Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

גידול אקסני Delia antiqua עם דיאטות סטריליות מותססות למחצה

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/66259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), 2Agriculture and Rural Bureau of Changqing District

Summary

מתואר הליך פשוט לגידול אנטיקווה דליה אקסנית עם דיאטות סטריליות מותססות למחצה. רק זן וולבכיה אחד זוהה בכל כוכב של אקסני D. antiqua באמצעות PCR.

Abstract

חרקים אקסניים מתקבלים ממערכות גידול מלאכותיות סטריליות באמצעות מדיה סטרילית. חרקים אלה, המאופיינים בגודלם הקטן, מחזור הגידול הקצר שלהם ודרישות המזון הנמוכות שלהם, אידיאליים לחקר הקשר בין מיקרואורגניזמים לפונדקאים. מיקרוביוטת המעיים משפיעה באופן משמעותי על המאפיינים הפיזיולוגיים של פונדקאי החרקים, והחדרת זנים ספציפיים לחרקים אקסניים מספקת שיטה לאימות תפקודי חיידקי המעי. דליה אנטיקווה (Delia antiqua), מזיק מאיים ממשפחת הדיפטרה, משפחת האנתומיים (Anthomyiidae) והסוג דליה (Delia), ניזון בעיקר מבצל, שום, כרישה וירקות אחרים ממשפחת השושנים. הזחלים שלו ניזונים מהפקעות וגורמים לריקבון, נבילה ואפילו מוות של צמחים שלמים. על ידי גידול זחלים אקסניים, ניתן לערוך מחקרי מעקב כדי לבחון את ההשפעות של microflora במעיים על הצמיחה וההתפתחות של D. antiqua. בניגוד לשיטה הכרוכה בסילוק אנטיביוטיקה של חיידקים קשורים, מאמר זה מציג גישה בעלות נמוכה וביעילות גבוהה להעלאת D. antiqua אקסני. לאחר עיקור פני השטח של ביצי D. antiqua , נעשה שימוש בתזונה סטרילית מותססת למחצה לגידול זחלים, והמצב האקסני של D. antiqua אומת באמצעות בדיקות תלויות תרבית ובלתי תלויות תרבות. לסיכום, השילוב של עיקור ביצי חרקים והכנת תזונה סטרילית לתרבית זחלים איפשר פיתוח שיטה יעילה ופשוטה לקבלת D. antiqua אקסני. שיטה זו מספקת גישה רבת עוצמה לחקר אינטראקציות חרקים-מיקרופלורה.

Introduction

בעלי חיים אקסניים, המוגדרים כבעלי חיים שבהם לא ניתן לזהות מיקרואורגניזמים או טפילים בני קיימא, הם מודלים ניסיוניים רבי ערך לחקר אינטראקציות בין פונדקאי למיקרואורגניזם 1,2. חרקים, הקבוצה הגדולה ביותר של חסרי חוליות, יכולים ליצור יחסים סימביוטיים עם מיקרואורגניזמים3. חרקים אקסניים יכולים לשמש לחקר אינטראקציות פונדקאי-סימביונט במערכות סימביוטיות4. לדוגמה, Nishide et al.5 ביססו הליך גידול סטרילי מעשי עבור תולעת הריח הרע Plautia stali, המאפשר ניתוח אמין וקפדני של אינטראקציות סימביוטיות-מארח במערכות סימביוטיות מודל. חרקים אקסניים יכולים להיווצר על ידי עיקור שלב הביצה ומתן מזון סטרילי לזחלים ולמבוגרים 6,7. חרקים אקסניים הם בעלי חשיבות רבה והם נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביולוגי. לדוגמה, מחקר שנערך על ידי Somerville et al.8 הראה כי עש היהלומים שחוסנו בגלימת Enterobacter שיפרו את יכולת ההסתגלות של זכרים טרנסגניים.

דליה אנטיקווה מייגן הוא מזיק חשוב מבחינה כלכלית של בצל וגידולים אחרים של שושנים ברחבי העולם, כאשר הזחלים שלו פוגעים בפקעות הבצל ובגידולים אחרים של שושנים9. D. antiqua מצוי בעיקר באקלים ממוזג והוא נפוץ באזורי גידול בצל באמריקה, אירופה ואסיה. אם אינו נשלט כראוי, הוא עלול לגרום לאובדן יבולים בבצל (Allium cepa L.), שום (Allium sativum L.), שאלוט (Allium fistulosum L.) וכרישה (Alliumchoenoprasum L.) בטווח של 50% עד 100%10,11. הזחלים ניזונים מהחלקים שמתחת לפני הקרקע של הצמחים, והאכלה זו גורמת לשתילים לנבול ולבסוף למות. בנוסף, צמחים פגומים יכולים לאפשר לפתוגנים להיכנס, מה שמוביל לנורה נרקבת12. גם אם הצמחים אינם נצרכים לחלוטין על ידי הזחלים, הנזק שהם גורמים הופך את צמחי הבצל לבלתי סחירים וגורם להפסדים כלכליים.

