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Cancer Research

डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड के बायोबैंकिंग के लिए रणनीति: हिस्टोलॉजिकल उपप्रकारों और रोग चरणों में इंटरपेशेंट विषमता को संबोधित करना

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/66467
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital, Ludwig-Maximilian-University (LMU) Munich, 2German Cancer Consortium (DKTK), Partner site Munich (LMU), a partnership between the German Cancer Research Center (DKFZ) and the University Hospital of LMU Munich
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल विभिन्न रोग चरणों से डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड की स्थापना के लिए एक व्यवस्थित ढांचा प्रदान करता है और उपज बढ़ाने और बाद के अनुप्रयोगों के लिए मजबूत दीर्घकालिक विस्तार को सक्षम करने के लिए रोगी-विशिष्ट परिवर्तनशीलता की चुनौतियों का समाधान करता है। इसमें ऊतक प्रसंस्करण, बीजारोपण, मीडिया आवश्यकताओं को समायोजित करने और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के लिए विस्तृत कदम शामिल हैं।

Abstract

जबकि रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड से डिम्बग्रंथि के कैंसर बायोबैंक की स्थापना उनके नैदानिक पृष्ठभूमि की जानकारी के साथ अनुसंधान और रोगी देखभाल में प्रगति का वादा करती है, इस घातक दुर्दमता की विषमता के कारण मानकीकरण एक चुनौती बनी हुई है, जो ऑर्गेनॉइड तकनीक की अंतर्निहित जटिलता के साथ संयुक्त है। यह अनुकूलनीय प्रोटोकॉल डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड की पूरी क्षमता का एहसास करने के लिए एक व्यवस्थित ढांचा प्रदान करता है, जो पूर्वजों की रोगी-विशिष्ट परिवर्तनशीलता पर विचार करता है। इष्टतम संस्कृति की स्थिति और बोने के तरीकों का चयन करने के लिए एक संरचित प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो को लागू करके, प्रत्यक्ष 3 डी सीडिंग बनाम 2 डी / 3 डी मार्ग के समानांतर परीक्षण के साथ, हम ज्यादातर मामलों में, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त मजबूत दीर्घकालिक विस्तार लाइनें प्राप्त करते हैं।

विशेष रूप से, प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया है और अत्यधिक विषम प्रारंभिक सामग्री के मामलों (एन = 120) की एक बड़ी संख्या में कुशल साबित हुआ है, जिसमें उच्च ग्रेड और निम्न-ग्रेड डिम्बग्रंथि के कैंसर और प्राथमिक डिबल्किंग, आवर्तक बीमारी और पोस्ट-नियोएडजुवेंट सर्जिकल नमूनों के साथ रोग के चरण शामिल हैं। कम Wnt, उच्च BMP बहिर्जात सिग्नलिंग वातावरण के भीतर, हमने देखा कि पूर्वज हेरेगुलिन 1 ß (HERß-1) -पाथवे के सक्रियण के लिए अलग-अलग अतिसंवेदनशील होते हैं, HERß-1 कुछ में ऑर्गेनॉइड गठन को बढ़ावा देते हैं जबकि इसे दूसरों में रोकते हैं। रोगी के नमूनों के एक सबसेट के लिए, इष्टतम ऑर्गेनॉइड गठन और दीर्घकालिक विकास के लिए माध्यम में फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 10 और आर-स्पोंडिन 1 के अतिरिक्त की आवश्यकता होती है।

इसके अलावा, हम ऊतक पाचन और पूर्वज अलगाव के महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डालते हैं और उन उदाहरणों को इंगित करते हैं जहां प्लास्टिक पर 2 डी में संक्षिप्त खेती बेसमेंट मेम्ब्रेन एक्सट्रैक्ट टाइप 2 मैट्रिक्स में बाद के ऑर्गेनॉइड गठन के लिए फायदेमंद है। कुल मिलाकर, इष्टतम बायोबैंकिंग को व्यक्तिगत लाइनों के लिए पर्याप्त विकास वातावरण की पहचान करने के लिए समानांतर में सभी मुख्य स्थितियों के व्यवस्थित परीक्षण की आवश्यकता होती है। प्रोटोकॉल भी व्यापक फेनोटाइपिंग के लिए आवश्यक है जो organoids, जो उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए कुशल एम्बेडिंग, sectioning, और धुंधला के लिए हैंडलिंग प्रक्रिया का वर्णन करता है.

Introduction

उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर के साथ रोगियों के नैदानिक प्रबंधन उन्नत चरणों और उच्चपुनरावृत्ति दर 1 पर अपनी विषम नैदानिक प्रस्तुति के कारण चुनौतीपूर्ण बनी हुई है. डिम्बग्रंथि के कैंसर के विकास और जैविक व्यवहार की हमारी समझ में सुधार के लिए अनुसंधान दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है जो रोग, उपचार प्रतिक्रिया, और हिस्टोपैथोलॉजिकल के साथ-साथ आणविक विशेषताओं के दौरान रोगी-विशिष्ट परिवर्तनशीलता को संबोधित करतेहैं।

बायोबैंकिंग, डिम्बग्रंथि के कैंसर रोगियों से प्राप्त ट्यूमर के नमूनों के व्यवस्थित संग्रह और दीर्घकालिक संरक्षण की विशेषता है, साथ ही उनकी नैदानिक जानकारी विभिन्न रोग चरणों में एक बड़े रोगी कोहोर्ट का संरक्षण प्रदान करती है, जिसमें प्राथमिक डिबलिंग सर्जरी से ट्यूमर के नमूने, नियोएडजुवेंट कीमोथेरेपी के बाद और आवर्तक बीमारी से। यह होनहार रोगनिरोधी बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्य 3 के संसाधन के रूप में सेवारत कैंसर अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए मूल्यवान क्षमता रखतीहै। हालांकि, इस तरह के formalin निर्धारण और ठंड के रूप में पारंपरिक बायोबैंकिंग विधियों, व्यवहार्यता के नुकसान और देशी तीन आयामी ऊतक वास्तुकला 4,5 के विघटन के कारण मूल ट्यूमर के नमूनों पर कार्यात्मक अध्ययन आयोजित करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं.

ऑन्कोलॉजी और उससे आगे आणविक तंत्र का अध्ययन, महत्वपूर्ण रूप से उपयुक्त प्रयोगात्मक मॉडल के उपयोग पर निर्भर करता है जो ईमानदारी से रोग के जीव विज्ञान को प्रतिबिंबित करता है और विवो में देखे गए ऊतक के इन विट्रो गुणों को बनाए रखता है। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स, नवीकरण क्षमता के संरक्षण के आधार पर, प्रयोगशाला में उपकला की मूल संरचना और कार्य को पुन: पेश करते हैं और रोगी-विशिष्ट संदर्भ में परीक्षण की अनुमति देते हैं। इसलिए, वे कैंसर अनुसंधान और व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए अत्यधिक आशाजनक उपकरण के रूप में उभरा है, नैदानिक विविधता और प्रयोगशाला अनुसंधान 6,7,8,9 के बीच की खाई को पाटने. ऑर्गेनोइड लाइनों की व्यक्तिगत दवा प्रतिक्रियाओं और आणविक प्रोफाइल की कार्यात्मक प्रासंगिकता के परीक्षण के आधार पर अनुरूप चिकित्सीय रणनीतियों, संभावित रूप से सीधे रोगी देखभाल10,11 पर लागू किया जा सकता है। रोगी विशिष्ट विशेषताओं और समय के साथ प्रासंगिक भावी नैदानिक डेटा के संग्रह सहित लंबी अवधि की खेती की संभावना उपन्यास रोगनिरोधी और रोग प्रगति और प्रतिरोध तंत्र 3,9 में शामिल भविष्य कहनेवाला कारकों की पहचान करने के लिए महान वादा रखती है.

