan de mal.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de lasergesneden plaat is uitgelijnd met de mal, zodat de malkenmerken gecentreerd zijn in de holte (Figuur 4C). De nauwkeurigheid van de celpositionering op het membraan hangt af van deze stap. - Meng het PDMS-prepolymeer grondig (met een basis-katalysatorverhouding van 10:1) (zie Materiaaltabel) en ontgas het in een vacuümkamer totdat er geen zichtbare luchtbellen meer zijn (5-15 min).
- Giet de PDMS langzaam in de vormholtes en egaliseer het met een platte rand.
NOTITIE: Om te voorkomen dat luchtbellen bekneld raken, giet u het PDMS langzaam in elke holte. Als er na het gieten belletjes aanwezig zijn, plaats de mal dan in de vacuümkamer en ontgas hem opnieuw. - Laat het PDMS gedurende 1 uur uitharden op een kookplaat bij 70 °C en laat het vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur.
- Haal de stencils uit de vormholtes met een pincet met platte punt.
2. Fabricage van de stroommodule
NOTITIE: De stroommodule heeft een vergelijkbare voetafdruk als de klavervormige put van de kernmodule en bevat een gegoten microkanaal (breedte = 1.5 mm, hoogte = 0.2 mm, lengte = 5 mm). De klavervorm helpt bij het uitlijnen van het kanaal over het poreuze cultuurgebied (figuur 5).
- Gebruik standaard zachte lithografietechnieken18 om een siliconen mal te maken met kenmerken die worden gedefinieerd door het ontwerp in aanvullend coderingsbestand 3 (Figuur 4D).
- Plak een PSA-film van 130 μm op een acrylplaat met een dikte van 3,2 mm.
- Lasersnijd de acrylplaat op basis van het ontwerp in aanvullend coderingsbestand 4 om een reeks klavervormige holtes te creëren (Figuur 4E).
NOTITIE: De hoogte van de holte bepaalt de hoogte van de stromingsmodule, die iets hoger moet zijn (0-0.1 mm) dan de hoogte van de kernmodule om een goede afdichting te garanderen. - Verwijder de beschermlaag van de PSA-folie en bevestig vervolgens de lasergesneden plaat aan de siliconen mal door de driehoekige uitlijningsmarkeringen op de siliconen mal uit te lijnen met die op de lasergesneden plaat.
NOTITIE: Zorg er, net als bij stap 1.4, voor dat de lasergesneden acrylplaat is uitgelijnd met de siliconenmal, zodat de malkenmerken gecentreerd zijn in elke holte (Figuur 4F). Deze stap bepaalt de positie van het microkanaal ten opzichte van de footprint. - Giet de ontgaste PDMS langzaam op de vormholtes en egaliseer deze met een platte rand.
NOTITIE: Als er na het gieten luchtbellen aanwezig zijn, ontgas de vorm dan totdat de luchtbellen zijn verwijderd. - Plaats de vorm op een kookplaat en bak de PDMS 1 uur op 70 °C, laat de vorm vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur.
- Verwijder de stroommodules voorzichtig uit de vormholtes met een pincet met platte punt.
- Oriënteer de stromingsmodule met de microkanaalkenmerken naar boven gericht en plaats de inlaat- en uitlaatpoorten van de kern aan het einde van het kanaal met behulp van een biopsiepons (zie Materiaaltabel).
3. Fabricage van onderste en bovenste acrylbehuizingen
NOTITIE: De kernmodule past in de onderste behuizing. De aantrekkingskracht tussen ingebedde magneten in de behuizingen comprimeert en verzegelt de stromingsmodule naar de kernmodule (Figuur 6).
- Lasersnijd een acrylplaat van 2 mm met behulp van het ontwerp in aanvullend coderingsbestand 5 om de bovenste behuizing te maken met gaten voor het inbrengen van de magneet.
- Plak een PSA-film van 130 μm op een acrylplaat van 3,5 mm.
- Snijd de acrylplaat met een laser op basis van het ontwerp in aanvullend coderingsbestand 6 om de onderste behuizing te maken met gaten voor het inbrengen van de magneet.
