Summary
Um procedimento simples para a criação de Delia antiqua axênica com dietas estéreis semi-fermentadas é descrito. Apenas uma cepa de Wolbachia foi detectada em cada ínstar de D. antiqua axênica por PCR.
Abstract
Os insetos axênicos são obtidos a partir de sistemas de criação artificial estéreis usando meios estéreis. Esses insetos, caracterizados por seu pequeno tamanho, ciclo de crescimento curto e baixa exigência alimentar, são ideais para estudar a relação entre microrganismos e hospedeiros. A microbiota intestinal influencia significativamente as características fisiológicas dos insetos hospedeiros, e a introdução de cepas específicas em insetos axênicos fornece um método para verificar as funções microbianas intestinais. Delia antiqua, uma praga ameaçadora da ordem Diptera, família Anthomyiidae e gênero Delia, alimenta-se principalmente de cebola, alho, alho-poró e outros vegetais da família Liliaceae. Suas larvas se alimentam dos bulbos, causando apodrecimento, murcha e até morte de plantas inteiras. Através da criação de larvas axênicas, estudos de seguimento podem ser realizados para observar os efeitos da microflora intestinal sobre o crescimento e desenvolvimento de D. antiqua. Ao contrário do método que envolve a eliminação antibiótica de micróbios associados, este artigo apresenta uma abordagem de baixo custo e alta eficiência para a elevação de D. antiqua axênica. Após a esterilização superficial dos ovos de D. antiqua , dietas estéreis semifermentadas foram utilizadas para criar larvas, e o estado axênico de D. antiqua foi verificado através de ensaios dependentes e independentes de cultura. Conclui-se que a combinação da esterilização de ovos de insetos e o preparo de dietas estéreis para cultivo de larvas possibilitou o desenvolvimento de um método eficiente e simples para obtenção de D. antiqua axênica. Este método fornece uma abordagem poderosa para estudar interações inseto-microflora.
Introduction
Animais axênicos, definidos como animais nos quais não é possível detectar microrganismos ou parasitas viáveis, são modelos experimentais valiosos para o estudo das interações hospedeiro-microrganismo1,2. Os insetos, o maior grupo de invertebrados, podem formar relações simbióticas com microrganismos3. Insetos axênicos podem ser usados para estudar interações simbionte hospedeiro em sistemas simbióticos4. Por exemplo, Nishide et al.5 estabeleceram um procedimento prático de criação estéril para o verme de mau odor Plautia stali, permitindo uma análise confiável e rigorosa das interações simbionte hospedeiro em sistemas simbióticos modelo. Insetos axênicos podem ser produzidos esterilizando-se a fase de ovo e fornecendo alimento estéril às larvas e adultos 6,7. Insetos axênicos são de grande importância e são amplamente utilizados em pesquisas biológicas. Por exemplo, um estudo conduzido por Somerville et al.8 demonstrou que mariposas diamondback inoculadas com Enterobacter cloacae melhoraram a adaptabilidade de machos transgênicos.
Delia antiqua Meigen é uma praga economicamente importante da cebola e de outras culturas Liliaceae em todo o mundo, com suas larvas danificando os bulbos da cebola e de outras culturas de Liliaceae9. D. antiqua é encontrada principalmente em climas temperados e é amplamente difundida em áreas de cultivo de cebola das Américas, Europa e Ásia. Se não controlada adequadamente, pode causar perdas de cultura em cebola (Allium cepa L.), alho (Allium sativum L.), chalotas (Allium fistulosum L.) e alho-poró (Alliumchoenoprasum L.) variando de 50% a 100%10,11. As larvas se alimentam das partes abaixo do solo das plantas, e essa alimentação faz com que as mudas murchem e, eventualmente, morram. Além disso, plantas danificadas podem permitir a entrada de patógenos, levando ao apodrecimento do bulbo12. Mesmo que as plantas não sejam completamente consumidas pelas larvas, os danos que elas causam tornam as plantas de cebola incomercializáveis e resultam em perdas econômicas.
