Die Herstellung der thermoplastischen Mikrofluidikkanälen

Summary

Hier zeigen wir, wie thermoplastische Mikrofluidik-Chips mit Heißprägen und Wärmeversiegelung herzustellen. Dann werden wir zeigen, wie man in situ Licht gerichtet Oberflächenpfropfung und Polymerisation durch die versiegelten Chip verwenden, um den Verbund Festphase Spalten bilden.

Abstract

In unserem Labor haben wir erfolgreich Nukleinsäuren direkt von Mikroliter-und Submikroliter Mengen von menschlichem Blut, Urin und Stuhl unter Verwendung von Polymer / Nanopartikel-Composite mikroskaligen Lyse und Festphasenextraktion Säulen isoliert. Die gewonnene Proben konzentriert, kleinen Probenvolumina, dass PCRable werden, ohne zusätzliche Aufräumarbeiten. Hier zeigen wir, wie thermoplastische Mikrofluidik-Chips mit Heißprägen und Wärmeversiegelung herzustellen. Dann zeigen wir, wie man in situ Licht gerichtet Oberflächenpfropfung und Polymerisation durch die versiegelten Chip verwenden, um den Verbund Festphase Spalten bilden. Wir zeigen, Pfropfen und Polymerisation von einem Kohlenstoff-Nanoröhrchen / Polymer-Verbundstoff Spalte für die bakterielle Zell-Lyse. Wir zeigen dann die Lyse-Prozess durch Festphasen Extraktion von Nukleinsäuren aus der Probe auf dem Chip mit einem Silica / Polymer-Verbundstoff-Säule. Die beigefügte Protokolle enthalten detaillierte Anweisungen, wie Sie beide Lyse und Festphasenextraktion Spalten zu machen.

Protocol

Die mikrofluidischen Kanälen sind in einem zyklischen Polyolefin (Zeonex ® 690R, Zeon Chemical Inc., Louisville, KY) hergestellt. Zeonex hat eine Glasübergangstemperatur (T _g) von 136 ° C und ist UV-durchlässig, das ist wichtig für das Licht gerichtet Chemie in die poröse Monolith Bildung verwendet. Die Mikrokanäle werden durch Mikro-Heißprägen mit einem NiCo elektrogeformte Master-Form, die die negative (inverse) Merkmale des mikrofluidischen Plattform hergestellt. Das Heißprägen wird wie folgt durchgeführt:

1. Die Form und das Polymer Substrat zwischen zwei parallelen Platten aus Metall angebracht.
2. Die Platten sind bis zum Prägetemperatur (166 ° C), die 30 º C über dem T _g Zeonex erhitzt wird.
3. Die Platten werden dann zusammen für ca. 5 min gepresst und der Druck wird bei 250 psi gehalten.
4. Die Form und das Substrat werden dann von der beheizten Walzen, dürfen für 1-2 min abkühlen entfernt, und dann manuell voneinander getrennt.
5. Wells von 1,5-mm-Durchmesser an den Enden der Kanäle für die Probenvorbereitung Einführung und Erhebung gebohrt.
6. Die geprägten Kunststoff-Substrat wird dann thermisch mit einem anderen Stück Zeonex verklebt geschlossenen mikrofluidischen Kanälen bilden. Die geprägten Substrat und die Abdeckung Stück kann UV-Ozon-oder Plasma vor der thermischen Anbindung an die Abdichtung Effizienz zu steigern und sicherzustellen, dass die Treue der beiliegenden Kanalstruktur (Bhattacharyya und Klapperich, 2007) behandelt werden.

Herstellung von Festphasenextraktion (SPE) Spalte innerhalb der Kunststoff-mikrofluidischen Kanälen

Die Herstellung der festen Phase ist ein zweistufiger Prozess. Zunächst werden die gefertigten Mikrokanäle Oberfläche modifiziert werden, um die Haftung der SPE-Säule auf der Kunststoff-Vorrichtung zu verbessern. Grafting via Oberfläche Photopolymerisation wird verwendet, um die Wände des polymeren Mikrokanäle funktionalisieren.