NOTITIE: De dikte van de onderste behuizing is een kritische parameter en moet overeenkomen met de totale dikte van de kernmodule om lekkage tijdens de stroming te voorkomen. - Verwijder de PSA-beschermlaag en bevestig de onderste behuizing aan een glazen dekglaasje.
- 4,75 mm vernikkelde neodymium magneten (zie Materiaaltabel) in de lasergesneden gaten van de behuizingen persen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat magneten in de onderste en bovenste behuizing met tegengestelde polariteit worden geplaatst om magnetische aantrekkingskracht te garanderen (Figuur 6).
4. Fabricage van het stroomcircuit
NOTITIE: Het closed-loop stroomcircuit bevat twee monsterafnameflacons als reservoirs (Figuur 7). Het inlaatreservoir is voorzien van een polyvinylideendifluoride (PVDF)-filter om de celmedia in evenwicht te brengen met de CO2 - concentratie in de incubator.
- Gebruik een biopsiepons van 1 mm om twee gaten te maken in de dop van een injectieflacon voor monsterafname.
- Gebruik biopsieponsen om twee gaten (1 mm en 4 mm) te maken in de dop van een afzonderlijke injectieflacon voor monsterafname en maak een gat van 1 mm in het onderste deel van deze injectieflacon.
- Steek de doseerpunten van 20 G in elk van de gaten van 1 mm en sluit ze af met hete lijm.
- Plaats een PVDF-filter van 0,22 μm (zie Materiaaltabel) in het gat van 4 mm en sluit het af met hete lijm.
- Lasersnijd een acrylplaat van 1,5 mm met behulp van het ontwerp in aanvullend coderingsbestand 7 om een monsterhoudfase te maken.
- Plaats de reservoirs op de acryltafel.
- Sluit de doseertips aan met behulp van microstroomslangen (zie Materiaaltabel).
- Verbind de slangen met de inlaat en uitlaat van de flowmodule met behulp van 21 G doseertips.
- Gebruik een peristaltische pomp (zie Materiaaltabel) voor stromingscirculatie.
NOTITIE: Spuit- of pneumatische pompen kunnen desgewenst ook worden gebruikt om stroming te introduceren. Het debiet moet worden bepaald op basis van experimentele behoeften. Een uitgebreide tabel, afgeleid van een experimenteel gevalideerd COMSOL-model, is opgenomen in aanvullende tabel 1 om gebruikers te helpen bij het selecteren van het benodigde debiet om de gewenste schuifspanning op de celmonolaag16 te bereiken.
5. Cel zaaien
OPMERKING: Net als bij conventionele membraaninzetstukken kunnen verschillende celtypen op het nanomembraan worden gekweekt. Een secundair celtype kan ook worden gekweekt aan de andere kant van het membraan in het onderste kanaal15.
- Smeer het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in met 5 μg/cm2 fibronectine (zie materiaaltabel) om de celhechting te verbeteren.
OPMERKING: Het gekozen celtype kan van invloed zijn op de vereiste coating en celdichtheid. De hier beschreven procedure is voor endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's, zie Materiaaltabel). - Zuig de coatingoplossing op met behulp van een P200-pipet en plaats een patroonsjabloon in de kernmoduleput.
- Voeg mobiele media toe aan het put- en onderkanaal van het apparaat.
- Zaai HUVEC's met een dichtheid van 40.000 cellen/cm2 in de put.
OPMERKING: HUVEC's met deze dichtheid vormen doorgaans een confluente monolaag na 24 uur incubatie16,19. - Plaats het apparaat in een petrischaal. Voeg een conische buisdop van 15 ml met DI-water toe aan de petrischaal om de plaatselijke vochtigheid te behouden.
- Breng de petrischaal over naar de broedmachine.
NOTITIE: Mobiele media in de bovenste en onderste het kanaal van het apparaat moeten elke 24 uur worden vervangen. Om de media in het onderste kanaal te wijzigen, injecteert u voorzichtig nieuwe media in een van de poorten om de oude media uit de andere poort te verplaatsen.
6. Herconfiguratie naar microfluïdische modus
- Steriliseer de bovenste behuizing, de onderste behuizing, de stroommodule, de reservoirs, de slangen en de doseertips door ze 30 minuten voor de montage in een UV-sterilisatiekamer te plaatsen. Laat 70% ethanol circuleren en steriel PBS vervolgens in het stroomcircuit.