Os insetos estão intimamente associados à microbiota intestinal, e a maioria dos intestinos de insetos contém uma variedade de bactérias simbióticas que prosperam com os nutrientes fornecidos pelo hospedeiro13,14. Jing et al.15 mostraram que a função primária da comunidade simbiótica intestinal é fornecer nutrientes essenciais, seguida de funções relacionadas à digestão e desintoxicação. Em certos casos, as bactérias intestinais podem servir como um recurso microbiano para fins de manejo de pragas. Consequentemente, estudar o desempenho das bactérias intestinais individuais e funções específicas dentro do corpo de D. antiqua é desejável. Portanto, o preparo de larvas axênicas é particularmente importante para o estudo das interações entre cepas bacterianas específicas e insetos16. Atualmente, um método comumente utilizado para eliminar bactérias intestinais de insetos é o uso de uma combinação de antibióticos para erradicar micróbios associados 17,18,19. Ao contrário do uso isolado de antibióticos, que só podem reduzir o número microbiano, a criação axênica de insetos permite o controle sobre a composição e a quantidade de microrganismos, permitindo uma validação mais precisa da funcionalidade da microbiota intestinal.
Assim, este artigo apresenta um protocolo para o preparo e criação de D. antiqua axênico. O alimento axênico para larvas é obtido utilizando a esterilização a alta temperatura de dietas naturais combinadas com alimentos semifermentados. Os ovos são esterilizados seguindo um protocolo experimental para obtenção de ovos axênicos e, finalmente, larvas axênicas são cultivadas a partir dos ovos axênicos. O sistema de criação axênico foi realizado por apenas uma geração para o experimento. Isso proporcionará conveniência para estudar a interação entre insetos e microbiota intestinal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
D. antiqua são obtidos do campo de Fanzhen, Taian.
1. Preparação de dietas estéreis
- Descasque as camadas externas das cebolinhas e descarte as folhas verdes. Manter a parte branca das cebolinhas (Figura 1A) e lavá-las com água estéril, repetindo o processo de enxágue três vezes. Cortar a parte branca das cebolinhas em pedaços cortados em cubos de 1-2 cm utilizando uma tesoura (ver Tabela de Materiais) esterilizada com solução de EtOH a 75 % (mencionada no passo 2.5) para utilização posterior.
- Pese 50 g das cebolinhas cortadas em cubos e coloque-as num processador de alimentos (ver Tabela de Materiais). Adicione 50 mL de água esterilizada e triture cinco vezes por 2 min cada. Todas as cebolinhas cortadas em cubos devem ser trituradas em uma consistência pastosa (Figura 2A).
- Use pinças para transferir 10 peças de larvas de3º ínstar de D. antiqua para um tubo centrífugo de 10 mL contendo 10 mL de 1x PBS, e triture-as com um pilão de moagem descartável (ver Tabela de Materiais) por cerca de 5 min para obter um líquido de moagem de larvas.
- Deite o líquido pastoso de cebolinha e o líquido de moagem de larvas num balão cónico limpo de 500 ml (ver Tabela de Materiais). Embrulhar a boca do balão cónico com duas camadas de película de vedação transparente e, em seguida, colocar o balão numa incubadora de agitação (ver Tabela de Materiais) para fermentação a 25 °C e 180 rpm durante 12 h (Figura 2B).
- Recorte sete camadas de gaze quadrada com laterais de 10 cm (sem necessidade de esterilidade) com tesouras e empilha-as juntas para formar um dispositivo de filtro simples. Despeje lentamente o líquido de cebolinha fermentado sobre a gaze e esprema o líquido filtrado em um novo balão cônico de 500 mL. Embrulhe o resíduo de cebolinha restante na gaze em papel alumínio para uso posterior.
- Filtrar o filtrado obtido na etapa anterior usando uma bomba de vácuo (ver Tabela de Materiais) e um funil de Buchner. Coloque o papel de filtro molhado por água deionizada no funil de Buchner e, em seguida, despeje o filtrado e execute a filtração por sucção por três vezes com papel de filtro diferente. Recolher o filtrado final no balão cónico de 500 ml.
- Execute outra filtragem usando um frasco de filtro de 0,22 μM e uma bomba de vácuo. Rosqueie a tampa do frasco do filtro de sucção em uma bancada ultralimpa (consulte a Tabela de Materiais) para uso posterior. Nesse ponto, obtém-se o resíduo de cebolinha fermentada e o filtrado (Figura 2C).
OBS: O líquido filtrado obtido nesta etapa será estéril. (O frasco de filtro de 0,22 μM é um sistema de filtração a vácuo estéril para esterilizar o filtrado). - Repita os passos anteriores para obter resíduo de cebolinha não fermentado e filtrado. Aqui a diferença é que a fermentação não é necessária.