Die Pfropfung ist wie folgt:

1. Die Mikrokanäle sind mit einem 1:1-Gemisch aus Ethylendiacrylat (EDA) und Methylmethacrylat (MMA) mit 3% Benzophenon, das ein Wasserstoffatom abstrahieren Photoinitiator gefüllt ist. Das EDA, MMA und Benzophenon sind von Sigma-Aldrich, St. Louis, MO gekauft.
2. Der Chip wird dann UV-Bestrahlung für 10 min bei 254 nm UV-Wellenlänge und 200 mJ / cm ² Energie in eine UV-Exposition Instrument (CL-1000 UV Crosslinker, UPV Inc., Upland, CA). Die Pfropfung erfolgt über H-Abstraktion Polymerisation und die Ergebnisse in der Oberfläche angebundenen Polymerketten, die in der Polymerisationsmischung für die Vorbereitung des Monolithen in der zweiten Stufe verwendet einzubringen.
3. Das überschüssige Monomer wird aus den Kanälen durch Spülen mit 15 ul Methanol unter Vakuum abgesaugt.

Nach dem photografting Verfahren wird eine mikroporöse Polymer-Monolith innerhalb der Mikrokanäle gebildet, fangen die Silica-Teilchen zur DNA-Extraktion. Die poröse Monolith ist in situ hergestellt wie folgt:

1. Die Oberfläche verändert Kanäle sind mit einem Monolith Precursormischung bestehend aus Buma (15% wt), EDMA (10% wt), 1-Dodecanol (52,5% wt), Cyclohexanol (22,5% Gew.), DMPAP (1 Gew.% in Bezug gefüllt Monomere) und 0,7 um Silica-Partikel (15% bezogen auf das Gesamtvolumen der Pre-Polymer-Mischung). Die Silica-Mikrokugeln wurden von Polysciences, Inc. (Warrington, PA) gekauft und die Monomere und porogenen Lösungsmittel sind von Sigma-Aldrich, St. Louis, MO gekauft.
2. Der Chip wird mit UV im UV-Crosslinker bei 200 mJ / cm ² für 1,1 min, um die Polymerisation zu initiieren bestrahlt, und das überschüssige Monomer wird aus den Kanälen durch Spülen mit 15 ul Methanol unter Vakuum abgesaugt.
3. Die fluidischen Verbindungen (NanoPorts ^{TM-Verbindungen,} Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) werden dann über die Einführung und Erhebung Vertiefungen der mikrofluidischen Kanälen verbunden.
4. Die poröse Monolith wird dann wieder mit Methanol für mindestens 30 min mit der Spritzenpumpe bei einer Flussrate von 100mL/hour gewaschen.

Herstellung von CNT Lyse Monolith in der Kunststoff-mikrofluidischen Kanälen

Die Herstellung der CNT (Kohlenstoff-Nanoröhrchen) Lyse Monolith ist ein zweistufiger Prozess. Zunächst werden die gefertigten Mikrokanäle Oberfläche modifiziert (gepfropft) in der gleichen Weise wie für die SPE-Säulen in der Kunststoff-Gerät.

Nach dem photografting Verfahren wird eine mikroporöse Polymer-Monolith innerhalb des Mikrokanals, die mit Multi-Walled Carbon Nanotubes imprägniert gebildet wird. Die poröse Monolith ist in situ hergestellt wie folgt:

1. Multi-Walled-Nanotubes sind in Cyclohexanol in einer Konzentration von 2,27 resuspendiert. Diese Resuspension wird für 30 Minuten bei 50% Amplitude Ultraschall und 50% ED mit einem sonifier Cell Disruptor (Sonifier S-250D, von Branson Ultraschall, Danbury, CT) hergestellt. Die Beschallung ein wirksames und stabiles 0.5M Suspension von CNTs. Die CNTs wurden aus Nanolabs (Brighton, MA) erworben.
2. Die Oberfläche verändert Kanäle sind mit einer ähnlichen Monolithen Precursormischung außer dass jetzt die Lösung von Cyclohexanol + CNTs wird gefüllt. Der Monolith Mischung besteht aus Buma (15% wt), EDMA (10% wt), 1-Dodecanol (52,5% Gew.) und Cyclohexanol + CNTs (22,5% wt). Zu dieser Lösung der Photoinitiator DMPAP hinzugefügt wird (1,13% Gew. mit Bezug auf Monomere). Die Monomere, porogenen Lösungsmitteln und DMPAPA sind von Sigma-Aldrich, St. Louis, MO gekauft.
3. Der Chip wird mit UV im UV-Crosslinker bei 120 mJ / cm ² für 0,9 min, um die Polymerisation zu initiieren bestrahlt. Das Gerät ist um 180 Grad gedreht in der crossliker und bestrahlt weitere 0,9 min bei 120 mJ / cm ^2. Das überschüssige Monomer wird aus den Kanälen durch Spülen mit 50 ul Methanol unter Vakuum abgesaugt.
4. Die fluidischen Verbindungen (NanoPorts ^{TM-Verbindungen,} Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) werden dann über die Einführung und Erhebung Vertiefungen der mikrofluidischen Kanälen verbunden.