बहरहाल, एक बायोबैंक है कि विभिन्न ट्यूमर नमूनों से organoids शामिल बनाने जटिल पद्धति के लिए सख्त पालन और आसान रखरखाव12 के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की एक संयोजन की आवश्यकता है. प्रक्रिया मानकीकरण यह सुनिश्चित करता है कि बायोबैंक को उच्च कारोबार पर भी प्रशिक्षित कर्मचारियों द्वारा कुशलतापूर्वक स्थापित और बनाए रखा जा सकता है, जबकि एक ही समय में उच्चतम गुणवत्ता मानकों का पालन करना13. कई अध्ययनों ने अलग-अलग दक्षता दरों के साथ मूल ट्यूमर के उत्परिवर्ती और फेनोटाइपिकल प्रोफाइल के अनुरूप स्थिर डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनॉइड लाइनों की सफल पीढ़ी की सूचना दी। फिर भी, नियमित जैव बैंकिंग व्यवहार में चुनौतीपूर्ण बनी हुई है, विशेष रूप से लाइनों के दीर्घकालिक स्थिर विकास के लिए, जो बड़े पैमाने पर विस्तार या सफल जीनोमिक संपादन के लिए एक शर्त है।

विशेष रूप से, विस्तारशीलता का मुद्दा क्षेत्र में अस्पष्ट रूप से परिभाषित रहता है क्योंकि धीमी और सीमित विकास क्षमता दिखाने वाले ऑर्गेनोइड को कभी-कभी स्थापित लाइनों के रूप में गिना जाता है। के रूप में शुरू में हॉफमैन एट अल द्वारा प्रदर्शन किया, एक अध्ययन जिसका प्रमुख निष्कर्षों इस आगे विकसित प्रोटोकॉल के लिए आधार प्रदान की, डिम्बग्रंथि के कैंसर ऊतक के इष्टतम हैंडलिंग विषमता14 को समायोजित करने के लिए एक अनूठी रणनीति की आवश्यकता है. इस विधि द्वारा प्राप्त ऑर्गेनोइड के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन और माता-पिता के ट्यूमर ऊतक के साथ घनिष्ठ समानता की पुष्टि पैनल डीएनए अनुक्रमण और परिपक्व संस्कृतियों (खेती के 4-10 महीने) के ट्रांसक्रिप्टोमिक्स विश्लेषण द्वारा की गई थी, जो मॉडल 8,9,12,14की स्थिरता का प्रदर्शन करती है।

पैराक्राइन वातावरण के विपरीत जो स्वस्थ फैलोपियन ट्यूबों में होमियोस्टैसिस को नियंत्रित करता है, उपकला परत, जो संभवतः उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर (एचजीएसओसी), कैंसर पुनर्जनन क्षमता और ऑर्गेनॉइड गठन क्षमता पैदा करती है, बहिर्जात डब्ल्यूएनटी पूरकता पर कम निर्भर है। इसके अलावा, सक्रिय अस्थि morphogenetic प्रोटीन (बीएमपी) संकेतन, organoid माध्यम में Noggin की अनुपस्थिति की विशेषता है, डिम्बग्रंथि के कैंसर ठोस ऊतक जमा14,15 से दीर्घकालिक संस्कृतियों की स्थापना के लिए फायदेमंद साबित हुई. डिम्बग्रंथि के कैंसर के ठोस जमा के व्यवस्थित बायोबैंकिंग के दौरान, हमने इन निष्कर्षों की पुष्टि की है और पाइपलाइन की स्थापना की है, इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विवरण के साथ जो अधिकांश मामलों में निरंतर दीर्घकालिक विस्तार सुनिश्चित करता है। हम पाते हैं कि प्राथमिक आइसोलेट्स के साथ काम करते समय विभिन्न मीडिया रचनाओं और बोने के तौर-तरीकों के समानांतर परीक्षण दीर्घकालिक स्थिर ऑर्गेनॉइड लाइनों की स्थापना में सुधार करने और पैदावार बढ़ाने के लिए आवश्यकहैं, जिससे डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए आवश्यक बहु-अच्छी तरह से प्रारूपों में मजबूत प्रसार और विस्तार को सक्षम किया जा सके।

इसके अलावा, सर्जरी के दौरान एकत्र किए गए नमूनों की शुद्धता और गुणवत्ता बुनियादी अनुसंधान और आणविक निदान में डिम्बग्रंथि के कैंसर के अंगों की अनुवाद क्षमता के लिए महत्वपूर्ण महत्व है। एचजीएसओसी की नैदानिक प्रस्तुति की जटिलता को सर्जनों, ऑन्कोलॉजिस्ट और प्रयोगशाला में वैज्ञानिकों के बीच घनिष्ठ सहयोग की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रासंगिक सामग्री की सही पहचान की गई है, परिवहन की स्थिति स्थिर रखी जाती है, और ऑर्गेनॉइड लाइनें उच्च दक्षता के साथ उत्पन्न होती हैं जो सबसे महत्वपूर्ण विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करती हैं प्रत्येक रोगी की बीमारी। यह प्रोटोकॉल डिम्बग्रंथि के कैंसर 16,17की विशेषता वाली विषमता पर विचार करते हुए, डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड की पूरी क्षमता को पकड़ने के लिए एक मानकीकृत लेकिन अनुकूलनीय ढांचा प्रदान करता है। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल डिम्बग्रंथि के कैंसर नैदानिक प्रस्तुति के व्यापक स्पेक्ट्रम के विश्वसनीय बायोबैंकिंग को सक्षम बनाता है, जिसमें विभिन्न हिस्टोलॉजिकल प्रकार (उच्च ग्रेड और निम्न-ग्रेड डिम्बग्रंथि के कैंसर, एलजीएसओसी) शामिल हैं, एक ही रोगियों से अलग-अलग जमा जो स्टेमनेस विनियमन में अंतर प्रदर्शित करते हैं, पोस्ट नियोएडजुवेंट सेटिंग में सर्जरी से ऊतक, बायोप्सी सामग्री, और रोग प्रगति के आवर्तक चरण में सर्जरी से नमूने।

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Protocol

डिम्बग्रंथि के कैंसर सर्जरी से ट्यूमर ऊतक के नमूने एकत्र किए गए थे और मौजूदा लागू यूरोपीय संघ, राष्ट्रीय और स्थानीय नियमों का पालन करते हुए एलएमयू विश्वविद्यालय (17-471) की आचार समिति के अनुपालन में रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड उत्पन्न किए गए थे। अध्ययन में शामिल प्रत्येक रोगी ने लिखित रूप में सहमति दी है। ताजा ऊतक नमूनों के साथ काम करते समय, जैव सुरक्षा स्तर 2 सुरक्षा अनुमति और लामिना फ्लो अलमारियाँ आवश्यक हैं। ऊतक नमूनों की संभावित संक्रामक प्रकृति को देखते हुए, जिसे प्रासंगिक संक्रामक रोगों के नेमी परीक्षण की कमी के कारण खारिज नहीं किया जा सकता है, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि संस्थागत जैव-सुरक्षा विनियमों का कड़ाई से पालन किया जाता है और प्रयोगों का संचालन करने वाले कर्मियों के लिए पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण उपलब्ध हैं।

1. तैयारी

  1. मध्यम तैयारी
    1. प्रति सप्ताह एक बार ताजा 2 डी और 3 डी मीडिया तैयार करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रत्येक माध्यम के लिए सामग्री की सटीक संरचना तालिका 1 में सूचीबद्ध है। डिम्बग्रंथि के कैंसर माध्यम 1 (OCM1) और OCM2 दोनों को अतिरिक्त रूप से HER1ß (अंतिम एकाग्रता: 50 ng/mL) द्वारा पूरक किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप चार अलग-अलग स्थितियां होती हैं: OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß।
    2. वृद्धि कारक अभिकर्मकों के स्टॉक समाधान बनाएं और उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस और ए 83-01 और निकोटिनामाइड (+4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण) पर रखें। विकास कारकों की तापमान संवेदनशीलता के कारण, मध्यम तैयारी के लिए तुरंत पिघले हुए स्टॉक समाधानों का उपयोग करें और विभाज्य बनाकर बार-बार विगलन चक्रों से बचें।
      नोट: मीडिया तैयारी एक महत्वपूर्ण कदम है जिसे सख्ती से नियंत्रित करने की आवश्यकता है।
    3. RSPO-1 वातानुकूलित माध्यम की तैयारी
      1. पिघलना हा-आर-स्पोंडिन 1-एफसी 293 टी कोशिकाओं (-80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण) जल्दी से 37 डिग्री सेल्सियस पर। उन्हें बेसल संस्कृति माध्यम के 10 एमएल के साथ धोएं, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ पूरक, इसलिए बेसल संस्कृति माध्यम ++ के रूप में जाना जाता है।
      2. बेसल संस्कृति माध्यम ++ के 12 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और इसे टी 75 फ्लास्क में बीज दें।
      3. कोशिकाओं को संगम तक पहुंचने पर ट्रिप्सिन (37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट) युक्त एक पृथक्करण अभिकर्मक के साथ 1: 6 के अनुपात में कोशिकाओं को विभाजित करें। उन्हें एक नए T75 फ्लास्क में बीज दें।
      4. अगले दिन, माध्यम में फ्लोमाइसिन डी 1 (1,25 माइक्रोन / एमएल) जोड़ें।
      5. कोशिकाओं संगम तक पहुँचने ट्रिप्सिन (37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट) के साथ 1:20 के अनुपात में कोशिकाओं को विभाजित करें. बेसल संस्कृति माध्यम ++ (10% एफसीएस युक्त) के 30 एमएल में कई टी 75 फ्लास्क (लक्षित अंतिम मात्रा के अनुसार फ्लास्क की संख्या) में कोशिकाओं को बीज फ्लोमाइसिन डी 1 के साथ पूरक।
      6. वातानुकूलित मीडिया उत्पादन शुरू करें जब कोशिकाएं संगम के लगभग 50% तक पहुंच जाती हैं: फ्लोमाइसिन डी 1 के बिना 5% एफसीएस के साथ पूरक बेसल संस्कृति माध्यम के 40 एमएल के साथ माध्यम को बदलें।
      7. 3 दिनों के बाद पहली सतह पर तैरनेवाला लीजिए. मलबे को हटाने के लिए, 1,200 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ कंटेनर में रखें.
      8. कोशिकाओं के लिए 5% एफसीएस के साथ पूरक नई बेसल संस्कृति माध्यम जोड़ें। 3-4 दिनों के बाद दूसरा सतह पर तैरनेवाला लीजिए। 1,200 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। पहले सतह पर तैरनेवाला करने के लिए दूसरा सतह पर तैरनेवाला जोड़ें.
      9. एक 0.2 माइक्रोन बोतल शीर्ष फिल्टर का उपयोग करके वातानुकूलित माध्यम तनाव.
      10. गुणवत्ता नियंत्रण और RSPO1-परिमाणीकरण के लिए, उत्पादित माध्यम को 293T सेल लाइन (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14में जोड़ें, जो कि Wnt रिपोर्टर18 ले जाने वाले GFP-प्लाज्मिड के साथ स्थिर रूप से ट्रांसड्यूड है।
        नोट: GFP सिग्नल की मात्रा और तीव्रता के आधार पर, Wnt मार्ग के एगोनिस्ट के रूप में RSPO1 की गतिविधि का परीक्षण Wnt रिपोर्टर सेल लाइन के परिमाणीकरण द्वारा किया जाता है।
      11. 4 डिग्री सेल्सियस पर तत्काल उपयोग (1 सप्ताह के भीतर) के लिए 15 एमएल के विभाजिक रखें। लंबे समय तक भंडारण (6 महीने) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर वातानुकूलित माध्यम रखें।