- Pesar 0,24 g de cloreto de colina e 0,56 g de ácido L-ascórbico (ver Tabela de Materiais) num tubo de centrífuga de 10 ml. Adicione 3 mL de água deionizada e agite vigorosamente até que estejam completamente dissolvidos. Na bancada ultralimpa, use uma nova seringa de 5 mL e conecte três filtros de seringa de 0,22 μM (ver Tabela de Materiais) para esterilizar a solução e coloque-a em um tubo centrífugo estéril de 10 mL para uso posterior.
NOTA: O cloreto de colina é um neurotransmissor essencial para o crescimento de insetos, enquanto o ácido L-ascórbico atua como conservante. - Pesar 2 g de ágar pó e 6 g de TSB (ver Tabela de Materiais) e deitá-los num balão cónico de 500 ml. Em seguida, adicione 100 mL de água deionizada para preparar o meio de cultura. Depois de enxaguar a haste de vidro com água deionizada, use-a para mexer a mistura até que esteja bem misturada. Em seguida, selar o frasco cônico com duas camadas de filme selante transparente.
- Embrulhar as cebolinhas fermentadas e as cebolinhas não fermentadas (mencionadas nas etapas 1.5 e 1.8) em papel alumínio e esterilizá-las, juntamente com o meio de cultura, em autoclave a 121 °C por 20 min.
- Na bancada ultralimpa, despeje o cloreto de colina esterilizado, o ácido L-ascórbico e o filtrado estéril no meio de cultura, girando suavemente para misturá-los completamente. Finalmente, adicione as cebolinhas fermentadas e não fermentadas e agite vigorosamente à mão para obter as dietas estéreis. Despeje as dietas nos tubos de centrífuga de 50 mL (estéril; tampa de ventilação com membrana hidrofóbica de PVDF de 0,22 μM) (ver Tabela de Materiais) em um ângulo (Figura 2D).
NOTA: Após a esterilização, a temperatura do meio de cultura deve ser mantida entre 65-80 °C para evitar rápido resfriamento e solidificação ao adicionar cebolinha ou outros ingredientes. Além disso, em cada tubo, despeje aproximadamente 10-15 mL de dietas. Uma vez que as dietas tenham solidificado, guarde os tubos em uma geladeira a 4 °C, se não for usado imediatamente.
2. Aquisição de ovos axênicos
- Sistema de criação laboratorial para D. antiqua
- Coloque uma gaiola de criação em uma incubadora iluminada internamente por LED a 25 °C (24 h por ciclo, a proporção de claro para escuro é de 16:8) para criar adultos machos e fêmeas, permitindo que eles acasalem e coloquem ovos. Encha o bebedouro (Figura 1B) com água e sele com algodão umedecido para fornecer água para os adultos.
- Coloque quatro fundos de placa de Petri de 35 mm x 12 mm em uma tampa de placa de Petri de 94 mm x 16 mm. Molhe o algodão com água ionizada e, em seguida, coloque algodão úmido em dois dos fundos da placa de Petri e, em cima do algodão, adicione uma colher de sopa de sacarose.
- Encha os outros dois fundos de placa de Petri com duas colheres de sopa de sacarose e extrato de levedura (ver Tabela de Materiais), que servem de alimento para os insetos adultos (Figura 1C).
NOTA: A sacarose e o extracto de levedura mencionados nos passos 2.1.2 e 2.1.3 não necessitam de ser esterilizados. - Coloque um fundo de placa de Petri de 94 mm x 16 mm contendo areia umedecida e um pedaço de dente de alho descascado e sem raízes (Figura 1D) dentro da gaiola de mosca para coletar ovos. A fêmea será atraída pelo cheiro do alho e colocará ovos ao seu redor.
- Coleta de ovos
- Retire da gaiola o dispositivo de oviposição, que é uma placa de Petri de 94 mm x 16 mm contendo areia e alho acima mencionados (passo 2.14). Despeje a areia junto com o alho em um copo de 500 mL e use água da torneira para lavar os ovos restantes do alho no copo. Neste ponto, os ovos estão flutuando na água.
- Pegue uma peneira de 100 malhas (consulte Tabela de Materiais) e umedeça com água da torneira. Em seguida, despeje a água contendo os ovos flutuantes do copo na peneira. Os ovos permanecerão na peneira.