חרקים קשורים קשר הדוק למיקרוביוטה של המעי, ורוב מעי החרקים מכילים מגוון חיידקים סימביוטיים שמשגשגים על חומרי המזון שמספק הפונדקאי13,14. Jing et al.15 הראו כי התפקיד העיקרי של הקהילה הסימביוטית של המעי הוא לספק חומרים מזינים חיוניים, ולאחר מכן פונקציות הקשורות לעיכול וניקוי רעלים. במקרים מסוימים, חיידקי המעיים יכולים לשמש כמשאב מיקרוביאלי למטרות הדברת מזיקים. כתוצאה מכך, רצוי לחקור את הביצועים של חיידקי המעיים הבודדים ואת תפקודיהם הספציפיים בגוף של D. antiqua. לכן, הכנת זחלים אקסניים חשובה במיוחד לחקר יחסי הגומלין בין זני חיידקים ספציפיים לבין חרקים16. כיום, שיטה נפוצה לסילוק חיידקי מעיים של חרקים היא שימוש בשילוב אנטיביוטי כדי לחסל את המיקרובים הקשורים 17,18,19. בניגוד לשימוש באנטיביוטיקה בלבד, שיכולה רק להפחית את מספר המיקרואורגניזמים, גידול אקסני של חרקים מאפשר שליטה על הרכב וכמות המיקרואורגניזמים, מה שמאפשר אימות מדויק יותר של תפקוד מיקרוביוטת המעי.

לפיכך, מאמר זה מציג פרוטוקול להכנת וגידול אקסני D. antiqua. מזון זחל אקסני מתקבל על ידי שימוש בעיקור בטמפרטורה גבוהה של דיאטות טבעיות בשילוב עם מזונות מותססים למחצה. הביצים מעוקרות בעקבות פרוטוקול ניסיוני לקבלת ביצים אקסניות, ולבסוף, זחלים אקסניים מתורבתים מהביצים האקסניות. מערכת הגידול האקסנית בוצעה במשך דור אחד בלבד לצורך הניסוי. זה יספק נוחות לחקר האינטראקציה בין חרקים למיקרוביוטה של המעיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