Bakterielle Probenvorbereitung für die Verwendung mit CNT Lyse Monolith

Die Probenvorbereitung für eine bakterielle Probe die Einnahme einer optischen Dichte-Messung bei 600nm, um sicherzustellen, dass die Probe nicht extrem, um zu verhindern Verstopfung des Kanals konzentriert.

1. Nehmen Sie eine OD Lesen bei 600nm mit den Bakterien in den Medien, ist dies mit einem BioPhotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf Scientific, Inc., Westbury, NY) durchgeführt. Verdünnen Sie die Probe, bis die OD im Bereich 0,18-0,25 A. Herbst
2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 6.500 rpm für 5 Minuten und Dekantieren des Überstandes.

Lysis

1. Resuspendieren Bakterien in GuSCN * + .01% SDS + 4% Proteinase K (0.8mg/ml). Vortex kurz (1 ml der Bakterien in Medien sollten in 1ml GuSCN resuspendiert werden). Proteinase K wurde zu der Lösung gegeben, um mit Denaturierung von Proteinen, die an der bakteriellen DNA gebunden sind und DNasen und RNAasen verhindern helfen. Ein weiterer Vorteil der Proteinase K ist, dass es hilft auch mit Abbau der Zellwand Proteine, die wünschenswert ist, da sowohl gram-positive Bakterien und gram-negative Bakterien Zellwände große Mengen an Protein (enthält zwar gram-negative Bakterien in der Regel mehr Eiweiß haben ). Die chaotropen Puffer zusätzlich unterstützt die Proteinase K mit Denaturierung von Proteinen während des Waschmittels stört die Zellwand. Proteinase K und Guanidiniumthiocyanat (GuSCN) wurden von Qiagen Inc. (Valencia, CA) gekauft. SDS (Natriumdodecylsulfat) wurde von Pierce (Rockford, IL) erworben.
2. Unmittelbar Belastung der Probe in einer Spritze verbunden PEEK-Schlauch. Saugen Sie die Spritze so, dass keine Luft in das System. Verbinden Sie den Schlauch an den nanoport und Kanal.

Ein KDS100 Spritzenpumpe (hergestellt von KD Scientific, Holliston, MA) wurde für die Experimente verwendet und die Durchflussmenge eingesetzt ist 450 ul / Stunde für alle Schritte. Durchfluss der Probe Lyse-Kanal bei 450ul/hr.

1. Sammeln Sie die Probe und gehen Sie auf die DNA-Extraktion mittels SPE (siehe DNA-Extraktion-Protokoll). HINWEIS: Diese bakterielle Probe müssen nicht laden Schritt 2 folgen, da die Suspension GuSCN *.

DNA-Extraktion-Protokoll

Das Extraktionsverfahren besteht aus 3 Schritten:

1. Load.
2. Washington
3. Eluieren.

KDS100 Spritzenpumpe (hergestellt von KD Scientific, Holliston, MA) wurde für die Experimente verwendet und die Durchflussmenge eingesetzt wurde 300 ul / Stunde für alle Schritte.

Last

1. Zustand des Kanals mit chaotropen Puffer (GuSCN ^*, Guanidiniumthiocyanat) für 1-2 min vor dem Start des Experiments.
2. Mischen Sie die Probe mit chaotropen Puffer im Verhältnis 1:1.
3. Flow-Probe-Gemisch durch den Kanal für 3 min.

Waschen

1. Waschen Sie den Kanal mit 70% Ethanol für 2 min.
2. Waschen Sie den Kanal mit 100% Ethanol für 2 min.

Eluieren

1. Eluieren der extrahierten DNA in Millipore-Wasser für 3 min. Sammeln Sie 15 ul des gereinigten PCR-ready DNA.

* Die GuSCN aus dem Qiagen-Kit (Buffer RLT) verwendet wurde.