- Depois que os ovos secarem naturalmente na peneira, use um pincel para varrer suavemente os ovos em uma placa de Petri.
- No primeiro dia, lave o dispositivo de oviposição para coletar os ovos sem desinfecção ou esterilização. No segundo dia, às quatro horas da tarde, lave os ovos novamente e colete-os peneirando-os com água limpa.
NOTA: A coleta dos ovos no segundo dia é para garantir uma taxa de crescimento consistente nas etapas subsequentes. Quatro horas da tarde é o pico de oviposição para D. antiqua. Assim, o ideal é coletar os ovos neste momento. - Coloque os ovos coletados em uma peneira de células estéreis (ver Tabela de Materiais) na bancada ultralimpa (Figura 3A).
- Preparar a solução para esterilização de ovos
- Tomar 5 ml de NaClO a 5,2% (ver Tabela de Materiais) e transferi-lo para um balão cónico esterilizado de 250 ml. Adicionar 95 mL de água esterilizada para obter um volume total de 100 mL, resultando em uma solução de NaClO a 0,26%.
- Para preparar uma solução de EtOH a 75%, tomar 75 ml de EtOH a 99,7 % e transferi-lo para um balão cónico esterilizado de 250 ml. Adicionar 25 mL de água esterilizada para obter um volume total de 100 mL, resultando em uma solução de EtOH a 75%.
- Despeje 30 mL de NaClO em uma placa de Petri e despeje 30 mL de EtOH em outra placa de Petri. Introduzir a peneira celular que contém os ovos mencionados no passo 2.4 no prato que contém NaClO. Mergulhe na solução de NaClO a 0,26% por 0,5 min. Em seguida, transfira a peneira para a placa contendo EtOH, deixando de molho na solução de EtOH 75% por mais 0,5 min.
- Repetir esse processo três vezes, alternando entre NaClO 0,26% e EtOH 75% a cada 0,5 min. Em seguida, ovos axênicos serão obtidos. Neste ponto, a peneira contendo os ovos deve ser submersa em EtOH.
NOTA: Para garantir a esterilização completa, use uma pipeta de 1 mL para aspirar NaClO e EtOH e dispersar os ovos. Repita o processo de enxágue várias vezes. Esta etapa irá limpar ainda mais a superfície dos ovos de bactérias residuais e impurezas, garantindo uma superfície limpa e estéril.
3. Criação de larvas axênicas
- Para transferir os ovos esterilizados, use uma tesoura que foi esterilizada com uma lâmpada de álcool para cortar a ponta final de uma pipeta de 1 mL (Figura 3B). Certifique-se de que a abertura final da pipeta cortada é maior do que o diâmetro dos ovos (cerca de 2 mm). Em seguida, utilizar a pipeta para transferir os ovos da solução de EtOH (ovos juntamente com a solução) (Figura 3C) para um tubo centrífugo contendo as dietas estéreis, e cada tubo deve conter aproximadamente 20-50 ovos (Figura 3D). Repita este processo até que todos os ovos tenham sido transferidos.
NOTA: O diâmetro da ponta da pipeta deve ser o maior possível para evitar a quebra dos ovos durante a transferência, o que pode levar à sua morte. - Use uma pipeta para remover qualquer excesso de etanol do tubo. Coloque o tubo da centrífuga fechado com tampas dentro de um saco auto-selante e coloque um pedaço de algodão na abertura do saco para permitir a circulação de ar. Finalmente, coloque o saco dentro de uma incubadora a 25 °C (umidade relativa: 50%-70%; fotoperíodo: 16 h claro: 8 h escuro) para observação e cultivo.
- Cerca de três dias depois, os ovos axênicos das dietas começam a eclodir (Figura 4A). As larvas eclodidas estarão ativas e a superfície das dietas estéreis não será mais lisa. As larvas começarão a se alimentar com as dietas.
- Continue a observar as larvas até que atinjam o estágio de larvas de2º ínstar. Continue acompanhando seu crescimento e desenvolvimento durante esse período.
- Após 9-12 dias, mais de 80% dos ovos evoluíram para larvas de3º ínstar (Figura 4B). Isso indica sucesso no crescimento e desenvolvimento das larvas.
4. Validação de larvas axênicas com ensaios cultura-dependente
- Selecionar aleatoriamente três larvas axênicas de3º ínstar do tubo da centrífuga.
