Изготовление Термопластичные микрожидкостных каналов

Summary

Здесь показано, как для изготовления термопластичных микрожидкостных чипов использованием горячего тиснения и заварены. Затем мы покажем, как использовать на месте света, направленный поверхности прививки и полимеризации через запечатанном чип для формирования смесевых твердых столбцов фазу.

Abstract

В нашей лаборатории мы успешно изолированных нуклеиновых кислот непосредственно из микролитр и submicroliter объемов человеческой крови, мочи и кала использованием полимер / наночастицы композитных микромасштабной лизиса и твердых экстракционные колонны фазу. Восстановленные образцы сосредоточены и образцов малого объема, которые PCRable, без дополнительной очистки. Здесь показано, как для изготовления термопластичных микрожидкостных чипов использованием горячего тиснения и заварены. Затем мы показываем, как использовать на месте света, направленный поверхности прививки и полимеризации через запечатанном чип для формирования смесевых твердых столбцов фазу. Мы показываем, прививки и полимеризации углеродных нанотрубок / полимерных композиционных колонки для бактериального лизиса клетки. Затем мы показываем, лизис процессе последующей твердофазной экстракции нуклеиновых кислот из образцов на чипе использованием кремния / полимерных композиционных колонке. Прилагаются протоколы содержат подробные инструкции о том, чтобы и лизиса и твердых экстракционные колонны фазу.

Protocol

Микрожидкостных каналов изготавливаются в циклических полиолефина (Zeonex ® 690R, Zeon Химическая Inc, Луисвилл, Кентукки). Zeonex имеет температуры стеклования (Т _г) 136 ° С и УФ-прозрачные, что очень важно для света, направленный химии, используемые в пористых монолит образования. Микроканалов изготавливаются по микро-горячего тиснения с Нико electroformed мастер-формы, которая имеет отрицательный (обратный) особенности микрожидкостных платформы. Горячего тиснения делается следующим образом:

1. Плесени и полимерной подложки располагаются между двумя параллельными валиками металла.
2. Валики нагреваются до температуры тиснения (166 ° C), что на 30 º С выше Т _г Zeonex.
3. Валики затем прижимаются друг к другу в течение примерно 5 мин и давление поддерживается на уровне 250 фунтов на квадратный дюйм.
4. Плесени и подложки затем удаляются из нагретого валики, дают остыть в течение 1-2 мин, а затем вручную отделяются друг от друга.
5. Уэллс из 1,5-мм сверлятся на концах каналов для введения образца и коллекции.
6. Тисненые пластиковые подложки затем термически связанного с другой частью Zeonex для формирования закрытых микрожидкостных каналов. Тиснением субстрата и крышкой кусок может быть УФ-озона или плазмы лечение до термоскреплением для повышения эффективности уплотнения и обеспечить верность закрытого типа канала (Бхаттачарья и Klapperich, 2007).

Изготовление твердофазной экстракции (SPE) колонку в пластиковых микрожидкостных каналов

Изготовление твердой фазы происходит в два этапа. Во-первых, сфабрикованных микроканалов являются модифицированной поверхностью для улучшения адгезии SPE колонке пластиковые устройства. Пересадка через поверхностные фотополимеризации используется для functionalize стен полимерные микроканалов.

Прививки процедура выглядит следующим образом:

1. Микроканалы заполнены 1:01 смеси этилена диакрилат (EDA) и метилметакрилата (ММА) с 3% бензофенона, который является водород абстрагирование фотоинициатора. EDA, ММА и бензофенона закупаются у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.
2. Чип то УФ-облучении в течение 10 мин при 254 нм УФ-волны и 200 мДж / см ² энергии в ультрафиолетовом инструмент воздействия (CL-1000 UV Crosslinker, УПВ Inc, возвышенность, CA). Прививки происходит через H-абстракции полимеризации и приводит к поверхностной привязаны полимерных цепей, которые получают включены в полимеризации смеси, используемой для подготовки монолит во втором шаге.
3. Избыток мономера удаляется из каналов, промыв с 15 мкл метанола использованием вакуум-аспирации.

После photografting процесса, микропористого полимера монолит формируется в микроканалов, что завлечь частиц кремнезема для выделения ДНК. Пористый монолит готовится на месте следующим образом:

1. С модифицированной поверхностью каналы заполнены смесью монолит предшественник, состоящий из Бума (15% веса), Эдма (10% веса), 1-додеканол (52,5% веса), циклогексанол (22,5% веса), DMPAP (1% по весу по отношению до мономеров) и 0,7 мкм частиц кремнезема (15% по сравнению с общим объемом предварительно полимерная смесь). Кремнезема микросферы были приобретены у Polysciences, Inc (Уоррингтон, штат Пенсильвания) и мономеров и растворителей porogenic закупаются у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.
2. Чип облучении УФ в УФ сшивателя при 200 мДж / см ² в течение 1,1 мин до начала полимеризации, а избыток мономера удаляется из каналов, промыв с 15 мкл метанола использованием вакуум-аспирации.
3. Жидкостного соединения (NanoPorts ^ТМ соединений, Апчерч Научные, Oak Harbor, Вашингтон), затем крепится на введение и сбор скважин микрожидкостных каналов.
4. Пористый монолит затем снова промывают метанолом, по крайней мере, 30 минут, используя шприц насоса при расходе 100mL/hour.