2. एक डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनॉइड संस्कृति की शुरुआत

  1. प्राथमिक ऊतक अलगाव
    1. ताजा और व्यवहार्य ऊतक अधिमानतः सर्जरी के तुरंत बाद परिवहन और संग्रह के बाद 20 घंटे की एक अधिकतम के भीतर अलगाव प्रदर्शन. लगभग 4 डिग्री सेल्सियस पर कोल्ड पैक से सुसज्जित परिवहन बॉक्स के साथ ऊतक संग्रह माध्यम में उचित परिवहन स्थिति सुनिश्चित करें।
    2. प्रयोगशाला में, समय पर नमूना प्रसंस्करण की सुविधा के लिए आवश्यक अभिकर्मकों और उपकरणों को तैयार करें:
      1. पिघलना तहखाने झिल्ली निकालें प्रकार द्वितीय मैट्रिक्स (बीएमई 2 मैट्रिक्स) बर्फ पर (लगभग 2 घंटे)।
      2. डिस्पोजेबल स्केलपेल, निष्फल विच्छेदन उपकरण (कैंची और चिमटी), और 50 एमएल ट्यूबों के लिए 400 माइक्रोन आकार के फिल्टर आवेषण तैयार करें।
      3. स्नैप फ्रीजिंग के लिए तरल नाइट्रोजन की एक छोटी मात्रा के साथ एक कंटेनर तैयार करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गर्म पानी के स्नान करें।
        नोट: एक सेल संस्कृति लामिना का प्रवाह हुड के भीतर काम करते हैं.
    3. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) (सीए ++ और मिलीग्राम ++ के बिना) में अच्छी तरह से पेट्री डिश में ताजा ऊतक धो लें। पेट्री डिश के अंदर, छोटे, 3-5 मिमी आकार के टुकड़ों में डिस्पोजेबल स्केलपेल और / या कैंची का उपयोग करके ऊतक को टुकड़ा करें।
    4. निम्नलिखित उद्देश्यों के लिए प्राप्त ऊतक को तीन वर्गों में अलग करें:
      1. क्रायोजेनिक ट्यूबों में ऊतक ले लीजिए. क्रायोजेनिक ट्यूबों को सदमे ठंड के लिए तरल नाइट्रोजन से भरे तैयार कंटेनर में स्थानांतरित करें।
      2. निर्धारण (24 घंटे) के लिए फॉर्मेलिन से भरे एक हिस्टोलॉजिकल नमूना कंटेनर में ऊतक (2-3 मिमी) लीजिए और उन्हें धुंधला प्रयोजनों19,20 के लिए पैराफिन में एम्बेड करें।
      3. इसके अलावा, एंजाइमी पाचन से पहले ऊतक को समरूप करें। एक स्केलपेल के साथ यांत्रिक पृथक्करण को अधिकतम करें और इसे 50 एमएल ऊतक ट्यूब में स्थानांतरित करें।
        नोट: सुनिश्चित करें कि ऊतक हमेशा ऊतक से बाहर सूखने से बचने के लिए homogenization के दौरान पीबीएस में भिगोया जाता है.
    5. पीबीएस (सीए ++ और एमजी ++ के बिना), कोलेजनेज I (स्टॉक समाधान 5 यू / μL, अंतिम एकाग्रता 1 यू / μL), और एक चयनात्मक ROCK1 और 2 अवरोधक (3 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) ( तालिका 1 में सूचीबद्ध घटक) युक्त पाचन मिश्रण के साथ समरूप ऊतक को मिलाएं। ट्यूमर के प्रत्येक 2 सेमी3 के लिए 50 एमएल ट्यूब में पाचन मिश्रण के 15 एमएल का उपयोग करें।
      नोट: सीमित सामग्री (जैसे, बायोप्सी नमूने) एंजाइमी पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए पाचन मिश्रण की केवल छोटी मात्रा (लगभग 2-3 एमएल) की आवश्यकता होती है।
    6. एंजाइमी पृथक्करण के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 1.5 घंटे के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें। मैकेनिक पृथक्करण का समर्थन करने के लिए छिटपुट और जोरदार भंवर (10-15 एस के लिए लगभग हर 20 मिनट) का संचालन करें।
    7. इनक्यूबेशन के बाद, ट्यूब में कोल्ड बेसल कल्चर मीडियम ++ के 15 एमएल जोड़ें। अपकेंद्रित्र 300 × ग्राम पर 5 मिनट।
    8. सतह पर तैरनेवाला हटाने के बाद, नए बेसल संस्कृति माध्यम ++ के 5 एमएल जोड़ें। एक ताजा 50 एमएल ट्यूब में एक 400 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके सेल निलंबन तनाव.
    9. 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और सेल गोली रखने के लिए.
    10. एरिथ्रोसाइट्स को हटाने के लिए, सेल गोली के लिए लाल रक्त कोशिका Lysing (आरबीसी) बफर के 5 एमएल जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में सेते हैं.
    11. lysis निष्क्रियता के लिए बेसल संस्कृति माध्यम ++ के 5 एमएल जोड़ें। 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सेल गोली के लिए बेसल संस्कृति माध्यम ++ के 3 एमएल जोड़ें।
    12. एक स्वचालित सेल काउंटर में या मैन्युअल रूप से न्यूबॉयर चैंबर में ट्रिपैन ब्लू दाग समाधान (उदाहरण के लिए, नमूने के 10 माइक्रोन + ट्रिपैन ब्लू दाग समाधान के 10 माइक्रोन) के साथ 1: 1 कमजोर पड़ने के बाद व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
    13. प्रत्यक्ष 3 डी बोने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। प्रत्येक ट्यूमर जमा के लिए, एक 48 अच्छी तरह से प्रारूप थाली में बीज डिम्बग्रंथि के कैंसर माध्यम प्रति कम से कम 2-3 कुओं, जो एक बीज बोने मैट्रिक्स (OCM1, OCM1 + HER1ß, OCM2, OCM2 + HER1ß) में कुल 8-12 कुओं से मेल खाती है. बीएमई टाइप 2 मैट्रिक्स के 25 माइक्रोन की एक छोटी बूंद में प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 30,000 कोशिकाओं की गणना करें। वैकल्पिक रूप से, बीएमई 2 मैट्रिक्स के 50 माइक्रोन और प्रति अच्छी तरह से 50,000 वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के साथ 24-अच्छी तरह से प्रारूप चुनें।
    14. 2 डी में शेष कोशिकाओं बीज (2.1.13 कदम देखें).
    15. पिपेट बेसल संस्कृति माध्यम ++ निलंबन की मात्रा जिसमें 300 × ग्राम पर 5 मिन के लिए एक नई ट्यूब और अपकेंद्रित्र में आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या शामिल है। सतह पर तैरनेवाला निकालें और सेल गोली रखने के लिए.
    16. बर्फ पर, गोली के लिए ठंड बीएमई 2 मैट्रिक्स (48-अच्छी प्रारूप प्लेट में प्रत्येक कुएं के लिए 25 माइक्रोन; इसलिए, 4 कुओं के लिए 100 माइक्रोन) की कुल मात्रा जोड़ें और बुलबुले बनाने के बिना गोली को ऊपर और नीचे पाइप करके प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं का एक समान वितरण प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह मिलाएं।
    17. बीएमई 2 मैट्रिक्स (25 माइक्रोन) की बूंदों में कोशिकाओं को पूर्ववर्म, खाली 48-अच्छी प्लेट में बीज दें। कुओं के बीच भी वितरण को प्राप्त करने के लिए, धीरे से और धीरे-धीरे वितरण के दौरान सेल वर्षा को रोकने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से बीएमई 2 मैट्रिक्स छोटी बूंद को स्थानांतरित करने से पहले ट्यूब के अंदर विंदुक ऊपर और नीचे (3-4x) ले जाएं।
    18. बीएमई 2 मैट्रिक्स की बूंदों को मजबूत करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करने के बाद, चार डिम्बग्रंथि के कैंसर मीडिया (ओसीएम 1, ओसीएम 1 + एचईआर 1 , ओसीएम 2, ओसीएम 2 + एचईआर 1 ß) में से प्रत्येक के विंदुक 250 माइक्रोन इसी कुओं में।
    19. प्रत्यक्ष 3 डी बोने की प्रक्रिया के समानांतर, एक 2 डी संस्कृति शुरू करके शेष पृथक कोशिकाओं को संरक्षित करें।
      1. 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए centrifugation के बाद, 2 डी माध्यम में गोली जोड़ें. 75 डी सीडिंग के बाद उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या के आधार पर प्रारूप (टी 25 फ्लास्क या टी 3 फ्लास्क) का चयन करें।
      2. सेल आसंजन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 दिनों के लिए फ्लास्क को इनक्यूबेट करें। पहले 72 घंटे के लिए एक ही माध्यम रखें.
      3. जब कोशिकाएं संगम तक पहुंचती हैं, तो संस्कृति को बीएमई 2 मैट्रिक्स में स्थानांतरित करें। 2 डी संस्कृति में प्राथमिक आइसोलेट्स का विस्तार न करें क्योंकि 2 डी पर दीर्घकालिक प्रसार स्टेमनेस क्षमता के लिए हानिकारक है।
  2. 2D संस्कृति से 3D संस्कृति में स्थानांतरण
    1. T75 या T25 फ्लास्क में, नीचे की सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए पीबीएस के 5 एमएल के साथ मोनोलेयर 2x धो लें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्रिप्सिन के 1 एमएल के साथ सेते हैं।
    2. पृथक्करण अभिकर्मक की निष्क्रियता के लिए ठंड बेसल संस्कृति माध्यम ++ के 5 एमएल जोड़ें। 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    3. गोली के लिए बेसल संस्कृति माध्यम ++ के 3 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं की गणना चरणों 2.1.12-2.1.13 में वर्णित के रूप में करें. विभिन्न मीडिया रचनाओं के लिए बीज ( चित्र 1 देखें) जैसा कि चरण 2.1.16-2.1.18 में वर्णित है।
  3. ऑर्गेनॉइड विकास का मूल्यांकन
    1. ऑर्गेनॉइड विकास को दस्तावेज करने के लिए प्रति सप्ताह कम से कम एक बार कुओं की छवि बनाएं। चरण विपरीत माइक्रोस्कोप द्वारा 2 डी/3 डी संस्कृति और प्रत्यक्ष बोने प्लेटों की उच्च गुणवत्ता वाली तुलनीय छवियां बनाएं। आवर्धन में स्थिरता का ख्याल रखना और कुओं (मात्रा का ठहराव) और 10x और 20x के एक सिंहावलोकन के लिए 4x का उपयोग करने के लिए organoids की आकृति विज्ञान दस्तावेज.
    2. अलग-अलग लाइनों के लिए समर्पित फ़ोल्डर्स में चित्रों का भंडारण व्यवस्थित करें।
    3. विभिन्न बोने के तौर-तरीकों (2D के बाद 3D सीडिंग बनाम प्रत्यक्ष 3D सीडिंग) और विभिन्न मीडिया रचनाओं (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2, और OCM2+ HER1ß) पर ऑर्गेनॉइड गठन के तुलनात्मक मूल्यांकन द्वारा दीर्घकालिक खेती के लिए सर्वोत्तम ऑर्गेनॉइड लाइन का चयन करें।
      1. औसतन, अलगाव के 14-21 दिनों के बाद, ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता (मात्रा) के साथ-साथ विभिन्न परिस्थितियों में उगाए गए ऑर्गेनोइड के आकार और सेलुलर फेनोटाइप का मूल्यांकन करें। निम्नलिखित विशेषताओं की तलाश करें: रिक्तिकाएं की अनुपस्थिति, झिल्ली ब्लीबिंग या आसंजन का नुकसान, और कोशिकाओं का गोलाई होना।