- Coloque as larvas em uma placa de Petri de 94 mm x 16 mm contendo álcool 75% para limpeza. Depois disso, transfira-os para um recipiente com água estéril para posterior enxágue.
- Use uma pinça dissecante desinfetada que tenha sido esterilizada com solução de EtOH a 75% para agarrar as larvas (a cabeça e a cauda são mostradas na Figura 5A). Utilizar tesoura dissecante para remover as extremidades da cabeça e cauda (Figura 5B). Segure a cauda das larvas com a pinça e use outra pinça para apertar suavemente da cauda até a cabeça e extrair os órgãos internos (resultado mostrado na Figura 5C). Coloque os órgãos internos em água deionizada e puxe suavemente o intestino pressionando o tecido adiposo com pinças, e coloque o interno extraído (Figura 5D) em água estéril para uso posterior.
- Coloque o intestino em um tubo centrífugo estéril de 1,5 mL, adicione 500 μL de tampão 1x PBS esterilizado e use um pilão descartável para triturar o tecido intestinal em um homogeneizado.
- Tome 100 μL do homogeneizado e adicione-o a um meio de ágar nutriente. Use um espalhador em forma de L (consulte a Tabela de Materiais) para esticar a placa de ágar.
- Colocar a placa de Petri em incubadora bioquímica a 28 °C e incubar por 72 h para observar o crescimento das colônias.
5. Validação de larvas axênicas com ensaios independentes de cultura
- Extrair ADN total do tecido intestinal de larvas axénicas utilizando um kit de extracção de ADN (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
- Medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro UV.
- Realizar reação de PCR usando primers bacterianos universais 16S rRNA (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). O volume total da reação é de 25 μL, e consiste em 1 μL de molde de DNA, 0,5 μL de primer para frente, 0,5 μL de primer reverso, 10,5 μL ddH2O e 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix (ver Tabela de Materiais). Definir as condições da reação de PCR da seguinte forma: desnaturação inicial a 94 °C por 3 min; 35 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 90 s; extensão final a 72 °C por 10 min. Conservar os produtos de PCR a 4 °C para análise posterior.
- Realizar reação de PCR utilizando iniciadores universais de ITS fúngicos (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). O volume total da reação é de 25 μL, e consiste de 1 μL de molde de DNA, 0,5 μL de primer para frente, 0,5 μL de primer reverso, 10,5 μL ddH2O e 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix. Definir as condições de PCR em 95 °C por 5 min; 35 ciclos de 95 °C por 30 s, 55 °C por 1 min e 72 °C por 90 s; seguido de 72 °C por 10 min. Conservar os produtos de PCR a 4 °C para análise posterior.
- Use o corante de ácido nucleico Super Green (consulte a Tabela de Materiais) para misturar com cada um dos dois tipos de produtos de PCR uniformemente e analisá-los por eletroforese em um gel de agarose a 1% em tampão TAE 1x (diluído a partir de 50x TAE, consulte Tabela de Materiais). Use 3 μL de marcador de DNA (ver Tabela de Materiais) como referência.
- Use um transiluminador UV para observar o gel e localizar o fragmento alvo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os estágios de vida de D. antiqua estão representados na Figura 4. O ciclo de vida completo compreende ovos, larvas, pupas (Figura 4C) e adultos (Figura 4D). São cultivados em tubos centrífugos estéreis, e sua aparência e taxa de sobrevivência são indistinguíveis de D. antiqua criadas sob condições não-axênicas. Os tempos de crescimento e desenvolvimento para cada estágio de D. antiqua podem ser encontrados na Figura 6. O estágio de ovo de D. antiqua não criado axenicamente é de 2,83 ± 0,29 dias, e o de D. antiqua criado axicamente é de 2,83 ± 0,29 dias, sem diferença significativa entre os dois ( teste t independente, t = 0,00, p = 1,00). A fase larval normal dura 13,83 ± 0,76 dias, enquanto a fase larval axênica dura 14,50 ± 0,50 dias, sem diferença significativa entre as duas ( teste t independente, t = 1,27, p = 0,27). O estágio pupal de D. antiqua criado normalmente é de 17,33 ± 0,76 dias, e o de D. antiqua criado axicamente é de 18,00 ± 0,50 dias, sem diferença significativa entre os dois ( teste t independente, t = 1,27, p = 0,27). O tempo de sobrevida dos adultos é de 81,50 ± 1,00 dias para a criação normal e de 80,33 ± 0,76 dias para a criação axênica, sem diferença significativa entre os dois ( teste t independente, t = 1,61, p = 0,18). Pode-se observar que não há diferença significativa no tempo de desenvolvimento entre D. antiqua axênico e aqueles criados em condições normais.
Ensaios dependentes de cultura mostraram que não foram detectadas colônias nos intestinos larvais (Figura 7). Além disso, a análise de PCR baseada no 16S rRNA bacteriano revelou a presença de uma banda em torno de 1500 pb (Figura 8A), identificada como Wolbachia (O número de acesso do GenBank para esta sequência de nucleotídeos é: OR564190), uma bactéria endossimbiótica. Entretanto, não foram observadas bandas na análise da PCR visando regiões ITS fúngicas (Figura 8B). Isso indica que as larvas atingiram o estado axênico. Larvas axênicas são de grande importância para o estudo dos mecanismos de interação entre D. antiqua e microrganismos, bem como para a prevenção e controle dos danos causados por D. antiqua.
Figura 1: Dispositivos de criação e alimento para D. antiqua. (A) A parte branca da cebolinha para larvas. (B) Dispensador de água para adultos. (C) Alimentação para adultos. (D) Dispositivo de coleta dos ovos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Componentes do preparo das dietas. (A) Cebolinha moída. (B) Cebolinha fermentada. (C) Resíduo e filtrado de cebolinha fermentada. (D) Dietas preparadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Processo de transferência de óvulos. (A) Ovos na peneira celular. (B) Pipeta de 1 mL sem ponta de extremidade. (C) Pipeta de 1 mL com ovos. (D) Ovos transferidos para dietas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fases de vida da D. antiqua axênica. (A) Ovos. (B) Larvas. (C) Pupa. (D) Adultos do sexo feminino e masculino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Processo de dissecação dos intestinos larvais. (A) A cabeça e a cauda da larva. (B) A larva com cabeça e cauda removidas. (C) Tecidos intestinais e corporais separados. (D) Intestino íntegro após dissecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Tempo de desenvolvimento de cada estádio de crescimento de D. antiqua, normalmente e axenicamente. Não houve diferença significativa no tempo de desenvolvimento entre D. antiqua criada axicamente e normalmente criada. Teste t independente, p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Confirmação da esterilidade de D. antiqua através da seleção aleatória de três larvas e homogeneização intestinal incubada em placas de ágar TSA e PDA. Nenhuma bactéria foi observada em larvas alimentadas com dietas estéreis. (A) Larvas axênicas em TSA. (B) Larvas normais em TSA. (C) Larvas axênicas em PCA. (D) Larvas normais em PCA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Confirmação da esterilidade de D. antiqua por PCR utilizando primers universais de 16S rRNA e iniciadores ITS fúngicos. A banda alvo do gene 16S rRNA é de ~1.500 pb. Uma banda de aproximadamente 1500 pb foi observada e identificada como a bactéria endossimbiótica Wolbachia. A banda alvo do gene ITS é de 500-750 pb. Nenhuma banda-alvo foi observada nos grupos FA. (A) Eletroferograma de RNAr 16S. (B) Eletroferograma ITS. Abreviações: M = marcador; CP = controle negativo; NF = alimentação normal; FA = alimentação axênica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os insetos possuem uma microbiota intestinal altamente complexa20,21, sendo necessário o uso de insetos axênicos inoculados com cepas microbianas intestinais específicas para o estudo das interações inseto-microrganismo. A preparação de insetos axênicos é crucial para tais esforços de pesquisa. O tratamento com antibióticos é um método usado para eliminar a microbiota intestinal. Por exemplo, Jung e Kim22 alimentaram Spodoptera exigua com penicilina, enquanto Raymond23 alimentou P. xylostella com uma dieta artificial contendo rifampicina para limpar as bactérias intestinais. No entanto, o tratamento com antibióticos não pode eliminar completamente as bactérias intestinais e tem muitos efeitos colaterais sobre os insetos hospedeiros. Estes incluem alterações na atividade enzimática metabólica, função intestinal prejudicada, inibição do crescimento, desenvolvimento e reprodução, bem como aumento das taxas de mortalidade 23,24,25. Consequentemente, a funcionalidade da microbiota intestinal do inseto pode ser mascarada após o tratamento com antibióticos. Felizmente, essa questão pode ser superada com a desinfecção química da superfície dos ovos, permitindo a produção de insetos axênicos com relativa facilidade16. Comparativamente, a combinação de desinfecção superficial dos ovos seguida de alimentação com dietas estéreis é mais efetiva e viável do que o tratamento com antibióticos26,27.
