Summary

Criação de Delia antiqua axênica com dietas estéreis semi-fermentadas

Published: December 22, 2023
doi:

Summary

Um procedimento simples para a criação de Delia antiqua axênica com dietas estéreis semi-fermentadas é descrito. Apenas uma cepa de Wolbachia foi detectada em cada ínstar de D. antiqua axênica por PCR.

Abstract

Os insetos axênicos são obtidos a partir de sistemas de criação artificial estéreis usando meios estéreis. Esses insetos, caracterizados por seu pequeno tamanho, ciclo de crescimento curto e baixa exigência alimentar, são ideais para estudar a relação entre microrganismos e hospedeiros. A microbiota intestinal influencia significativamente as características fisiológicas dos insetos hospedeiros, e a introdução de cepas específicas em insetos axênicos fornece um método para verificar as funções microbianas intestinais. Delia antiqua, uma praga ameaçadora da ordem Diptera, família Anthomyiidae e gênero Delia, alimenta-se principalmente de cebola, alho, alho-poró e outros vegetais da família Liliaceae. Suas larvas se alimentam dos bulbos, causando apodrecimento, murcha e até morte de plantas inteiras. Através da criação de larvas axênicas, estudos de seguimento podem ser realizados para observar os efeitos da microflora intestinal sobre o crescimento e desenvolvimento de D. antiqua. Ao contrário do método que envolve a eliminação antibiótica de micróbios associados, este artigo apresenta uma abordagem de baixo custo e alta eficiência para a elevação de D. antiqua axênica. Após a esterilização superficial dos ovos de D. antiqua , dietas estéreis semifermentadas foram utilizadas para criar larvas, e o estado axênico de D. antiqua foi verificado através de ensaios dependentes e independentes de cultura. Conclui-se que a combinação da esterilização de ovos de insetos e o preparo de dietas estéreis para cultivo de larvas possibilitou o desenvolvimento de um método eficiente e simples para obtenção de D. antiqua axênica. Este método fornece uma abordagem poderosa para estudar interações inseto-microflora.

Introduction

Animais axênicos, definidos como animais nos quais não é possível detectar microrganismos ou parasitas viáveis, são modelos experimentais valiosos para o estudo das interações hospedeiro-microrganismo1,2. Os insetos, o maior grupo de invertebrados, podem formar relações simbióticas com microrganismos3. Insetos axênicos podem ser usados para estudar interações simbionte hospedeiro em sistemas simbióticos4. Por exemplo, Nishide et al.5 estabeleceram um procedimento prático de criação estéril para o verme de mau odor Plautia stali, permitindo uma análise confiável e rigorosa das interações simbionte hospedeiro em sistemas simbióticos modelo. Insetos axênicos podem ser produzidos esterilizando-se a fase de ovo e fornecendo alimento estéril às larvas e adultos 6,7. Insetos axênicos são de grande importância e são amplamente utilizados em pesquisas biológicas. Por exemplo, um estudo conduzido por Somerville et al.8 demonstrou que mariposas diamondback inoculadas com Enterobacter cloacae melhoraram a adaptabilidade de machos transgênicos.

Delia antiqua Meigen é uma praga economicamente importante da cebola e de outras culturas Liliaceae em todo o mundo, com suas larvas danificando os bulbos da cebola e de outras culturas de Liliaceae9. D. antiqua é encontrada principalmente em climas temperados e é amplamente difundida em áreas de cultivo de cebola das Américas, Europa e Ásia. Se não controlada adequadamente, pode causar perdas de cultura em cebola (Allium cepa L.), alho (Allium sativum L.), chalotas (Allium fistulosum L.) e alho-poró (Alliumchoenoprasum L.) variando de 50% a 100%10,11. As larvas se alimentam das partes abaixo do solo das plantas, e essa alimentação faz com que as mudas murchem e, eventualmente, morram. Além disso, plantas danificadas podem permitir a entrada de patógenos, levando ao apodrecimento do bulbo12. Mesmo que as plantas não sejam completamente consumidas pelas larvas, os danos que elas causam tornam as plantas de cebola incomercializáveis e resultam em perdas econômicas.

Os insetos estão intimamente associados à microbiota intestinal, e a maioria dos intestinos de insetos contém uma variedade de bactérias simbióticas que prosperam com os nutrientes fornecidos pelo hospedeiro13,14. Jing et al.15 mostraram que a função primária da comunidade simbiótica intestinal é fornecer nutrientes essenciais, seguida de funções relacionadas à digestão e desintoxicação. Em certos casos, as bactérias intestinais podem servir como um recurso microbiano para fins de manejo de pragas. Consequentemente, estudar o desempenho das bactérias intestinais individuais e funções específicas dentro do corpo de D. antiqua é desejável. Portanto, o preparo de larvas axênicas é particularmente importante para o estudo das interações entre cepas bacterianas específicas e insetos16. Atualmente, um método comumente utilizado para eliminar bactérias intestinais de insetos é o uso de uma combinação de antibióticos para erradicar micróbios associados 17,18,19. Ao contrário do uso isolado de antibióticos, que só podem reduzir o número microbiano, a criação axênica de insetos permite o controle sobre a composição e a quantidade de microrganismos, permitindo uma validação mais precisa da funcionalidade da microbiota intestinal.

Assim, este artigo apresenta um protocolo para o preparo e criação de D. antiqua axênico. O alimento axênico para larvas é obtido utilizando a esterilização a alta temperatura de dietas naturais combinadas com alimentos semifermentados. Os ovos são esterilizados seguindo um protocolo experimental para obtenção de ovos axênicos e, finalmente, larvas axênicas são cultivadas a partir dos ovos axênicos. O sistema de criação axênico foi realizado por apenas uma geração para o experimento. Isso proporcionará conveniência para estudar a interação entre insetos e microbiota intestinal.

Protocol

D. antiqua são obtidos do campo de Fanzhen, Taian. 1. Preparação de dietas estéreis Descasque as camadas externas das cebolinhas e descarte as folhas verdes. Manter a parte branca das cebolinhas (Figura 1A) e lavá-las com água estéril, repetindo o processo de enxágue três vezes. Cortar a parte branca das cebolinhas em pedaços cortados em cubos de 1-2 cm utilizando uma tesoura (ver Tabela de Materiais) esteriliz…

Representative Results

Os estágios de vida de D. antiqua estão representados na Figura 4. O ciclo de vida completo compreende ovos, larvas, pupas (Figura 4C) e adultos (Figura 4D). São cultivados em tubos centrífugos estéreis, e sua aparência e taxa de sobrevivência são indistinguíveis de D. antiqua criadas sob condições não-axênicas. Os tempos de crescimento e desenvolvimento para cada estágio de D. antiqua podem …

Discussion

Os insetos possuem uma microbiota intestinal altamente complexa20,21, sendo necessário o uso de insetos axênicos inoculados com cepas microbianas intestinais específicas para o estudo das interações inseto-microrganismo. A preparação de insetos axênicos é crucial para tais esforços de pesquisa. O tratamento com antibióticos é um método usado para eliminar a microbiota intestinal. Por exemplo, Jung e Kim22 alimentaram Spodo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32272530), pelo Projeto Novas Vinte Políticas para a Universidade em Jinan (2021GXRC040), Grandes Projetos de Inovação Científica e Tecnológica na Província de Shandong (2021TZXD002) e pelo Projeto de Integração de Ciência e Educação da Universidade de Tecnologia Qilu (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).

Materials

0.22 μM filter bottle Thermo Scientific 450-0045
0.22 μM Syringe Filter Biosharp BS-QT-011
100-mesh sieve Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory No Catalog numbers
1x PBS solution Solarbio P1020
2x Taq PCR Master Mix GENVIEW GR1113-1ML
5.2% NaClO solution Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 80010428
500 mL Conical flask Thermo Scientific 4103-0500
50 mL vented centrifuge tube JET BIOFIL BRT-011-050
50x TAE buffer GENVIEW GT1307
Agar powder Ding Guo DH010-1.1
Biochemical incubator STIK 21040121500010
Cell sieve SAINING 5022200
Choline chloride Sangon Biotech A600299-0100
ddH2O Ding Guo PER018-2
Disposable grinding pestle JET BIOFIL CSP-003-002
DNA extraction kit Sangon Biotech B518221-0050
DNA Marker Sangon Biotech B600335-0250
Ethanol absolute Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10009218
Filter paper NEWSTAR 1087309025
Food processor Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. WBL25B26
Illuminated  incubator Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. A16110768
L-Ascorbic acid Sangon Biotech A610021-0100
L-shaped spreader SAINING 6040000
Nutrient agar medium Hope Bio HB0109
Scissors Bing Yu  BY-103 Purchase on Jingdong
Shock incubator Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. 2020000014
Sucrose GENVIEW CS326-500G
Super Green nucleic acid dye Biosharp BS355A
Super-clean table Heal Force AC130052
TSB Hope Bio HB4114
Vacuum pump Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. 22051031
Yeast extract Thermo Scientific LP0021B

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Cao, X., Liang, Q., Li, M., Wu, X., Fan, S., Zhang, X., Zhou, F., Zhao, Z. Rearing Axenic Delia antiqua with Half-Fermented Sterile Diets. J. Vis. Exp. (202), e66259, doi:10.3791/66259 (2023).

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