3. दीर्घकालिक ऑर्गेनॉइड खेती

  1. ऑर्गेनॉइड पासिंग
    1. ऑर्गेनोइड को बहुत बार और प्रोलिफेरेटिव चरण के दौरान विभाजित करने से बचें। 10 दिनों से अधिक के अंतराल के साथ यांत्रिक और एंजाइमी पाचन प्रक्रियाओं का संचालन करें।
    2. प्रत्येक बीएमई 2 मैट्रिक्स छोटी बूंद को बाधित करने के लिए, बर्फ-ठंडा बेसल संस्कृति माध्यम ++ के 250 माइक्रोन (48-अच्छी तरह से प्रारूप) या 500 माइक्रोन (24-अच्छी तरह से प्रारूप) जोड़ें। छोटी बूंद और विंदुक का पूरा विघटन सुनिश्चित करें रुक-रुक कर ऊपर और नीचे और प्लेट के नीचे परिमार्जन. सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर रखें। बर्फ-ठंडा बेसल संस्कृति माध्यम ++ के 1 एमएल जोड़ें।
      नोट: बीएमई 2 मैट्रिक्स की हटाने की दक्षता मध्यम तापमान पर दृढ़ता से निर्भर करती है क्योंकि सबसे अच्छा विघटन 4 डिग्री सेल्सियस से नीचे प्राप्त किया जाता है।
    3. पूल 2-3 तकनीकी भी विस्तार के लिए कुओं को दोहराते हैं। 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। प्रकाश के स्रोत के खिलाफ निलंबन की सामग्री का निरीक्षण करने के लिए देखने के लिए अगर बीएमई 2 जेल अभी भी दिखाई दे रहा है. सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक बर्फ ठंडा माध्यम के साथ धोने दोहराना अगर बीएमई 2 मैट्रिक्स अभी भी दिखाई दे रहा है.
    4. 7-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में ट्रिप्सिन (20-25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के 1 एमएल के साथ सेते हैं। पृथक्करण को बढ़ाने के लिए 10 एस के लिए छिटपुट रूप से भंवर। समय-समय पर ट्यूब का निरीक्षण करें यह देखने के लिए कि क्या पृथक्करण प्रगति कर रहा है।
    5. 23 जी से 27 जी तक के आकार के साथ एक सुई के माध्यम से एक सिरिंज के साथ सेल निलंबन ऊपर और नीचे खींचो जांचें कि क्या बड़े सेल क्लंप अभी भी मौजूद हैं और यदि आवश्यक हो तो प्रक्रिया को दोहराएं।
      नोट: एक सिरिंज के माध्यम से विखंडन वैकल्पिक है, और सुई का आकार आवश्यक पृथक्करण प्रभावकारिता पर निर्भर करता है। एक सजातीय सेल निलंबन कुओं के बीच समान वितरण की ओर जाता है।
    6. प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करने के लिए ठंड बेसल संस्कृति माध्यम ++ के 1 एमएल जोड़ें।
    7. वैकल्पिक: कोशिकाओं के रूप में कदम 2.1.12-2.1.13 में वर्णित गणना और पैतृक मार्ग (जैसे, 1:3 कुओं) के विभाजन अनुपात तय.
    8. 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें.
    9. चरण 2.1.16-2.1.18 में वर्णित के रूप में बोने का संचालन करें और पहले से स्थापित दीर्घकालिक संस्कृति के अनुसार संबंधित इष्टतम डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनॉइड माध्यम को लागू करें। हर 3-4 दिनों में डिम्बग्रंथि के कैंसर के माध्यम को बदलें।
    10. मध्यम परिवर्तन के दौरान बीएमई 2 मैट्रिक्स छोटी बूंद के विघटन के मामले में, एंजाइमी पाचन के बिना फिर से बोने पर विचार करें। छोटी बूंद के व्यवधान से बचने के लिए, बीएमई 2 मैट्रिक्स छोटी बूंद पर सीधे पाइपिंग के बिना मध्यम परिवर्तन प्रक्रिया का सावधानीपूर्वक संचालन करें। इसके अतिरिक्त, चरण 2.1.16 पर बीएमई 2 मैट्रिक्स के साथ कमजोर पड़ने से पहले गोली पर अवशिष्ट बेसल संस्कृति माध्यम ++ की अत्यधिक मात्रा छोड़ने से बचें क्योंकि यह बूंदों की नाजुकता को प्रभावित कर सकता है।
  2. ऑर्गेनोइड का क्रायोप्रिजर्वेशन
    नोट: पारित होने के बाद पहले सप्ताह में प्रसार चरण के दौरान ऑर्गेनोइड के क्रायोप्रिजर्वेशन का संचालन करें।
    1. बीएमई 2 मैट्रिक्स छोटी बूंद को बर्फ-ठंडे बेसल संस्कृति माध्यम के साथ बाधित करें ++ चरण 3.1.2 के अनुसार। सेंट्रीफ्यूजेशन और चरण 3.1.3 में वर्णित सतह पर तैरनेवाला को त्यागने के बाद, बर्फ पर काम करें और बर्फ-ठंडे क्रायोप्रेज़र्वेशन माध्यम के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन को प्रीलेबल्ड 1.8 मिलीलीटर क्रायोजेनिक ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    2. ट्यूबों को पहले से ठंडा आइसोप्रोपिल अल्कोहल युक्त फ्रीजिंग कंटेनर में स्टोर करें और उन्हें रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. स्टॉक ट्यूबों को अधिकतम 2 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। लंबी अवधि के स्थिर भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरण।
  3. ऑर्गेनॉइड स्टॉक का विगलन
    1. बेसल संस्कृति माध्यम के 9 एमएल को प्रीवार्म करें ++ एक लेबल वाले 15 एमएल ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से वांछित स्टॉक शीशी या तरल नाइट्रोजन को तरल नाइट्रोजन से भरे परिवहन कंटेनर में स्थानांतरित करें।
    3. क्रायोट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में स्थानांतरित करें और धीरे-धीरे इसे तब तक हिलाएं जब तक कि ट्यूब की दीवारों के पास जमी हुई सामग्री पिघलना शुरू न हो जाए।