D. antiqua מתקבלים משדה Fanzhen, Taian.

1. הכנת דיאטות סטריליות

  1. מקלפים את השכבות החיצוניות של בצל ירוק ומשליכים את העלים הירוקים. שמרו על החלק הלבן של בצל ירוק (איור 1A) ושטפו אותם במים סטריליים, תוך חזרה על תהליך השטיפה שלוש פעמים. חתכו את החלק הלבן של בצל ירוק לחתיכות חתוכות בקוטר 1-2 ס"מ באמצעות מספריים (ראו טבלת חומרים) מעוקרים בתמיסת 75% EtOH (מוזכרת בשלב 2.5) לשימוש מאוחר יותר.
  2. שוקלים 50 גרם של בצל ירוק קצוץ ומכניסים אותם למעבד מזון (ראו טבלת חומרים). מוסיפים 50 מ"ל מים מעוקרים וטוחנים אותם חמש פעמים למשך 2 דקות כל אחד. כל הבצל הירוק החתוך לקוביות צריך להיות טחון למרקם דמוי משחה (איור 2A).
  3. השתמשו בפינצטה כדי להעביר 10 חתיכות זחלי כוכב 3rd של D. antiqua לתוך צינור צנטריפוגה 10 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 1x PBS, וטחנו אותם עם מזיק טחינה חד פעמי (ראה טבלת חומרים) במשך כ 5 דקות כדי לקבל נוזל טחינת הזחל.
  4. יוצקים את נוזל הבצל והזחל לבקבוק חרוטי נקי של 500 מ"ל (ראו טבלת חומרים). עטפו את פי הבקבוק החרוטי בשתי שכבות של סרט איטום שקוף, ולאחר מכן הניחו את הבקבוק באינקובטור רועד (ראו טבלת חומרים) לתסיסה ב-25°C וב-180 סל"ד במשך 12 שעות (איור 2B).
  5. גזרו שבע שכבות של גזה מרובעת עם דפנות של 10 ס"מ (אין צורך בסטריליות) עם מספריים וערמו אותן יחד ליצירת מכשיר סינון פשוט. יוצקים באיטיות את נוזל הבצל המותסס על הגזה וסוחטים את הנוזל המסונן לתוך בקבוק חרוטי חדש של 500 מ"ל. עוטפים את שאריות הבצל על הגזה בנייר כסף לשימוש מאוחר יותר.
  6. סננו את התסנין שהתקבל בשלב הקודם באמצעות משאבת ואקום (ראו טבלת חומרים) ומשפך בוכנר. הניחו את נייר הסינון שנרטב על ידי מים נטולי יונים, על משפך בוכנר, ולאחר מכן שפכו את התסנין ובצעו סינון יניקה שלוש פעמים עם נייר סינון שונה. לאסוף את התסנין הסופי בבקבוק חרוטי 500 מ"ל.
  7. בצע סינון נוסף באמצעות בקבוק מסנן 0.22 מיקרומטר ומשאבת ואקום. הבריגו את כיסוי בקבוק מסנן היניקה בספסל נקי במיוחד (ראו טבלת חומרים) לשימוש נוסף. בשלב זה מתקבלים שאריות הבצל המותסס והתסנין (איור 2C).
    הערה: הנוזל המסונן המתקבל משלב זה יהיה סטרילי. (בקבוק מסנן 0.22 מיקרומטר הוא מערכת סינון ואקום סטרילית לעיקור התסנין).
  8. חזור על השלבים הקודמים כדי להשיג שאריות בצל ירוק לא מותסס ולסנן. כאן ההבדל הוא שהתסיסה אינה נחוצה.
  9. שוקלים 0.24 גרם כולין כלוריד ו-0.56 גרם חומצה L-אסקורבית (ראו טבלת חומרים) בצינור צנטריפוגה בנפח 10 מ"ל. מוסיפים 3 מ"ל של מים נטולי יונים, ומנערים במרץ עד שהם מומסים לחלוטין. בספסל האולטרה נקי, השתמש במזרק חדש של 5 מ"ל וחבר שלושה מסנני מזרק 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) כדי לעקר את התמיסה, והכנס אותה לצינור צנטריפוגה סטרילי של 10 מ"ל לשימוש מאוחר יותר.
    הערה: כולין כלוריד הוא מוליך עצבי חיוני לצמיחת חרקים, בעוד חומצה L-אסקורבית פועלת כחומר משמר.
  10. שוקלים 2 גרם אבקת אגר ו-6 גרם TSB (ראו טבלת חומרים) ויוצקים אותם לצלוחית חרוטית בנפח 500 מ"ל. לאחר מכן להוסיף 100 מ"ל של מים deionized כדי להכין את המדיום התרבות. לאחר שטיפת מוט הזכוכית במים נטולי יונים, השתמשו בו כדי לערבב את התערובת עד שהיא מעורבבת היטב. לאחר מכן, אטמו את הבקבוק החרוטי באמצעות שתי שכבות של סרט איטום שקוף.
  11. עטפו את בצל ירוק מותסס ובצל ירוק לא מותסס (המוזכרים בשלב 1.5 ושלב 1.8) ברדיד אלומיניום ועקרו אותם, יחד עם מדיום התרבית, באוטוקלאבה בטמפרטורה של 121°C למשך 20 דקות.
  12. בספסל הנקי במיוחד, שפכו את כולין כלוריד מעוקר, חומצה L-אסקורבית ותסנין סטרילי למדיום התרבית תוך ערבול עדין כדי לערבב אותם היטב. לבסוף, מוסיפים את בצל ירוק מותסס ולא מותסס ולנער במרץ ביד כדי לקבל את הדיאטות הסטריליות. שפכו את הדיאטות לתוך צינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל (סטריליים; מכסה אוורור עם קרום הידרופובי PVDF של 0.22 מיקרומטר) (ראו טבלת חומרים) בזווית (איור 2D).
    הערה: לאחר עיקור, הטמפרטורה של מדיום התרבית צריכה להישמר בין 65-80 מעלות צלזיוס כדי למנוע קירור והתמצקות מהירים בעת הוספת בצל ירוק או מרכיבים אחרים. חוץ מזה, בכל צינור, לשפוך כ 10-15 מ"ל של דיאטות. לאחר הדיאטות התמצקו, לאחסן את הצינורות במקרר ב 4 ° C, אם זה לא בשימוש מיידי.