A obtenção de D. antiqua axênica depende principalmente da utilização de ovos axênicos e dietas estéreis. Em comparação com outras espécies de insetos, os ovos de D. antiqua são relativamente pequenos. Métodos de desinfecção previamente empregados, como a imersão breve dos ovos em dodecilbenzeno sulfonato de sódio a 0,1%, seguido de um tratamento de 5 min com uma solução de peróxido de hidrogênio a 2% para obter ovos de baratas axênicas28, ou o uso de uma solução de hipoclorito de sódio a 10% por 10 min para desinfetar superficialmente os ovos do gorgulho-da-palmeira-vermelha29, não são adequados para desinfecção de D. antiqua ovo. Existem estudos prévios sobre a desinfecção de ovos de espécies de Diptera, como a utilização de soluções de peróxido de hidrogênio como desinfetante manual e peróxido de hidrogênio como desinfetante de superfície para esterilizar ovos de Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae)30. Portanto, a otimização da escolha do desinfetante e do tempo de desinfecção torna-se necessária. Após experimentação, verificou-se que o uso de NaClO a 0,26% e EtOH a 75%, a desinfecção dos ovos por 0,5 min e a repetição do processo três vezes podem alcançar a esterilização dos ovos de D. antiqua .
Após a obtenção de ovos axênicos, outro aspecto crucial da criação de D. antiqua axênico é fornecer-lhes dietas estéreis para as larvas in vitro. Embora dietas artificiais não possam replicar totalmente alimentos naturais, estudos 31,32,33 têm demonstrado a viabilidade da criação de insetos utilizando dietas artificiais. O conteúdo nutricional de dietas artificiais pode afetar o sistema imunológico e a adaptabilidade dos insetos34. Portanto, é importante que dietas preparadas artificialmente contenham componentes nutricionais semelhantes aos alimentos naturais. Isso ajudará a garantir que os insetos criados recebam os nutrientes necessários para seu desenvolvimento, resposta imune e saúde geral. Neste estudo, cebolinha serve como o principal componente de dietas estéreis para D. antiqua. Dietas semifermentadas fornecem melhores nutrientes para D. antiqua, contribuindo para o seu crescimento e desenvolvimento. Além disso, misturar o homogeneizado de larvas com as dietas visa facilitar a pré-digestão das dietas pela microbiota intestinal fora do corpo. Isso ocorre porque as bactérias intestinais têm efeito sobre a alimentação e digestão dos insetos35. O uso deste método para preparar dietas estéreis para D. antiqua simplifica o processo e melhora significativamente a eficiência do preparo da dieta.
Simbiontes bacterianos transmitidos maternalmente dentro das células estão amplamente presentes em insetos36. A Wolbachia, bactéria intracelular transmitida maternalmente, está presente em numerosos insetos37. A Wolbachia é mais comumente conhecida por seu papel na manipulação reprodutiva, pois pode enviesar a proporção sexual da prole do hospedeiro para produzir mais fêmeas infectadas38. Após verificar o estado axênico das larvas de D. antiqua , verificou-se que as larvas eram essencialmente axênicas após a desinfecção, com exceção da bactéria endossimbiótica Wolbachia, presente no citoplasma das células do tecido ovariano em D. antiqua e transmitida verticalmente através das gerações através do citoplasma dos óvulos. Quanto ao método de eliminação da Wolbachia, o tratamento com antibióticos é uma abordagem comum. Em resumo, este artigo apresenta um método de criação de D. antiqua axênico. De acordo com o protocolo, D. antiqua axênico pode ser criado com sucesso. Além disso, este método é caracterizado por sua simplicidade e baixo custo, proporcionando uma nova abordagem para a criação de outros insetos axênicos e aumentando a viabilidade de estudar as interações entre insetos e a microbiota intestinal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32272530), pelo Projeto Novas Vinte Políticas para a Universidade em Jinan (2021GXRC040), Grandes Projetos de Inovação Científica e Tecnológica na Província de Shandong (2021TZXD002) e pelo Projeto de Integração de Ciência e Educação da Universidade de Tecnologia Qilu (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