    4. ऑर्गेनॉइड निलंबन को धीरे-धीरे 9 एमएल माध्यम से भरी लेबल ट्यूब में वितरित करें। ट्यूब को धीरे से हिलाएं। 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    5. चरण 2.1.16-2.1.18 में वर्णित के रूप में बोने का संचालन करें और व्यक्तिगत लाइन के लिए पहले से निर्धारित दीर्घकालिक संस्कृति स्थितियों के अनुसार संबंधित इष्टतम डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनॉइड माध्यम को लागू करें।
  4. ऑर्गेनोइड का निर्धारण
    1. चरण 3.1.2-3.1.3 में वर्णित organoid संग्रह प्रदर्शन.
    2. पीबीएस (पीएच 7.4) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 3 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. पीबीएस के 5 एमएल के साथ 2x धोएं, 300 × ग्राम पर 3 मिन के लिए अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। गोली के लिए ताजा पीबीएस के 4 एमएल जोड़ें और एम्बेडिंग तक इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: फिक्स्ड ऑर्गेनोइड स्थिर हैं और एम्बेडिंग से पहले 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण संभव है।
    4. द्रवीभूत होने तक 65 डिग्री सेल्सियस पर हिस्टोलॉजिकल जेल (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) गरम करें।
    5. ट्यूब के तल पर बसे और दृश्यमान निश्चित ऑर्गेनोइड का पता लगाएं। सतह पर तैरनेवाला निकालें. एक बाधित सेल गोली के मामले में, 300 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन का संचालन करें और सतह पर तैरनेवाला पीबीएस को त्याग दें।
    6. धीरे ऊपर और नीचे pipeting द्वारा गर्म जेल के 100 माइक्रोन में गोली निलंबित. छोटी बूंद को सीलिंग फिल्म के एक टुकड़े में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर ~ 15 मिनट के बाद जमने की अनुमति दें।
    7. ऊतक पैराफिन कैसेट के लिए निश्चित जेल छोटी बूंद ले जाएँ. मानक ऊतक एम्बेडिंग प्रोटोकॉल19,20 का संचालन करें।
    8. एक microsectioning काटने के उपकरण के साथ 5-10 माइक्रोन मोटी स्लाइस कटौती. कटों को हिस्टोलॉजी स्लाइड पर स्थानांतरित करें। 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए स्लाइड सूखी; उन्हें सूखी जगह पर रखें।
  5. ऑर्गेनोइड वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना
    1. निम्नलिखित कमजोर पड़ने श्रृंखला के साथ ग्लास ट्रे के माध्यम से तैयार स्लाइड्स को स्थानांतरित करें: ऊतक विज्ञान के लिए 2 x 15 मिनट समाशोधन एजेंट; 15 मिनट 100% इथेनॉल; 1 मिनट 100% इथेनॉल; 10 मिनट 96% इथेनॉल; 5 मिनट 70% इथेनॉल; 5 मिनट 50% इथेनॉल।
    2. पीबीएस जोड़ें और 100 आरपीएम पर प्रकार के बकड़ी पर 5 मिनट रखें. धुलाई 2x दोहराएं।
    3. थर्मोस्टेबल कक्ष में रखी गई स्लाइड्स में एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान (ट्रिस (हाइड्रॉक्सीमेथाइल) एमिनोमेथेन-एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) -बफर [पीएच 9.0] या साइट्रेट [पीएच 6.0]) जोड़ें। एक स्टीमर में, कंटेनर को स्लाइड के साथ 30 मिनट के लिए रखें, इसके बाद कमरे के तापमान तक ठंडा हो जाए।
    4. 3.5.2 कदम दोहराएँ.
    5. 15 मिनट के लिए स्लाइड युक्त कक्ष को 1% पारगम्यता डिटर्जेंट समाधान (पीबीएस में) में स्थानांतरित करें।
    6. 3.5.2 कदम दोहराएँ.
    7. निम्नलिखित चरणों के दौरान छोटी बूंद को बनाए रखने के लिए एक इम्यूनोस्टेनिंग मोम पेन के साथ स्लाइड पर ऑर्गेनोइड के स्थान को समोच्च करें।
    8. द्वितीयक एंटीबॉडी की प्रजातियों के आधार पर, एक कमजोर पड़ने वाले माध्यम में 10% सीरम के प्रत्येक स्लाइड 100 माइक्रोन पर जोड़ें।
    9. 3.5.2 कदम दोहराएँ.
    10. एक माध्यम में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला, 100 माइक्रोन की एक अंतिम मात्रा के लिए अग्रणी. एक इनक्यूबेशन ट्रे / आर्द्रता कक्ष में कम से कम 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें.
    11. 3.5.2 कदम दोहराएँ.
    12. एक माध्यम में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें, जिससे 100 माइक्रोन बूंदें हो जाती हैं, और एक इनक्यूबेशन ट्रे में कमरे के तापमान पर 2 घंटे तक रखें।
    13. 3.5.2 कदम दोहराएँ.
    14. परमाणु काउंटरस्टेन समाधान डीएपीआई (4', 6-डायमिडिन-2-फेनिलिंडोल, डायहाइड्रोक्लोराइड) एक कमजोर पड़ने वाले माध्यम 1: 1,000 में पतला जोड़ें। इनक्यूबेशन के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए रखें.
    15. 3.5.2 कदम दोहराएँ.
    16. बढ़ते माध्यम जोड़ें और कवरस्लिप के साथ कवर करें। एक बार सूखी पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ स्लाइड सुरक्षित (लगभग 8-12 घंटे के बाद).
    17. एक फोकल माइक्रोस्कोप या अन्य प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ छवि। अवलोकन चित्रों के साथ-साथ उपकोशिकीय संरचनाओं की विस्तृत छवियां बनाएं जो ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान की मुख्य विशेषताओं को पकड़ती हैं।