2. רכישת ביצים אקסניות

  1. מערכת גידול מעבדה עבור D. antiqua
    1. הניחו כלוב גידול באינקובטור פנימי מואר LED בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס (24 שעות במחזור, היחס בין האור לחושך הוא 16:8) לבוגרים זכרים ונקבות אחוריים, מה שמאפשר להם להזדווג ולהטיל ביצים. מלאו את מתקן המים (איור 1B) במים ואטמו אותו בצמר גפן לח כדי לספק מים למבוגרים.
    2. מניחים ארבע תחתיות צלחת פטרי בגודל 35 מ"מ x 12 מ"מ במכסה צלחת פטרי בגודל 94 מ"מ x 16 מ"מ. הרטיבו את צמר הגפן במים מיוננים ולאחר מכן הניחו צמר גפן לח על שתיים מתחתיות צלחת הפטרי, ומעל צמר הגפן הוסיפו כף אחת של סוכרוז.
    3. מלאו את שתי תחתיות צלחת הפטרי האחרות בשתי כפות של סוכרוז ותמצית שמרים (ראו טבלת חומרים), אשר משמשים מזון לחרקים בוגרים (איור 1C).
      הערה: אין צורך לעקר את תמצית הסוכרוז והשמרים המוזכרת בשלב 2.1.2 ובשלב 2.1.3.
    4. הכניסו לכלוב הזבובים תחתית צלחת פטרי בגודל 94 מ"מ על 16 מ"מ שהכילה חול לח וחתיכה של שן שום קלופה ללא שורשים (איור 1D) כדי לאסוף ביצים. הנקבה תימשך לריח השום ותטיל ביצים סביבו.
  2. איסוף ביצים
    1. הוציאו מהכלוב את מכשיר האוביפוזיציה, שהוא צלחת פטרי בגודל 94 מ"מ על 16 מ"מ המכילה חול ושום שהוזכרו לעיל (שלב 2.14). יוצקים את החול יחד עם השום לכוס של 500 מ"ל, ומשתמשים במי ברז כדי לשטוף את הביצים הנותרות מהשום לתוך הכד. בשלב זה, הביצים צפות במים.
    2. קחו מסננת של 100 רשתות (ראו טבלת חומרים), והרטיבו אותה במי ברז. לאחר מכן שופכים את המים המכילים את הביצים הצפות מהכוס על המסננת. הביצים יישארו על המסננת.
    3. לאחר שהביצים מתייבשות באופן טבעי על המסננת, השתמשו במברשת כדי לטאטא בעדינות את הביצים על צלחת פטרי.
  3. ביום הראשון, לשטוף את מכשיר oviposition כדי לאסוף את הביצים ללא חיטוי או עיקור. ביום השני בשעה ארבע אחר הצהריים, שטפו שוב את הביצים ואספו אותן על ידי ניפוין במים נקיים.
    הערה: איסוף הביצים ביום השני נועד להבטיח קצב גדילה עקבי בשלבים הבאים. ארבע אחר הצהריים הוא שיא הטלת הביצים של ד. אנטיקווה. לכן, זה אידיאלי לאסוף את הביצים בשלב זה.
  4. הניחו את הביצים שנאספו על מסננת תאים סטרילית (ראו טבלת חומרים) בספסל האולטרה-נקי (איור 3A).
  5. הכינו את הפתרון לעיקור ביציות
    1. קח 5 מ"ל של 5.2% NaClO (ראה טבלת חומרים) והעבר אותו לתוך בקבוק חרוטי מעוקר 250 מ"ל. הוסף 95 מ"ל של מים מעוקרים כדי ליצור נפח כולל של 100 מ"ל, וכתוצאה מכך תמיסת NaClO של 0.26%.
    2. כדי להכין תמיסת 75% EtOH, קח 75 מ"ל של 99.7% EtOH והעבר אותו לצלוחית חרוטית מעוקרת של 250 מ"ל. הוסף 25 מ"ל של מים מעוקרים כדי ליצור נפח כולל של 100 מ"ל, וכתוצאה מכך תמיסת EtOH 75%.
  6. יוצקים 30 מ"ל NaClO לתוך צלחת פטרי ויוצקים 30 מ"ל EtOH לתוך צלחת פטרי אחרת. הניחו את מסננת התא המכילה ביצים שהוזכרו בשלב 2.4 לתוך צלחת המכילה NaClO. השרו אותו בתמיסת NaClO 0.26% למשך 0.5 דקות. לאחר מכן מעבירים את המסננת לצלחת המכילה EtOH, ומאפשרים לה להשרות בתמיסת 75% EtOH למשך 0.5 דקות נוספות.
  7. חזור על תהליך זה שלוש פעמים, לסירוגין בין 0.26% NaClO ו- 75% EtOH כל 0.5 דקות. לאחר מכן, ביצים axenic יתקבלו. בשלב זה, המסננת המכילה את הביצים צריכה להיות שקועה ב- EtOH.
    הערה: כדי להבטיח עיקור יסודי, השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לשאוף NaClO ו EtOH ולפזר את הביצים. חזור על תהליך השטיפה מספר פעמים. שלב זה ינקה עוד יותר את פני השטח של הביצים משאריות חיידקים וזיהומים, ויבטיח משטח נקי וסטרילי.