- Vul de reservoirs en buizen met groeimedia van endotheelcellen (zie materiaaltabel).
- Plaats de onderste behuizing op de monstertafel. Plaats de open-well kernmodule in de onderste behuizing.
- Zuig celmedia op uit de put van de module. Plaats de flowmodule in de put.
- Plaats de bovenste behuizing om de stromingsmodule goed af te dichten in de kernmodule. Sluit de inlaat- en uitlaatdoseertips aan op de poorten van de stroommodule.
- Start de peristaltische pomp om vloeistofstroom in het systeem te brengen.
7. Uitvoeren van stroomafwaartse analyses in open-well-formaat na stroomintroductie
OPMERKING: De kweektijd hier is afhankelijk van de experimentele doelen. Gebruikers kunnen stroomafwaartse analyses uitvoeren (bijv. Immunocytochemie, RNA-extractie) in de open-well- of microfluïdische formaten op basis van hun voorkeur. Als bijvoorbeeld de voorkeur wordt gegeven aan een open-well-formaat, moet het systeem opnieuw worden geconfigureerd om tests uit te voeren op basis van standaardprotocollen16,19.
- Stop de pomp wanneer de gewenste tijd voor blootstelling aan de afschuifstroom is bereikt. Verwijder de inlaat- en uitlaatdoseertips.
- Verwijder de bovenste behuizing. Verwijder de stroommodule voorzichtig uit de put met een pincet.
- Voeg 100 μL celmedia toe aan het putje. Voer gewenste tests uit op basis van standaardprotocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De open-well kernmodule wordt in eerste instantie gepositioneerd in een specifieke holte die wordt gecreëerd door een lagere behuizing en een dekglaasje, zoals geïllustreerd in figuur 6A. Vervolgens wordt de flowmodule, die een microkanaal en toegangspoorten bevat, in de put van de kernmodule gestoken. De stromingsmodule is stevig afgedicht tegen de siliconen steunlaag van het membraan vanwege de magnetische aantrekkingskracht tussen magneten die zijn ingebed in de onderste en bovenste behuizing, zoals afgebeeld in afbeelding 6B. Om de effectiviteit van dit magnetische vergrendelingsmechanisme te evalueren, werd een barstdruktest uitgevoerd, waaruit bleek dat het systeem bestand is tegen doodlopende drukken tot 38,8 ± 2,4 kPa. Deze druktolerantie is aanzienlijk hoger dan de typische werkdrukken die worden aangetroffen in celkweektoepassingen. Bovendien blijft het systeem lekvrij bij debieten tot 4000 μL/min, wat overeenkomt met een schuifspanning van 74 dynes/cm2 in het cultuurgebied16.
Bij het ontwikkelen van een platform dat kan schakelen tussen open-well- en microfluïdische modi, moet zorgvuldig worden nagedacht over de celseeding-benadering, die doorgaans geen probleem is voor conventionele statische open-well-platforms16. Schade aan de monolaag rond de kanaalgrens kan complicaties veroorzaken in de experimentele resultaten20. Om dit probleem aan te pakken, is een verwijderbaar stencil ontworpen dat in de open put van de kernmodule past en een specifiek venster biedt voor cellen om zich bij voorkeur op het membraanoppervlak te nestelen (Figuur 3). Zodra de monolaag van de cel een patroon heeft en samenvloeiing bereikt, heeft de gebruiker de flexibiliteit om het experiment voort te zetten in het open-well-formaat of het platform opnieuw te configureren in microfluïdische modus om de celmonolaag bloot te stellen aan fysiologische schuifspanning (Figuur 3). Het magnetische vergrendelingsmechanisme biedt de mogelijkheid om naar wens eenvoudig te schakelen tussen de open-well- en microfluïdische formaten. Het apparaat kan bijvoorbeeld worden teruggezet naar het open-well-formaat na een stroomstimulatie, waardoor gebruikers de flexibiliteit krijgen om een verscheidenheid aan tests uit te voeren (zoals immunokleuring, RNA-extractie en moleculaire permeabiliteitsmetingen) met behulp van standaard experimentele protocollen15,16.