Изготовление CNT лизис монолит в пластиковых микрожидкостных каналов

Изготовление CNT (углеродные нанотрубки) лизис монолит состоит из двух этапов. Во-первых, сфабрикованных микроканалов являются модифицированной поверхностью (привитые) таким же образом, как и для SPE столбцы в пластмассовое устройство.

После photografting процесса, микропористого полимера монолит формируется в микроканальных, пропитанную нескольких углеродных нанотрубок. Пористый монолит готовится на месте следующим образом:

1. Многослойных нанотрубок ресуспендируют в циклогексанол в концентрации 2.27M. Это ресуспендирования является ультразвуком в течение 30 минут при 50% амплитуды и скважности 50% с сотовым sonifier нарушающими (Sonifier S-250D, производства Брэнсон ультразвуковой, Дэнбери, штат Коннектикут). Ультразвука при условии эффективного и стабильного 0.5M приостановлении УНТ. УНТ были приобретены у Nanolabs (Брайтон, Массачусетс).
2. С модифицированной поверхностью каналы наполнены аналогичные смеси предшественников монолит исключением того, что теперь решение циклогексанол + УНТ используется. Смесь состоит из монолита Бума (15% веса), Эдма (10% веса), 1-додеканол (52,5% веса), и циклогексанол + УНТ (22,5% веса). К этому раствору фотоинициатора DMPAP добавляется (1,13% вес по отношению к мономеров). Мономеров, растворителей и porogenic DMPAPA закупаются у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.
3. Чип облучении УФ в УФ сшивателя при 120 мДж / см ² в течение 0,9 мин до начала полимеризации. Устройство переворачивается на 180 градусов в crossliker и облученных в течение еще ​​0,9 мин при 120 мДж / см ^2. Избыток мономера удаляется из каналов, промыв с 50 мкл метанола использованием вакуум-аспирации.
4. Жидкостного соединения (NanoPorts ^ТМ соединений, Апчерч Научные, Oak Harbor, Вашингтон), затем крепится на введение и сбор скважин микрожидкостных каналов.

Бактериальные Подготовка проб для использования с УНТ лизис монолит

Пробоподготовки для бактериальных образцов включает в себя прием измерения оптической плотности при 600 нм для того, чтобы образец не очень концентрированный, чтобы избежать засорения каналов.

1. Возьмите чтения ОП при 600 нм с бактериями в средствах массовой информации, это делается с biophotometer (Eppendorf BioPhotometer, Эппендорф Научные, Inc, Westbury, Нью-Йорк). Разбавьте образец до OD чтениях попадает в этот диапазон 0.18-0.25 А.
2. Центрифуга образца при 6500 оборотов в минуту в течение 5 минут и сцедить супернатант.

Лизис

1. Ресуспендируют бактерий в GuSCN * + 0,01% SDS + 4% протеиназы К (0.8mg/ml). Vortex кратко (1 мл бактерий в СМИ должны быть ресуспендировали в 1 мл GuSCN). Протеиназы К был добавлен в раствор, чтобы помочь с денатурации белков, которые прикреплены к бактериальной ДНК и ингибировать DNAases и RNAases. Дополнительным преимуществом протеиназы К, что он также помогает при разрушении клеточных белков стены, которая является желательным, так как оба грамположительных бактерий и грамотрицательных бактерий, стены ячейки содержат большое количество белка (хотя и грамотрицательных бактерий, как правило, имеют больше белка ). Хаотропных буфера дополнительно средства протеиназы К с денатурации белков в то время как моющее средство разрушает клеточную стенку. Протеиназы К и гуанидиний тиоцианата (GuSCN) приобретены в Qiagen Inc (Валенсия, Калифорния). SDS (додецилсульфата натрия) был приобретен у Пирс (Рокфорд, штат Иллинойс).
2. Сразу же нагрузка образца в шприц подключен к PEEK трубки. Аспирируйте шприц так, чтобы воздух не в системе. Подсоедините шланг к nanoport и канал.

KDS100 насос шприца (производства К. Д. Научные, Холлистон, Массачусетс) был использован для эксперимента и расхода используется 450 мкл / час для всех шагов. Поток канала образца лизиса на 450ul/hr.

1. Сбор образцов и приступить к экстракции ДНК с помощью SPE (см. протокол выделения ДНК). ПРИМЕЧАНИЕ: Это бактериальная образца не нужно будет следить нагрузки Шаг 2, так как подвеска GuSCN *.

ДНК Добыча протокола

Добыча процедура состоит из 3 шагов:

1. Load.
2. Вашингтон
3. Элюции.

KDS100 шприцевой насос (производство К. Д. Научные, Холлистон, Массачусетс) был использован для эксперимента и расход использовали 300 мкл / час для всех шагов.

Нагрузка

1. Условие канал с хаотропных буфер (GuSCN ^*, гуанидиний тиоцианата) в течение 1-2 мин до начала эксперимента.
2. Смешайте образца с хаотропных буфер в соотношении 1:1.
3. Поток образец смеси через канал в течение 3 мин.

Мыть

1. Вымойте канал с 70% этанолом в течение 2 мин.
2. Вымойте канал со 100% этанола в течение 2 мин.

Элюировать

1. Элюировать извлечения ДНК в Millipore воде в течение 3 мин. Сбор 15 мкл очищенной, ПЦР-готовый ДНК.

* GuSCN от Qiagen комплект (буфера RLT) был использован.