3. גידול זחלים אקסניים

  1. כדי להעביר את הביצים המעוקרות, השתמשו בזוג מספריים שעוקרו באמצעות מנורת אלכוהול כדי לחתוך את קצה הקצה של פיפטה בנפח 1 מ"ל (איור 3B). יש לוודא שהפתח הסופי של הפיפטה החתוכה גדול מקוטר הביצים (כ-2 מ"מ). לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי להעביר את הביצים מתמיסת EtOH (ביצים יחד עם התמיסה) (איור 3C) לצינור צנטריפוגה שמכיל את התזונה הסטרילית, וכל צינורית צריכה להכיל בערך 20-50 ביצים (איור 3D). חזור על תהליך זה עד שכל הביציות הועברו.
    הערה: קוטר קצה הפיפטה צריך להיות גדול ככל האפשר כדי למנוע שבירת הביצים במהלך ההעברה, מה שעלול להוביל למותן.
  2. השתמש פיפטה כדי להסיר כל עודף אתנול מן הצינור. הניחו את צינור הצנטריפוגה סגור במכסים בתוך שקית אטימה עצמית, והניחו חתיכת כותנה בפתח השקית כדי לאפשר זרימת אוויר. לבסוף, הניחו את השקית בתוך אינקובטור של 25 מעלות צלזיוס (לחות יחסית: 50%-70%; תקופת צילום: 16 שעות אור: 8 שעות כהות) לתצפית וטיפוח.
  3. כשלושה ימים לאחר מכן, הביצים הגרזניות בתזונה מתחילות לבקוע (איור 4A). הזחלים שבקעו יהיו פעילים ופני השטח של הדיאטות הסטריליות כבר לא יהיו חלקים. הזחלים יתחילו להיזון מהדיאטות.
  4. המשיכו להתבונן בזחלים עד שהם מגיעים לשלב של זחליאינסטאר 2. המשך לעקוב אחר צמיחתם והתפתחותם בתקופה זו.
  5. לאחר 9-12 ימים, יותר מ-80% מהביצים התפתחו לזחלי כוכבשלישי (איור 4B). זה מצביע על צמיחה מוצלחת ופיתוח של הזחלים.

4. תיקוף של זחלים אקסניים עם בדיקות תלויות תרבית

  1. בחר באופן אקראי שלושה זחלי כוכב 3אקסניים מצינור הצנטריפוגה.
  2. מניחים את הזחלים בכלי פטרי בגודל 94 מ"מ על 16 מ"מ המכיל 75% אלכוהול לניקוי. לאחר מכן, להעביר אותם למיכל עם מים סטריליים לשטיפה נוספת.
  3. השתמשו במלקחיים מנתחים מחוטאים שעברו עיקור בתמיסת 75% EtOH כדי לתפוס את הזחלים (הראש והזנב מוצגים באיור 5A). השתמשו במספריים מנתחים כדי להסיר את קצות הראש והזנב (איור 5B). החזיקו את זנב הזחלים עם המלקחיים והשתמשו במלקחיים נוספים כדי לסחוט בעדינות מהזנב לראש ולחלץ את האיברים הפנימיים (התוצאה שמוצגת באיור 5C). הניחו את האיברים הפנימיים במים שעברו דה-יוניזציה ומשכו בעדינות את המעי על-ידי לחיצה על רקמת השומן בעזרת מלקחיים, והניחו את האיברים הפנימיים שחולצו (איור 5D) במים סטריליים לשימוש נוסף.
  4. הכניסו את המעי לצינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל, הוסיפו 500 מיקרוליטר של חיץ PBS 1x מעוקר, והשתמשו במזיק חד פעמי כדי לטחון את רקמת המעי להומוגנאט.
  5. קח 100 μL של homogenate ולהוסיף אותו למדיום אגר מזין. השתמשו בפיזור בצורת L (ראו טבלת חומרים) לציפוי צלחת האגר.
  6. מניחים את צלחת הפטרי באינקובטור ביוכימי ב 28 מעלות צלזיוס ודגרים במשך 72 שעות כדי לצפות בצמיחת מושבות.