In de fysiologische setting van het menselijk lichaam wordt de vasculaire barrière blootgesteld aan door stroming geïnduceerde schuifspanning, die dient als een belangrijke biofysische aanwijzing die de structuur en functie van de barrière beïnvloedt 5,21,22. De toevoeging van vloeistofstroom in microfysiologische systemen is dus een belangrijke vereiste. Om de veelzijdigheid van het platform te demonstreren, werd een HUVEC-monolaag opgesteld in een open-well-formaat met behulp van standaardprotocollen. Na 24 uur statische kweek werd het platform opnieuw geconfigureerd in microfluïdische modus om de celmonolaag gedurende 24 uur bloot te stellen aan 10,7 dynes/cm2 schuifspanning. De resultaten gaven aan dat cellen die onder stroming werden gekweekt, uitgelijnd langs de stroomrichting, terwijl cellen die zonder stroming werden gekweekt, willekeurig georiënteerd bleven (Figuur 8A,B). Na afschuifstimulatie werd het platform opnieuw geconfigureerd naar het open-well-formaat om RNA te extraheren met behulp van standaardprotocollen. De resultaten gaven aan dat de blootstelling van cellen aan schuifspanning resulteerde in de opregulatie van Kruppel-achtige factor 2 (KLF2) en endotheliale stikstofmonoxidesynthase (eNOS), die een cruciale rol spelen zoals antitrombotische en atheroprotectieve functies in gezonde bloedvaten23,24 (Figuur 8C).
Figuur 1: Vergelijking van in vitro vasculaire barrièremodellen. Schematische weergave van (A) conventionele Transwell-achtige inserts en (B) de open-well m-μSiM. Bright-field beelden van een confluente HUVEC-monolaag benadrukken het verschil in helderveldbeeldkwaliteit tussen een track-geëtst membraan en een ultradun nanomembraan. Schaalbalken = 100 μm. Aangepast van Mansouri et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stroomschema voor besluitvorming. Een stroomschema op basis van experimentele behoeften en stroomafwaartse analysevoorkeuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Experimentele workflow van het platform. (A) Om cellen direct op het poreuze membraan te plaatsen, wordt een verwijderbaar patroonsjabloon in het putje van de kernmodule gestoken (de inzet toont cellen met patronen, gele lijnen vertonen microkanaalgrenzen). (B) Het stencil kan worden bewaard of verwijderd in het apparaat voor statische celkweek. (C) Om het platform opnieuw te configureren in microfluïdische modus, wordt het stencil vervangen door de stroommodule. Door het magnetische afdichtingsmechanisme is de configuratie omkeerbaar; behuizingen en de stromingsmodule kunnen worden verwijderd om over te schakelen naar de open-well-modus. Schaalbalk = 200 μm. Aangepast van Mansouri et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schematische weergave van de mallen. (A) De sjabloonvorm. (B) Lasergesneden acrylplaat. (C) geassembleerde weergave van de sjabloonmal. (D) De mal van de stroommodule. (E) Lasergesneden acrylplaat. (F) Geassembleerde weergave van de mal van de stroommodule. Driehoekige kenmerken zijn uitlijningsmarkeringen om het bevestigen van acrylplaten aan de mallen te vergemakkelijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Schema van de klavervormige stroommodule. (A) De contactinterface tussen de stroommodule en de membraanchip. De inlaat- en uitlaatpoorten voor de vloeistofstroom worden in roze weergegeven. (B) 3D-beeld van de PDMS-stroommodule. Aangepast van Mansouri et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 6: Magnetische assemblage voor herconfiguratie van het apparaat. (A) Schematische demonstratie van componenten voor de herconfiguratie van het apparaat in microfluïdische modus. Ingebedde magneten met tegengestelde polen induceren aantrekkingskracht voor de afdichting. (B) Dwarsdoorsnede van het opnieuw geconfigureerde apparaat met het vasculaire kanaal in roze en het weefselcompartiment in groen. Aangepast van Mansouri et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Geassembleerde weergave van het stroomcircuit. Het circuit bestaat uit een peristaltische pomp, twee reservoirs voor de toevoer van celmedia en dempingsfluctuaties, slangen en een acryltrap om de componenten op hun plaats te houden. Aangepast van Mansouri et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Vergelijking van HUVEC's gekweekt in open-well- en microfluïdische modus. Cellen werden gezaaid en gedurende 24 uur in open put gekweekt om een confluente monolaag te vormen. Gedurende de daaropvolgende periode van 24 uur werd één set apparaten opnieuw geconfigureerd in microfluïdische modus. (A) Cellen