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Representative Results

प्रारंभिक ऊतक पृथक्करण, निस्पंदन और गिनती के बाद, कोशिकाओं को सीधे 3 डी प्रारूप में समानांतर में वरीयता दी जाती है, जैसा कि ऊपर बताया गया है, साथ ही संक्षिप्त 2 डी विस्तार के लिए फ्लास्क में निलंबन भी है। कुछ मामलों में, क्षणिक 2 डी विस्तार ऑर्गेनॉइड गठन को सकारात्मक रूप से प्रभावित करता है, और दीर्घकालिक रेखा इस मार्ग के माध्यम से सफलतापूर्वक स्थापित की जाती है, जबकि तुलनात्मक समानांतर 3 डी सीडिंग के परिणामस्वरूप विकास गिरफ्तारी(चित्रा 1)हो सकती है। संसाधित होने वाले प्रत्येक दाता ऊतक के लिए, कोशिकाओं को मीडिया मैट्रिक्स के अनुसार परीक्षण किया जाता है। इस रणनीति के बाद, हमारे बायोबैंक में अब प्रत्येक मानक विकास स्थिति के प्रतिनिधि रेखाएं शामिल हैं जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। विभिन्न मीडिया और सीडिंग के तरीकों के परीक्षण के इस मिनी स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म के कड़े कार्यान्वयन से, हमने विभिन्न हिस्टोलॉजिकल प्रकारों और प्राथमिक उच्च ग्रेड सीरस के डिम्बग्रंथि के कैंसर (चित्रा 3) के रोग विकास के चरणों से ऑर्गेनॉइड लाइनों को सफलतापूर्वक उत्पन्न किया है, पोस्ट नियोएडजुवेंट अंतराल सर्जरी और आवर्तक बीमारी से। माता-पिता के ऊतकों की तुलना में मुख्य मार्करों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा ऑर्गेनॉइड लाइनों का फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन आश्वस्त रूप से दर्शाता है कि उपकला ट्यूमर डिब्बे के हॉलमार्क ऑर्गेनॉइड मॉडल में संरक्षित हैं: उपकला वास्तुकला और आसंजन (ईपीसीएएम), वंश पहचान (पीएएक्स 8), और एचजीएसओसी की विशिष्ट टीपी 53 बिंदु उत्परिवर्तन विशेषता नाभिक (चित्रा 4) में संचय के लिए अग्रणी।

ऑर्गेनॉइड बायोबैंकिंग के दौरान कुशल निर्णय लेने के लिए कुछ महत्वपूर्ण पद्धतिगत बिंदुओं पर भी विचार किया जाना चाहिए। ऑर्गेनॉइड विकास क्षमता न केवल ऑर्गेनॉइड व्यास में वृद्धि से निर्धारित होती है। इसके अतिरिक्त, फेनोटाइपिक विशेषताएं रंग, अंधेरे और समोच्च अखंडता जैसे विस्तार क्षमता निर्धारित करती हैं। साइटोप्लाज्मिक तनाव रिक्तिकाएं का गठन उप-इष्टतम स्थितियों को इंगित करता है। विकास और ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता के संबंध में प्रारंभिक मुद्दे अनुचित परिवहन स्थितियों और ऊतक जुलूस की देरी के कारण हो सकते हैं। चूंकि ट्यूमर लाइनों के भीतर विस्तार क्षमता में एक उच्च अंतर-वैयक्तिक परिवर्तनशीलता देखी जाती है, इसलिए हम विकास क्षमता के बारे में अंतिम निर्णय लेने से कम से कम 14 दिन पहले प्रतीक्षा करने की सलाह देते हैं। यदि समान विकास पैटर्न शुरू में विभिन्न मीडिया में देखे जाते हैं, तो कई स्थितियों का विस्तार किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव से, दीर्घकालिक स्थिर विकास क्षमता का स्पष्ट अंतर अक्सर कई हफ्तों या महीनों की खेती के बाद ही संभव होता है।

Figure 1
चित्रा 1: बाद के ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए प्राथमिक आइसोलेट्स के 2 डी में संक्षिप्त बीजारोपण के लाभ। (ए) दो-तरफा, समानांतर बीजारोपण रणनीति दिखाने वाले प्रयोगात्मक लेआउट की योजना: 2 डी / (बी)ट्रिप्सिनाइजेशन और 3 डी ट्रांसफर से पहले पालन करने वाले प्राथमिक आइसोलेट्स की छवि। (सी) प्राथमिक जमा का एक उदाहरण जहां समानांतर बीजारोपण ने 2 डी/3 डी मार्ग के स्पष्ट लाभ का खुलासा किया क्योंकि दीर्घकालिक ऑर्गेनॉइड विस्तार केवल उन पूर्वजों से संभव था जो शुरू में प्लास्टिक पर अलग थे। ऊपरी बाईं छवि नीचे बाईं तस्वीर पर पहले मार्ग (पी 1 के रूप में संदर्भित) के बाद अपर्याप्त ऑर्गेनॉइड बनाने के साथ मार्ग 0 (पी 0 के रूप में संदर्भित) पर अलगाव के 7 दिन बाद एक 3 डी संस्कृति दिखाती है। प्लास्टिक पर 2 डी बोने के बाद ( चित्रा 1 बी देखें) एक 3 डी संस्कृति में स्थानांतरण के बाद, एक बेहतर ऑर्गेनॉइड बनाने पी 0 पर पहले से ही स्पष्ट है, जबकि दीर्घकालिक विस्तार क्षमता की पुष्टि 4 (पी 4) पर की जाती है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: रोगी-विशिष्ट मध्यम आवश्यकता। चार अलग-अलग दीर्घकालिक स्थिर विस्तारित लाइनों के उदाहरण प्रत्येक एक अलग माध्यम में बढ़ रहे हैं। स्केल बार = 500 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: ओसीएम = डिम्बग्रंथि के कैंसर का माध्यम; उसे = हेरेगुलिन 1β; HGSO = उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रोग के सभी चरणों से ऑर्गेनॉइड पीढ़ी। प्राथमिक रोग प्रस्तुति में उच्च ग्रेड सीरस और निम्न-ग्रेड सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर से, अंतराल सर्जरी (पोस्ट नियोएडजुवेंट कीमोथेरेपी) से, और आवर्तक कैंसर ऊतक से दीर्घकालिक स्थिर विस्तार लाइनों की छवियां। स्केल बार = 500 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: HGSOC = उच्च ग्रेड सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर; LGSOC = निम्न-श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर; NACT = नियोएडजुवेंट कीमोथेरेपी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ऑर्गेनोइड और माता-पिता के कैंसर ऊतक के फेनोटाइप का करीबी मैच। (ए) कैंसर ऊतक और (बी) युग्मित ऑर्गेनॉइड लाइन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने की कॉन्फोकल छवियां धुंधला पैटर्न और सभी मार्करों, ईपीसीएएम (हरा), पीएएक्स 8 (लाल), टीपी 53 (मैजेंटा) की अभिव्यक्ति के स्तर में बहुत अधिक समानता दिखाती हैं। स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त मीडिया और पाचन मिश्रण की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

डिज़ाइन किया गया प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड गठन और दीर्घकालिक मार्ग क्षमता के संबंध में डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनॉइड बायोबैंकिंग की पिछली चुनौतियों को संबोधित करता है और ठोस ट्यूमर जमा के बहुमत से पूरी तरह से विस्तार योग्य लाइनों की पीढ़ी सुनिश्चित करता है। ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्यूमर के नमूनों की सर्जिकल संग्रह प्रक्रिया उपज और विस्तार क्षमता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती है। ट्यूमर ऊतक के नमूने विभिन्न प्रक्रियाओं के दौरान प्राप्त किए जा सकते हैं, जिसमें मल्टी-विसरल सर्जरी, डायग्नोस्टिक लैप्रोस्कोपी या बायोप्सी शामिल हैं। अनुभवी स्त्री रोग संबंधी सर्जन को पेरिटोनियल स्थानों से स्वच्छ ट्यूमर के नमूने प्राप्त करने को प्राथमिकता देनी चाहिए। विशेष रूप से, यह देखा गया है कि बड़े ट्यूमर जमा के भीतर मैक्रोस्कोपिक रूप से नेक्रोटिक क्षेत्र ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की सफल पीढ़ी के लिए कम उपयुक्त हैं। चूंकि नमूना शुद्धता डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आणविक और फेनोटाइपिकल विशेषताओं को प्रतिबिंबित करने के लिए महत्वपूर्ण है, इष्टतम बायोबैंकिंग के लिए नैदानिक और प्रयोगशाला टीमों दोनों के सिंक्रनाइज़ प्रयासों की आवश्यकता होती है, यह सुनिश्चित करना कि लाइनें ट्यूमर के सबसे प्रासंगिक क्षेत्रों से बनाई गई हैं।

हालांकि यह प्रोटोकॉल विकास कारक निर्भरताओं में भिन्नता को कवर करता है जिसे हमने बायोबैंकिंग के 2 वर्षों के दौरान देखा है, यह स्पष्ट है कि प्रभावकारिता को और बढ़ाने के लिए अतिरिक्त शोधन की आवश्यकता है क्योंकि हमने अभी भी 20% मामलों में किसी भी ऑर्गेनॉइड वृद्धि का निरीक्षण नहीं किया है और सीमित विस्तार क्षमता का प्रदर्शन करने वाली लाइनों की संख्या ने स्टेमनेस के उप-इष्टतम रखरखाव का सुझाव दिया है। यद्यपि हमारे ऑर्गेनॉइड बायोबैंक में वर्तमान में सीरस हिस्टोलॉजी (एचजीएसओसी और एलजीएसओसी) के केवल डिम्बग्रंथि के कैंसर के नमूने शामिल हैं, संरचित बायोबैंकिंग कार्यक्रम से पहले विभिन्न उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर हिस्टोलॉजी के नमूनों के साथ हमारे अनुभव ने विशिष्ट मतभेदों के बिना तुलनीय सफलता दर का प्रदर्शन किया। विशेष रूप से, अधिकांश उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर उपप्रकार ऊतकों के साथ एक समान स्तंभ छद्म स्तरीकृत आकृति विज्ञान साझा करते हैं जो मुलेरियन पथ (फैलोपियन ट्यूब, गर्भाशय, गर्भाशय ग्रीवा) से विकसित होते हैं, जबकि इसके विपरीत, डिम्बग्रंथि उपकला स्वयं जननांग रिज और मेसोनेफ्रोस से विकासात्मक रूप से उत्पन्न होती है, जो क्यूबाइडल एपिथेलियम की एक परत के साथ कवर किया जाता है। चूंकि उपकला होमियोस्टेसिस को विनियमित करने वाले विकासात्मक मार्गों की वयस्क स्टेम सेल क्षमता के नियंत्रण में एक केंद्रीय भूमिका होती है, इसलिए ऑर्गेनोइड के जैव-बैंकिंग के लिए प्रोटोकॉल विकसित करते समय भ्रूण की उत्पत्ति में अंतर को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस प्रकार, हम मानते हैं कि अंडाशय की सतह से पूर्वजों को दीर्घकालिक स्थिर विकास को बनाए रखने के लिए अंग-विशिष्ट संस्कृति स्थितियों की आवश्यकता होती है।

विशेष रूप से, हमारी प्रयोगशाला में, प्रोटोकॉल पोस्ट-नियोएडजुवेंट डिम्बग्रंथि के कैंसर के नमूनों के लिए भी सफल साबित हुआ है, हालांकि नियोएडजुवेंट कीमोथेरेपी सेल व्यवहार्यता और ऊतक फेनोटाइप को प्रभावित करती है। ये नमूने प्राथमिक डिबलिंग सर्जरी के कीमोथेरेपी-भोले ऊतक से प्राप्त नमूनों की तुलना में अधिक मलबे और बाह्य ऊतक समुच्चय प्रदर्शित करते हैं जो ऑर्गेनॉइड गठन क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं। इन मामलों में, हमने अनुभव किया कि सर्जिकल ऊतक की एक उचित मात्रा और अनुशंसित परिवहन स्थितियों का सख्त पालन सफल ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि पोस्ट-नियोएडजुवेंट नमूने अधिक संवेदनशील हो सकते हैं।

बाद के ऑर्गेनॉइड विकास पर ताजा पृथक पूर्वजों के 2 डी में प्लास्टिक पर संक्षिप्त विस्तार के लाभकारी प्रभाव की एक बहुत ही दिलचस्प घटना, जिसे हमने बार-बार देखा है और इसलिए मानकीकृत प्रयोगात्मक प्रक्रिया में शामिल किया गया है, कैंसर ऑर्गेनोइड अनुसंधान क्षेत्र की पद्धति के लिए एक महत्वपूर्ण अतिरिक्त है, जो काफी हद तक प्रत्यक्ष बीजारोपण रणनीतियों पर निर्भर करता है। यह अनुमान लगाने के लिए मोहक है कि एंजाइमी पाचन के बाद पूर्वजों की संवेदनशीलता और विकास कारकों की क्षमता उन्हें पर्याप्त रूप से प्रधान करने के लिए इस अंतर के पीछे अंतर्निहित तंत्र हो सकती है, जो कुछ मामलों में एक निर्णायक कारक है यदि रेखा स्थापित की जा सकती है। हालांकि, स्पष्ट निर्भरता स्थापित करने के लिए अधिक शोध की आवश्यकता है।

3 डी डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड में उच्च सेल आसंजन और कार्यात्मक जंक्शनों द्वारा उत्पन्न चुनौतियों को पूरा करने में, जो पचाने में मुश्किल होते हैं, सुई और सिरिंज के साथ यांत्रिक और एंजाइमेटिक पृथक्करण का संयोजन मदद कर सकता है जब ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद बड़े गुच्छे रहते हैं। विभिन्न एंजाइमेटिक स्थितियों के साथ प्रयोग करने से और सुधार हो सकता है।

लंबे समय तक भंडारण के बाद, ऑर्गेनॉइड लाइनों को पिघलाया जा सकता है और प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार संस्कृति में लाया जा सकता है और बाद के अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है। यह विशिष्ट अनुसंधान उद्देश्यों के लिए पहले से ही उत्पन्न ऑर्गेनोइड लाइनों तक किसी भी समय पहुंच को सक्षम बनाता है और रोगी की बीमारी की प्रगति के प्रकाश में कुछ लाइनों के दीर्घकालिक व्यवहार की जांच के लिए विशेष रूप से दिलचस्प है। हालांकि, डिम्बग्रंथि के कैंसर के अंगों का क्रायोप्रिजर्वेशन एक चुनौती बनी हुई है। ठंड और विगलन चक्रों के दौरान तापमान भिन्नताएं ऑर्गेनॉइड व्यवहार्यता, कार्यक्षमता और विस्तार क्षमता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती हैं। तरल नाइट्रोजन में दीर्घकालिक भंडारण अधिक स्थिर होता है, जहां बहुत कम तापमान गिरावट के जोखिम को कम करता है ताकि ऑर्गेनोइड की अखंडता को बनाए रखा जा सके। हालांकि, इन प्रक्रियाओं को और बेहतर बनाने के लिए ठंड, भंडारण और विगलन के लिए सुसंगत प्रक्रियाओं को स्थापित करने के लिए चल रहे अनुकूलन की आवश्यकता है।

उल्लिखित बकाया मुद्दों के बावजूद, यह प्रोटोकॉल डिम्बग्रंथि के कैंसर वाले रोगियों के ठोस ट्यूमर के नमूनों से लगातार स्थिर ऑर्गेनॉइड लाइनें उत्पन्न करने की क्षमता प्रदर्शित करता है। हमारी प्रयोगशाला में, हमने लगभग 50% मामलों में सफलता प्राप्त करने वाले 120 प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर ऊतक के नमूनों को संसाधित किया, जिसमें हिस्टोलॉजिकल उपप्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला और प्राथमिक डिबल्किंग, आवर्तक बीमारी और पोस्टनियोएडजुवेंट सर्जिकल नमूनों के साथ रोग के चरण शामिल हैं। विभिन्न रोगी नमूनों से व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड की पीढ़ी के लिए एक संरचित ढांचा प्रदान करके, विभिन्न मीडिया में समानांतर बीजारोपण, और विभिन्न बीजारोपण रणनीतियों के कार्यान्वयन, यह प्रोटोकॉल स्टेम क्षमता में व्यक्तिगत मतभेदों का आकलन करने का अवसर प्रदान करता है, इस प्रकार ट्यूमर जीव विज्ञान के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। हमारे ज्ञान के लिए, अधिकांश अध्ययन आमतौर पर नमूनों की एक छोटी संख्या पर मध्यम घटकों का परीक्षण करने और सादगी के लिए चुनने के रिवर्स दृष्टिकोण का पालन करते हैं। HER1ß के प्रभाव का हमारा व्यवस्थित परीक्षण, RSPO1 और FGF10 पूरकता का प्रभाव, और 2D/3D सीडिंग निर्णायक रूप से प्रदर्शित करता है कि डिम्बग्रंथि के कैंसर के ऊतकों में स्टेमनेस गुणों में अंतर-रोगी परिवर्तनशीलता की डिग्री होती है, और इष्टतम माध्यम वास्तव में रोगी-विशिष्ट होता है। इसलिए, विभिन्न बहिर्जात पैराक्राइन सिग्नलिंग वातावरण प्रदान करने वाली विभिन्न मीडिया रचनाओं का व्यवस्थित समानांतर परीक्षण आवश्यक है।

विभिन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर रोगियों से प्राप्त ऑर्गेनोइड के एक व्यापक पैनल के साथ एक जीवित बायोबैंक की स्थापना उनके संभावित रूप से एकत्र नैदानिक जानकारी के साथ, अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक मूल्यवान संसाधन के रूप में कार्य करता है और विषम नैदानिक परिदृश्य को दर्शाता है जो संभावित रूप से एक बड़ी रोगी आबादी17 पर लागू होता है. दीर्घकालिक खेती और क्रायोप्रिजर्वेशन प्रयोगात्मक स्थिरता और समय के साथ एक ही ऑर्गेनॉइड लाइन की बार-बार पहुंच को सक्षम करते हैं, जो अनछुए ट्यूमर-लाइन सेलुलर गुणों के साथ अनुदैर्ध्य प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए आधार के रूप में कार्य करते हैं।

उपकला वास्तुकला और ध्रुवीकरण को बनाए रखने से, ऑर्गेनॉइड लाइनें सेल-सेल संचार और संदर्भ-निर्भर सेल भाग्य निर्णय लेने का अध्ययन करने के लिए एक पर्याप्त मॉडल हैं, जो पैराक्राइन सिग्नलिंग मार्गों द्वारा मध्यस्थता की जाती हैं। हिस्टोलॉजिकल जेल में ऑर्गेनोइड का एम्बेडिंग सामग्री पोस्ट-निर्धारण के नुकसान से बचने के लिए एक व्यावहारिक और कुशल मध्यवर्ती कदम है और यह सुनिश्चित करता है कि डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग (पैराफिन और सेक्शनिंग में एम्बेडिंग) ऊतक के नमूनों के समानांतर में किया जा सकता है। निर्धारण प्रक्रिया के दौरान ऑर्गेनोइड का नुकसान एक महत्वपूर्ण मुद्दा है जब ऑर्गेनोइड की संख्या बहुत सीमित होती है। हालांकि, इस नुकसान को ठंड बेसल संस्कृति माध्यम में धोने और निर्धारण से पहले 24-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट के कम से कम दो पूर्ण विकसित कुओं को पूल करके बाह्य मैट्रिक्स से ऑर्गेनोइड को अच्छी तरह से हटाकर प्रतिकार किया जा सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल माता-पिता के ट्यूमर ऊतक के साथ डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड के आणविक और फेनोटाइपिकल विशेषताओं के अनुरूप उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल इमेजिंग की अनुमति देता है, लेकिन रासायनिक यौगिकों या आनुवंशिक रूप से संशोधित लाइनों के लक्षण वर्णन के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण भी है। विधि किसी भी विशिष्ट संशोधनों के बिना ऊतक विज्ञान धुंधला के लिए भी उपयुक्त है। अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर, एक माइक्रोटोम (2-3 माइक्रोन) के साथ काटे गए पतले वर्गों पर विचार किया जाना चाहिए।

महत्वपूर्ण बात, स्थिर दीर्घकालिक संस्कृति जीन संपादन प्रयोगों और दवा प्रतिक्रिया और उपन्यास और मानक चिकित्सा17,21 के प्रतिरोध के बारे में कार्यात्मक assays के लिए एक शर्त है. विशेष रूप से, रोग की प्रगति और पुनरावृत्ति के दौरान किए जाने वाले पुन: बायोप्सी से उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स, थेरेपी-भोले मूल ट्यूमर और रिलैप्स के दौरान देखी गई नई अधिग्रहीत विशेषताओं के बीच प्रत्यक्ष तुलनात्मक विश्लेषण की संभावना प्रदान करते हैं। रोगी-विशिष्ट उपचार प्रतिक्रियाओं की पहचान और इन विट्रो में चिकित्सा प्रतिरोध का गठन डिम्बग्रंथि के कैंसर अनुसंधान21 में सटीक दवा के क्षेत्र को आगे बढ़ाता है।

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Disclosures

एमके को डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड के लिए एक माध्यम से संबंधित पेटेंट पर एक आविष्कारक के रूप में सूचीबद्ध किया गया है। एफटी को एस्ट्राजेनेका, क्लोविस, ईसाई, इम्यूनोजेन, मेडैक, एमएसडी, फार्मामार, रोश, सागा डायग्नोस्टिक्स और टेसारो / जीएसके से अनुसंधान धन, सलाहकार बोर्ड, मानदेय और यात्रा व्यय प्राप्त हुआ। एसएम को अनुसंधान निधि, सलाहकार बोर्ड, मानद या यात्रा व्यय प्राप्त हुआ: एबवी, एस्ट्राजेनेका, क्लोविस, ईसाई, ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन, हुब्रो, मेडैक, एमएसडी, नोवार्टिस, नायकोड, ओलंपस, फार्मामार, फाइजर, रोश, सेंसर किनेसिस, टेवा, टेसारो।

Acknowledgments

अध्ययन जर्मन कैंसर रिसर्च सेंटर DKTK, पार्टनर साइट म्यूनिख, DKFZ और यूनिवर्सिटी अस्पताल LMU म्यूनिख के बीच एक साझेदारी द्वारा वित्त पोषित है। अध्ययन जर्मन कैंसर सहायता अनुदान (#70113426 और #70113433) द्वारा भी समर्थित है। ऊतक और ऑर्गेनोइड के पैराफिन एम्बेडिंग को एनाटॉमी संस्थान, चिकित्सा संकाय, एलएमयू म्यूनिख, म्यूनिख की कोर सुविधा में किया गया है। बायोमेडिकल सेंटर (बीएमसी) में कोर सुविधा बायोइमेजिंग में कंफोकल इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया है। लेखक तकनीकी सहायता के लिए सिमोन हॉफमैन, मारिया फिशर, कॉर्नेलिया हर्बस्ट, सबाइन फिंक और मार्टिना रहमेह को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 Sterican 26 G Braun, Melsungen, Germany 4657683
100 Sterican 27 G Braun, Melsungen, Germany 4657705
293T HA Rspo1-Fc R&D systems, Minneapolis, USA 3710-001-01 Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) Merck, Darmstadt, Germany 616454
Advanced DMEM/F-12 Medium  Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 12634028
Anti-p53 antibody (DO1) Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-126
Anti-PAX8 antibody Proteintech, Manchester, UK  10336-1-AP
B-27 Supplement (50x) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm Corning, Berlin, Germany  430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria 661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria 690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria 658175
Collagenase I Thermo Scientific, Waltham, USA 17018029
Costar 48-well Clear TC-treated  Corning, Berlin, Germany  3548
Cryo SFM PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany C-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear R&D systems, Minneapolis, USA 3533-005-02 Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG Jackson Immuno 715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany C9999-1000ML
DAPI Thermo Scientific, Waltham, USA 62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 Thermo Scientific, Waltham, USA A32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 Thermo Scientific, Waltham, USA A32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline  Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel Thermo Scientific, Waltham, USA Epredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene  Corning, Berlin, Germany  351447
Feather scalpel  Pfm medical, Cologne, Germany 200130010
Fetal Bovine Serum Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 10270106
Formalin 37% acid free, stabilized Morphisto, Offenbach am Main, Germany 1019205000
GlutaMAX Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 35050038
HEPES (1 M) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 156630080
Human EpCAM/TROP-1 Antibody R&D systems, Minneapolis, USA AF960
Human FGF10 Peprotech, NJ, USA 100-26
Human recombinant BMP2 Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA PHC7146
Human recombinant EGF Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA PHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1 Peprotech, NJ, USA 100-03
LAS X core Software Leica Microsystems https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope Leica Microsystems
N-2 Supplement (100x) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 17502-048
Nicotinamide Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany N0636
Omnifix 1 mL Braun, Melsungen, Germany 3570519
Paraffin
Parafilm Omnilab, Munich, Germany 5170002
Paraformaldehyd  Morphisto, Offenbach am Main, Germany 1176201000
Pen Strep Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany P4333-100
PluriStrainer 400 µm PluriSelect, Leipzig, Germany 43-50400-01
Primocin InvivoGen, Toulouse, France ant-pm-05
Red Blood Cell Lysing Buffer Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany 11814389001
Roticlear Carl Roth, Karlsruhe, Germany A538.5
Surgipath Paraplast Leica, Wetzlar, Germany 39602012
Thermo Scientific Nunc Cryovials Thermo Scientific, Waltham, USA 375418PK
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany T8787
Trypan Blue Stain Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany T8154
TrypLE Express Enzyme  Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 12604-013
Tween-20 PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany A4974-0100
Y-27632 TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany 1254
Zeocin Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA R25001

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References

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डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड के बायोबैंकिंग के लिए रणनीति: हिस्टोलॉजिकल उपप्रकारों और रोग चरणों में इंटरपेशेंट विषमता को संबोधित करना
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Trillsch, F., Reichenbach, J.,… More

Trillsch, F., Reichenbach, J., Czogalla, B., Kraus, F., Burges, A., Mahner, S., Kessler, M. Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages. J. Vis. Exp. (204), e66467, doi:10.3791/66467 (2024).

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