5. תיקוף של זחלים אקסניים עם בדיקות תלויות תרבית

  1. יש לחלץ את הדנ"א הכולל מרקמת המעיים של זחלים אקסניים באמצעות ערכת מיצוי DNA (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
  2. למדוד את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV.
  3. בצע תגובת PCR באמצעות פריימרים אוניברסליים של rRNA 16S חיידקי (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). נפח התגובה הכולל הוא 25 μL, והוא מורכב מתבנית DNA 1 μL, פריימר קדמי 0.5 μL, פריימר הפוך 0.5 μL, 10.5 μL ddH2O ו- 12.5 μL 2x Taq PCR Master Mix (ראה טבלת חומרים). הגדר את תנאי תגובת ה- PCR כדלקמן: דנטורציה ראשונית ב- 94 ° C למשך 3 דקות; 35 מחזורים של דנטורציה ב 94 ° C במשך 30 שניות, חישול ב 55 ° C במשך 30 שניות, והארכה ב 72 ° C במשך 90 שניות; הארכה סופית ב-72°C למשך 10 דקות. אחסנו את מוצרי ה-PCR בטמפרטורה של 4°C לניתוח נוסף.
  4. בצע תגובת PCR באמצעות פריימרים אוניברסליים של ITS פטרייתיים (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). נפח התגובה הכולל הוא 25 μL, והוא מורכב מתבנית DNA 1 μL, פריימר קדמי 0.5 μL, פריימר הפוך 0.5 μL, 10.5 μL ddH2O ו- 12.5 μL 2x Taq PCR Master Mix. הגדר את תנאי ה-PCR ל-95°C למשך 5 דקות; 35 מחזורים של 95 ° C במשך 30 שניות, 55 ° C במשך 1 דקות, ו 72 ° C עבור 90 שניות; ואחריו 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אחסנו את מוצרי ה-PCR בטמפרטורה של 4°C לניתוח נוסף.
  5. השתמש בצבע חומצת גרעין סופר ירוק (ראה טבלת חומרים) כדי לערבב עם כל אחד משני סוגי מוצרי PCR באופן שווה, ולנתח אותם על ידי אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1% במאגר 1x TAE (מדולל מ 50x TAE, ראה טבלה של חומרים). השתמש 3 μL של סמן DNA (ראה רשימת חומרים) כהפניה.
  6. השתמש בטרנסילמייטור UV כדי להתבונן בג'ל ולאתר את שבר המטרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שלבי החיים של D. antiqua מתוארים באיור 4. מחזור החיים המלא כולל ביצים, זחלים, גולמים (איור 4C) ובוגרים (איור 4D). הם מעובדים בצינורות צנטריפוגות סטריליים, ולא ניתן להבחין בין הופעתם ושיעור הישרדותם לבין D. antiqua הגדל בתנאים שאינם ציריים. את זמני הצמיחה וההתפתחות של כל שלב ב-D. antiqua ניתן למצוא באיור 6. שלב הביצה של D. antiqua שאינו מגודל באופן אקסני הוא 2.83 ± 0.29 ימים, וזה של D. antiqua גדל באופן אקסני הוא 2.83 ± 0.29 ימים, ללא הבדל משמעותי בין השניים ( t עצמאי, t = 0.00, p = 1.00). שלב הזחל הרגיל נמשך 13.83 ± 0.76 ימים, ואילו שלב הזחל האקסני נמשך 14.50 ± 0.50 ימים, ללא הבדל משמעותי בין השניים ( מבחן t עצמאי, t = 1.27, p = 0.27). שלב הגלמים של D. antiqua הוא 17.33 ±-0.76 ימים, וזה של D. antiqua הוא 18.00 ±-0.50 ימים, ללא הבדל משמעותי בין השניים ( מבחן t עצמאי, t = 1.27, p = 0.27). זמן ההישרדות של מבוגרים הוא 81.50 ±-1.00 ימים לגידול רגיל ו-80.33 ±-0.76 ימים לגידול אקסני, ללא הבדל משמעותי בין השניים ( מבחן t עצמאי, t = 1.61, p = 0.18). ניתן לראות כי אין הבדל משמעותי בזמן ההתפתחות בין D. antiqua אקסני לבין אלה שגדלו בתנאים רגילים.

בדיקות תלויות תרבית הראו שלא זוהו מושבות במעי הזחל (איור 7). יתר על כן, ניתוח PCR המבוסס על rRNA 16S חיידקי גילה נוכחות של רצועה בסביבות 1500 bp (איור 8A), שזוהתה כוולבכיה (מספר ההצטרפות של GenBank לרצף הנוקלאוטידים הזה הוא: OR564190), חיידק אנדוסימביוטי. עם זאת, לא נצפו פסים בניתוח ה-PCR שהתמקדו באזורי ITS פטרייתיים (איור 8B). זה מצביע על כך שהזחלים הגיעו למצב אקסני. לזחלים אקסניים חשיבות רבה לחקר מנגנוני האינטראקציה בין D. antiqua לבין מיקרואורגניזמים, כמו גם למניעה ובקרה של הנזק שנגרם על ידי D. antiqua.