gekweekt onder stroming (10,7 dynes.cm-2 schuifspanning) uitgelijnd in de stroomrichting (de inzet toont actine en celkernen in respectievelijk groen en blauw). (B) Cellen die zonder stroming in open-well-formaat werden gekweekt, vertoonden geen uitlijning. De lengte van de balken in radargrafieken toont het aantal cellen in de overeenkomstige richting. (C) Cellen die onder stroom werden gekweekt, vertoonden een hogere opregulatie van KLF2- en eNOS-genen in vergelijking met de no-flow-conditie (**p < 0,01, n = 3, gemiddelde ± SD). Schaalbalken = 100 μm. Aangepast van Mansouri et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Schuifspanning op het oppervlak van het nanomembraan bij verschillende stroomsnelheden. Deze tabel geeft informatie over schuifspanningswaarden op het oppervlak van het nanomembraan bij verschillende stroomsnelheden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 1: CAD-model van de sjabloonmal. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 2: CAD-model van lasergesneden holtes voor de sjabloonmal. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 3: CAD-model van de flowmodule. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 4: CAD-model van lasergesneden holtes voor de matrijs van de stroommodule. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 5: CAD-model van de bovenste behuizing. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 6: CAD-model van de onderste behuizing. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 7: CAD-model van de acrylfase. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van dit protocol is om een praktische methode te ontwikkelen voor het integreren van stromingsmogelijkheden in een open-well platform met een ultradun nanomembraan. In dit ontwerp wordt gebruik gemaakt van een magnetische vergrendelingsbenadering, waardoor tijdens experimenten kan worden geschakeld tussen open-well- en fluïdische modi en de voordelen van beide benaderingen kunnen worden gecombineerd. In tegenstelling tot conventionele permanent gebonden platforms, maakt magnetische vergrendeling het mogelijk om het platform op geschikte punten te demonteren tijdens de experimentele workflow 16,25,26,27. In dit platform worden cellen gezaaid en wordt de barrière tot stand gebracht in het bekende open-well-formaat, en vervolgens wordt het systeem opnieuw geconfigureerd naar een fluïdische modus door simpelweg een stroommodule toe te voegen en deze magnetisch af te sluiten. Deze herconfiguratie biedt twee belangrijke voordelen: ten eerste maakt het de simulatie van fysiologische omstandigheden mogelijk door de monolaag van de cel bloot te stellen aan door vloeistof veroorzaakte schuifspanning; Ten tweede vergemakkelijkt het de introductie van secundaire componenten zoals immuuncellen onder stromingsomstandigheden16. De magnetische vergrendelingsfunctie biedt een montagemethode zonder gereedschap, waardoor on-demand schakelen tussen open-well- en microfluïdische formaten mogelijk is. Bijgevolg kunnen stroomafwaartse analyses, zoals immunocytochemie en RNA-extractie, worden uitgevoerd in het bekende open-well-formaat met behulp van standaardtechnieken of met behulp van microfluïdische technieken naar wens16.
Magnetische afdichting is een kritische parameter van het ontwerp die de herconfigureerbaarheid van het platform mogelijk maakt, en daarom zijn er verschillende overwegingen nodig voor de nauwkeurige functie ervan: (1) De hoogte van de onderste behuizing moet overeenkomen met de hoogte van de kernmodule (tolerantie: ±0,1 mm) om de module goed te omsluiten. (2) De hoogte van de stroommodule moet iets hoger zijn dan de put van de kernmodule (0-0.1 mm). (3) Dit ontwerp is aanpasbaar aan een breed scala aan materialen en vereist niet dat de stroommodule wordt gemaakt van elastomeermaterialen. Het cruciale element is het opnemen van een zacht, pakkingachtig materiaal op het grensvlak tussen de stroommodule en de membraanchip om een betrouwbare afdichting tot stand te brengen. (4) De diameter van de lasergesneden holtes in de behuizingen voor persmagneten moet worden geoptimaliseerd op basis van het gebruikte instrument28. Magneten kunnen losraken en leiden tot stroomlekkage als de diameter van de holte te groot is, of behuizingen kunnen barsten tijdens het inbrengen van de magneet als de holtes te klein zijn. Door de bovengenoemde overwegingen te volgen, kan de hier geïntroduceerde magnetische assemblagebenadering worden toegepast om andere open-well-systemen opnieuw te configureren in microfluïdische modus.
Om de herconfiguratiemogelijkheid te hebben, is het noodzakelijk om een patroonsjabloon te gebruiken waarmee cellen nauwkeurig op het membraanoppervlak kunnen worden geplaatst. Het sjabloon zorgt ervoor dat er zich geen cellen buiten het poreuze kweekgebied bevinden (d.w.z. op het siliciumondersteuningsgebied), die kunnen worden beschadigd bij het inbrengen van de stroommodule. Dit aspect wordt met name cruciaal in co-cultuurmodellen omdat cellen die per ongeluk op onbedoelde locaties worden gezaaid, niet actief kunnen deelnemen aan de ontwikkeling van het barrièreweefsel. Desalniettemin worden deze misplaatste cellen meestal opgehaald tijdens het lysisproces en kunnen ze mogelijk vooringenomenheid introduceren in genexpressiestudies die interacties tussen cellen over het membraan onderzoeken20. Open-well cell seeding met behulp van het stencil verbetert de seeding-efficiëntie door celverliezen langs het stroompad te verminderen, die inherent zijn aan conventionele microfluïdische platforms 4,16. Dit platform is ook in staat om meerdere celtypen en ECM-materialen op te nemen 15,16,17. Een met cellen beladen hydrogel kan bijvoorbeeld in het onderste kanaal van het apparaat worden geïnjecteerd om het weefselcompartiment na te bootsen, terwijl een endotheel bovenop het membraan wordt gevestigd.
Hoewel de magnetische modules en componenten kunnen worden hergebruikt, kan het handhaven van een effectieve afdichting bij verschillende toepassingen een probleem zijn omdat de magneten in de behuizing losraken en de afdichtingskracht verminderen. Dit probleem kan worden verholpen door voor elk experiment nieuwe gelamineerde modules te maken of componenten in massa te produceren met behulp van spuitgiet- of 3D-printtechnieken zodra de ontwerpen zijn vastgesteld. Bij de methode die in dit protocol wordt beschreven, wordt de flowmodule handmatig in de kernmodule geplaatst en zijn de multiplexing- en automatiseringsmogelijkheden van het systeem beperkt. Om de experimentele doorvoer te verbeteren, kunnen de stromingsmodule en de bovenste behuizing worden geïntegreerd in één functionele module met interne routeringskanalen en gestandaardiseerde slangverbindingen die tegelijkertijd meerdere modules parallel doordringen.
Componenten van de open-well kernmodule worden in massa geproduceerd en zijn in de handel verkrijgbaar. Andere componenten van het systeem, zoals de stroommodule, behuizingen en patroonstencil, kunnen ook op grote schaal worden vervaardigd. Bovendien maakt de herconfigureerbaarheid van het platform de toevoeging van sensoren en actuatoren mogelijk (bijv. transendotheliale elektrische weerstandsmodule, elektroporatiemodule) voor real-time stimulatie en metingen. Over het algemeen combineert dit platform conventionele en microfluïdische benaderingen om wijdverbreid gebruik buiten technische laboratoria te ondersteunen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.L.M. is mede-oprichter van SiMPore, Inc. en heeft een aandelenbelang in het bedrijf. SiMPore commercialiseert de ultradunne op silicium gebaseerde technologieën, inclusief de membranen die in deze studie worden gebruikt.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door het National Institute of Health onder de toekenningsnummers R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 en NSF-subsidie CBET 2150798. De auteurs bedanken de RIT Machine Shop voor de fabricage van aluminium matrijzen. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
References
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E.
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