Figure 1
איור 1: מכשירי הגידול והמזון של D. antiqua. (A) החלק הלבן של הבצל עבור הזחלים. (B) מתקן מים למבוגרים. (ג) מזון למבוגרים. (ד) מכשיר איסוף לביצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מרכיבי הכנת הדיאטות. (A) בצל ירוק טחון. (B) בצל ירוק מותסס. (C) שאריות צדפות מותססות ותסנין. (ד) דיאטות מוכנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תהליך העברת הביציות. (A) ביצים במסננת התא. (B) פיפטה בנפח 1 מ"ל ללא קצה קצה. (C) 1 מ"ל פיפטה עם ביצים. (ד) ביצים המועברות לדיאטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שלבי החיים של אקסני D. antiqua. (A) ביצים. (B) זחלים. (ג) פופה. (ד) נשים וגברים בוגרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תהליך ניתוח מעי הזחל. (A) הראש והזנב של הזחל. (B) הזחל עם הראש והזנב מוסרים. (C) רקמות מעיים וגוף מופרדות. (D) מעי שלם לאחר נתיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: זמן ההתפתחות של כל שלב גדילה של D. antiqua שגדל באופן נורמלי וגדל באופן אקסני. אין הבדל משמעותי בזמן ההתפתחות בין גידול אקסני לבין גידול רגיל D. antiqua. מבחן t עצמאי, עמ' < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: אישור הסטריליות של D. antiqua על-ידי בחירה אקראית של שלושה זחלים ודגירה על הומוגנטים במעיים על לוחות אגר TSA ו-PDA. לא נצפו חיידקים בזחלים שניזונו מתזונה סטרילית. (A) זחלים אקסניים ב-TSA. (B) זחלים רגילים ב-TSA. (C) זחלים אקסניים על מחשב כף יד. (D) זחלים רגילים במחשבי כף יד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: אישור הסטריליות של D. antiqua על-ידי ניתוח PCR באמצעות פריימרים אוניברסליים של 16S rRNA ופריימרים פטרייתיים של ITS. רצועת המטרה של הגן 16S rRNA היא ~ 1,500 bp. רצועה של כ-1500 bp נצפתה וזוהתה כחיידק האנדוסימביוטי Wolbachia. רצועת היעד של הגן ITS היא 500-750 bp. לא נצפתה רצועת מטרה בקבוצות המיקוד האוטומטי. (A) אלקטרופרוגרמת rRNA 16S. (B) האלקטרופרוגרמה שלו. קיצורים: M = סמן; NC = שליטה שלילית; NF = הזנה רגילה; AF = הזנה אקסנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לחרקים יש מיקרוביוטת מעייםמורכבת מאוד 20,21, מה שמחייב שימוש בחרקים אקסניים המחוסנים בזני מעיים ספציפיים לחקר אינטראקציות בין חרקים למיקרואורגניזמים. הכנת חרקים אקסניים חיונית למאמצי מחקר כאלה. טיפול אנטיביוטי הוא שיטה המשמשת לסילוק המיקרוביוטה של המעי. לדוגמה, יונג וקים22 האכילו את Spodoptera exigua בפניצילין, בעוד ריימונד23 האכיל P. xylostella עם תזונה מלאכותית המכילה rifampicin כדי לנקות את חיידקי המעיים. עם זאת, טיפול אנטיביוטי אינו יכול לחסל לחלוטין את חיידקי המעי ויש לו תופעות לוואי רבות על חרקים מארחים. אלה כוללים שינויים בפעילות אנזימים מטבוליים, תפקוד מעיים לקוי, עיכוב גדילה, התפתחות ורבייה, כמו גם שיעורי תמותה מוגברים 23,24,25. כתוצאה מכך, הפונקציונליות של מיקרוביוטת מעי החרק עשויה להיות מוסווית לאחר טיפול אנטיביוטי. למרבה המזל, ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי חיטוי כימי של פני השטח של הביצים, המאפשר ייצור חרקים אקסניים בקלות יחסית16. באופן יחסי, השילוב של חיטוי פני השטח של הביצים ואחריו האכלה בתזונה סטרילית יעיל ואפשרי יותר מטיפול אנטיביוטי26,27.

השגת D. antiqua אקסנית מסתמכת בעיקר על ניצול ביצים אקסניות ותזונה סטרילית. בהשוואה למיני חרקים אחרים, הביצים של D. antiqua קטנות יחסית. שיטות חיטוי שננקטו בעבר, כגון השריה קצרה של הביצים ב-0.1% נתרן דודצילבנזן סולפונט ולאחר מכן טיפול של 5 דקות בתמיסת מי חמצן 2% להשגת ביצי תיקן אקסניות28, או שימוש בתמיסת 10% נתרן היפוכלוריט למשך 10 דקות לחיטוי פני השטח ביצים של חדקונית הדקל האדומה29, אינן מתאימות לחיטוי D. antiqua ביצים. קיימים מחקרים קודמים על חיטוי ביצים של מיני דיפטרה, כגון שימוש בתמיסות מי חמצן המשמשות לחיטוי ידיים ומי חמצן כחומר חיטוי פני שטח לעיקור ביצי Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae)30. לכן, אופטימיזציה של הבחירה של זמן חיטוי וחיטוי הופך להיות הכרחי. לאחר ניסויים, נמצא כי באמצעות 0.26% NaClO ו 75% EtOH, חיטוי הביצים במשך 0.5 דקות וחזרה על התהליך שלוש פעמים יכול להשיג עיקור של D. antiqua ביצים.

לאחר השגת ביצים אקסניות, היבט מכריע נוסף של גידול אקסני D. antiqua הוא לספק להם תזונה סטרילית עבור הזחלים במבחנה. למרות שתזונה מלאכותית אינה יכולה לשכפל באופן מלא מזון טבעי, מחקרים 31,32,33 הוכיחו את ההיתכנות של גידול חרקים באמצעות תזונה מלאכותית. התוכן התזונתי של דיאטות מלאכותיות יכול להשפיע על המערכת החיסונית ואת יכולת ההסתגלות של חרקים34. לכן, חשוב שדיאטות שהוכנו באופן מלאכותי יכילו רכיבים תזונתיים דומים למזון טבעי. זה יעזור להבטיח שהחרקים המגודלים יקבלו את החומרים המזינים הדרושים להתפתחותם, לתגובה החיסונית שלהם ולבריאות הכללית. במחקר זה, בצל ירוק משמש כמרכיב העיקרי של תזונה סטרילית עבור D. antiqua. דיאטות מותססות למחצה מספקות חומרים מזינים טובים יותר עבור D. antiqua, ותורמות לצמיחתן ולהתפתחותן. בנוסף, ערבוב הומוגנט הזחל עם הדיאטות נועד להקל על עיכול מוקדם של הדיאטות על ידי מיקרוביוטת המעי מחוץ לגוף. הסיבה לכך היא שלחיידקי מעיים יש השפעה על הזנת חרקים ועיכול35. שימוש בשיטה זו להכנת דיאטות סטריליות עבור D. antiqua מפשט את התהליך ומשפר באופן משמעותי את יעילות הכנת הדיאטה.

סימביוטים חיידקיים המועברים באופן אימהי בתוך התאים נמצאים באופן נרחב בחרקים36. וולבכיה, חיידק תוך-תאי המועבר באופן אימהי, נמצא בחרקים רבים37. וולבכיה ידועה בעיקר בשל תפקידה במניפולציה של רבייה, שכן היא יכולה להטות את יחס המינים של צאצאי הפונדקאי לכיוון ייצור נקבות נגועות יותר38. לאחר אימות המצב האקסני של זחלי D. antiqua , נמצא כי הזחלים היו למעשה אקסניים לאחר חיטוי, למעט החיידק האנדוסימביוטי Wolbachia, שנמצא בציטופלסמה של תאי רקמת השחלה ב- D. antiqua ומועבר אנכית לאורך דורות דרך הציטופלסמה של תאי הביצית. באשר לשיטת חיסול הוולבכיה, טיפול אנטיביוטי הוא גישה נפוצה. לסיכום, מאמר זה מציג שיטה לגידול אקסני D. antiqua. על פי הפרוטוקול, אקסני D. antiqua ניתן לגדל בהצלחה. יתר על כן, שיטה זו מאופיינת בפשטותה ועלותה הנמוכה, מה שמספק גישה חדשה לגידול חרקים אקסניים אחרים ומגדיל את ההיתכנות של חקר יחסי הגומלין בין חרקים למיקרוביוטה של המעי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32272530), עשרים המדיניות החדשה לפרויקט האוניברסיטה בג'ינאן (2021GXRC040), פרויקטים גדולים של חדשנות מדעית וטכנולוגית במחוז שאנדונג (2021TZXD002), ופרויקט שילוב המדע והחינוך של אוניברסיטת Qilu לטכנולוגיה (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μM filter bottle Thermo Scientific 450-0045
0.22 μM Syringe Filter Biosharp BS-QT-011
100-mesh sieve Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory No Catalog numbers
1x PBS solution Solarbio P1020
2x Taq PCR Master Mix GENVIEW GR1113-1ML
5.2% NaClO solution Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 80010428
500 mL Conical flask Thermo Scientific 4103-0500
50 mL vented centrifuge tube JET BIOFIL BRT-011-050
50x TAE buffer GENVIEW GT1307
Agar powder Ding Guo DH010-1.1
Biochemical incubator STIK 21040121500010
Cell sieve SAINING 5022200
Choline chloride Sangon Biotech A600299-0100
ddH2O Ding Guo PER018-2
Disposable grinding pestle JET BIOFIL CSP-003-002
DNA extraction kit Sangon Biotech B518221-0050
DNA Marker Sangon Biotech B600335-0250
Ethanol absolute Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10009218
Filter paper NEWSTAR 1087309025
Food processor Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. WBL25B26
Illuminated  incubator Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. A16110768
L-Ascorbic acid Sangon Biotech A610021-0100
L-shaped spreader SAINING 6040000
Nutrient agar medium Hope Bio HB0109
Scissors Bing Yu  BY-103 Purchase on Jingdong
Shock incubator Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. 2020000014
Sucrose GENVIEW CS326-500G
Super Green nucleic acid dye Biosharp BS355A
Super-clean table Heal Force AC130052
TSB Hope Bio HB4114
Vacuum pump Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. 22051031
Yeast extract Thermo Scientific LP0021B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  2. Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
  3. Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
  4. Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
  5. Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
  6. Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
  7. Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
  8. Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
  9. Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
  10. Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
  11. Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
  12. Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
  13. Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
  14. Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
  15. Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
  16. Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
  17. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
  18. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  19. Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
  20. Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
  21. Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
  22. Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
  23. Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
  24. Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
  25. Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
  26. Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
  27. Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
  28. Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
  29. Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
  30. Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
  31. Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
  32. Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
  33. Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
  34. Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
  35. Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
  36. Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
  37. Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
  38. Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 202
גידול <em>אקסני Delia antiqua</em> עם דיאטות סטריליות מותססות למחצה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cao, X., Liang, Q., Li, M., Wu, X.,… More

Cao, X., Liang, Q., Li, M., Wu, X., Fan, S., Zhang, X., Zhou, F., Zhao, Z. Rearing Axenic Delia antiqua with Half-Fermented Sterile Diets. J. Vis. Exp. (202), e66259, doi:10.3791/66259 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter